适用于治疗脊柱疾病、异常或病症的组合物

摘要

本发明涉及病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)的用途，所述冷沉淀浓缩液包含合适比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原，适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，例如椎间盘退变。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液的用途，该冷沉淀浓缩液包含初始相对浓度的纤维蛋白原和纤粘蛋白，适用于治疗脊柱疾病、失调或病症，例如脊柱组织，如椎间盘退变。

发明背景

椎间盘位于脊柱中的相邻椎体之间。各椎间盘形成可使椎骨轻微移动的软骨关节，充当将椎骨连接在一起的韧带，并承受由体重和肌肉张力引起的压缩负荷。

软骨是一种坚韧、有弹性的结缔组织，由生成大量细胞外基质(ECM)的特化细胞组成，这种细胞称为软骨细胞。软骨可提供保护性缓冲，并且使关节能够承受由进行日常活动所需的运动产生的负荷。人体包含三种不同类型的软骨：覆盖关节面的关节软骨、存在于膝关节半月板和椎间盘的纤维软骨以及存在于外耳的弹性软骨。不同的软骨通过其结构、弹性和强度来区分。

Aota等人(“Differential effects of fibronectin fragment onproteoglycan metabolism by intervertebral disc cells：a comparison witharticular chondrocytes”.Spine.2005；30：722-728)(纤粘蛋白片段对椎间盘细胞蛋白聚糖代谢的不同影响：与关节软骨细胞的比较，《脊柱》杂志，2005年，第30期第722-728页)报道了纤粘蛋白片段对不同种群的椎间盘和关节软骨细胞中增殖和蛋白聚糖代谢的不同影响。这些结果表明来源于不同软骨组织的软骨细胞需要在不同的条件下增殖和维持组织功能。

椎间盘由三种基本结构组成：称为髓核(NP)的内部胶状物质、称为纤维环(AF)的坚韧纤维外围带以及标志椎间盘与椎骨之间过渡区的上下软骨终板。这些结构的差异表现在蛋白聚糖和胶原在组织中的排列以及各自的相对浓度。

胚胎发育过程中可以分化出三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层。这三个胚层最终分别形成内脏器官、肌肉骨骼组织以及表皮与神经组织。称为脊索的第四区诱导神经管和脊柱，包括椎间盘的胚胎发育。间充质细胞开始迁移并集聚到脊索周围以形成骨质椎体和纤维环。被包裹的脊索细胞对于促进髓核的发育至关重要(Walmsley R.“Thedevelopment and growth of the intervertebral disc”.Edinburgh Med J.1953；60：341-364)(Walmsley R，椎间盘的发育和生长，《Edinburgh医学》杂志，1953年第60期第341-364页)。因此，纤维环和髓核这两种椎间盘基本结构来自分别称为间充质和脊索的不同胚胎源。

纤维环主要由I型胶原纤维组成，其形成围绕髓核的同心板层，并插入相邻椎体的终板以形成增强结构。

髓核主要包含较小的软骨样细胞以及第二群较大的高度空泡化细胞，这些空泡化细胞称为脊索细胞，据推测，它们是诱导脊柱和髓核形成的残留胚胎组织(Hunter et al，“The notochordal cell in the nucleuspulposus：a review in the context of tissue engineering”.Tissue Eng.2003；9：667-677)(Hunter等人，组织工程背景下有关髓核中脊索细胞的综述，《组织工程》杂志，2003年第9期第667-677页)。由于这些脊索细胞似乎对脊柱和髓核的形成起着至关重要的作用，据此推测它们可以促进受损椎间盘和脊柱的修复。软骨样细胞表达II型胶原、聚集蛋白聚糖以及透明质酸长链，后者的分子包含高度亲水的分支侧链。这些带负电的区域具有较强的水分子亲和性，并且在渗透膨胀压力下使椎间盘髓核或中心水化。纤维环内所含的水化髓核的水力效应发挥减震器的作用，使脊柱免受施加于肌肉骨骼系统的外力的冲击。

椎骨终板同时连接到椎间盘和相邻的椎体。这些终板的化学结构由蛋白聚糖和胶原纤维组成。

人椎间盘退变是一个临床问题，是脊柱疼痛和功能障碍的主要原因。全世界超过一千五百万人患有椎间盘退变，这种疾病通常以基质组成发生变化以及细胞数量减少为特征。

退变性椎间盘疾病(DDD)是一种椎间盘丧失其柔韧性、弹性和减震性的不良过程。在此过程中，纤维环的胶原结构强度减弱并变脆。过度压迫强度减弱的椎间盘会引起纤维环撕裂，从而使髓核从撕裂处脱出或突出，这种病症称为椎间盘突出。突出物会压迫椎间盘周围的神经并引起疼痛。椎间盘突出会干扰神经功能，从而导致虚弱、麻木、炎症和疼痛。另外，蛋白聚糖的含量也发生下降，从而降低髓核的持水能力。这些变化减弱了椎间盘作为减震器的能力，并使其柔韧性下降。流体的损耗还使得椎间盘变小，使椎骨和椎间盘之间的距离变窄。

由于椎间盘处于无血管环境，因此使用椎间盘组织工程来减缓或逆转退变过程会因其修复能力有限而面临严峻的生物学挑战。细胞活性需要葡萄糖、氧气及其他支持组织必需的营养物质。然而，椎间盘是人体中最大的无血管组织。营养物质通过椎骨终板多孔中央凹陷扩散至椎间盘中，而使椎间盘内的细胞得到营养支持(Rudert M and Tillmann B.“Lymph and blood supply of the human intervertebral disc.Cadaver studyof correlations to discitis”.Acta Orthop Scand.1993；64：37-40)(Rudert M和Tillmann B，人椎间盘的淋巴和血液供应：与椎间盘炎相关的解剖学研究，Scandinavia矫形学报，1993年，第64期第37-40页)。

椎间盘退变或血肿可引起脊髓压迫和脊柱损伤。脊髓损伤(SCI)通常始于使椎管内神经受损的脊柱创伤。损伤的常见原因有创伤(车祸、中枪、摔倒等)或疾病(如脊髓灰质炎、脊柱裂、弗里德赖希共济失调等)以及椎间盘突出引起的脊柱压缩。脊髓神经损伤导致运动神经、感觉神经和自主神经功能丧失或减弱。原发性冲击伤后出现的继发性损伤包括一系列导致组织坏死和细胞死亡的生化和细胞变化。据估计，在美国SCI的年发病率大约为每百万人40例，每年在治疗SCI患者上的花费接近40亿美元。迄今为止，在治疗SCI及相关神经损伤方面所取得的进展甚少。当前只有一种被接受但未获批准的疗法，那就是使用甲泼尼龙。如果在损伤后8小时内使用极高剂量的甲泼尼龙，其表现出对脊髓损伤后神经功能适度的改善能力。

在处于发育过程的脊椎动物神经系统中，神经管是中枢神经系统(CNS)的前体，而中枢神经系统包括脑和脊髓。脊髓包含称为轴突的通信纤维，其在脑和外周之间传递感觉和运动信息。以横切面观察，脊髓被背侧中线和腹侧中线分为对称的两半。神经管的背侧主要与感觉相关，而腹侧部分则主要与运动(例如肌肉)控制相关。术语运动神经元通常适用于位于CNS中的神经元，其将轴突伸出CNS外并直接或间接控制肌肉。该术语与传出神经元同义。脊髓损伤具有极其严重影响，它会导致损伤节段以下的感觉或运动功能丧失。CNS损伤后，运动神经元不能再生长出其轴突，并会因坏死或细胞凋亡而死亡。已公布的研究表明通过在背部神经管附近，相对于正常脊索位置180度，移植并表达第二脊索，可在背部神经管中诱导形成运动神经元，而背部神经管一般形成感觉细胞。损伤的CNS是高度抑制轴突再生的环境，会严重限制损伤后功能的恢复。

纤维蛋白胶通常是得自商业来源或某些地区输血中心的血液制品。纤维蛋白胶制备中通常用到的组分有纤维蛋白原、凝血酶、因子VIII、因子XIII、纤粘蛋白、玻连蛋白和血管性血友病因子(vWF)。纤维蛋白胶制剂在外科手术中使用时，既可作为进行缝合从而得到最佳伤口结合的添加物用于止血，又可用于预防或治疗粘连。一些制造商将抗蛋白溶解剂添加到纤维蛋白胶制剂(如WO-A-93/05822中所述)中或特异性去除血纤维蛋白溶酶原以使纤维蛋白溶解延迟或停止(如US-B-5,792,835和US-B-7,125,569中所述)。

通常，从血浆冷沉淀物制备是生产纤维蛋白粘合剂的纤维蛋白原的第一步。Bar等人(“The binding of fibrin sealant to collagen is influencedby the method of purification and the cross-linked fibrinogen-fibronectin(heteronectin)content of the‘fibrinogen’component”.Blood CoagulFibrinolysis.2005；16：111-117)(纤维蛋白粘合剂与胶原的结合受纯化方法和“纤维蛋白原”组分中交联纤维蛋白原-纤粘蛋白(异粘蛋白)含量的影响，《凝血与纤溶》杂志，2005年，第16期第111-117页)报道了由冷沉淀制备的纤维蛋白凝胶制剂，其差别在于纤粘蛋白和异粘蛋白(纤维蛋白原与纤粘蛋白共价键连的复合物)的含量不同。该报道指出制剂中异粘蛋白的含量会影响基于纤维蛋白的粘合剂与胶原的粘合。一方面，Schwartz等人(US-B-4,377,572)通过纯化步骤去除了大部分交联的纤维蛋白原-纤粘蛋白分子，继而使制剂中纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率低至1/14.7，以及使所形成的纤维蛋白具有较弱的胶原和明胶结合特性。另一方面，Martinowitz和Bal(EP-B-691,858)所述的冷沉淀制剂保留了这些交联的纤维蛋白原-纤粘蛋白分子，从而使纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率增至1/7，这导致：与Schwartz纯化法进行制备所形成的纤维蛋白与胶原的粘结性相比，所生成的纤维蛋白与胶原的粘结性增加。

以下出版物公开了不同的纤维蛋白胶制剂在脊柱疾病中的用途。据报道，三维纤维蛋白基质可用作体外细胞底物以及用作中枢神经系统修复的桥接材料。Ju等人(“Enhanced neurite growth from mammalianneurons in three-dimensional salmon fibrin gels.Biomaterials”.2007；28：2097-2108)(来自哺乳动物神经元的神经突的生长在三维鲑鱼纤维蛋白凝胶中得到增强，《生物材料》杂志，2007年，第28期第2097-2108页)报道了与用人或牛血蛋白制备的纤维蛋白相比，鲑鱼纤维蛋白凝胶是CNS损伤后神经元再生的理想支架。Cheng等人(“Spinal cord repair inadult paraplegic rats：partial restoration of hind limb function”.Science.1996；273：510-513)(成年截瘫大鼠的脊髓修复：部分恢复后肢功能，《科学》杂志，1996年，第273期第510-513页)描述了使用周围神经移植物对成年大鼠中脊髓缺损进行修复。移植区使用包含酸性成纤维细胞生长因子的纤维蛋白胶进行稳定。

美国专利申请US-A-2004/0121011描述了促进受损神经元细胞修复和再生的一种方法。该专利申请指出神经损伤位点可以位于中枢神经系统或周围神经系统中。其中的制剂结合了Rho拮抗剂和能够在体内形成可接受的基质，例如组织粘合剂的流动性载体组分。US-A-2004/0121011公开了不同的基于蛋白的组织粘合剂，其包括胶原凝胶、纤维蛋白组织粘合剂、基质胶、层粘连蛋白网络以及基于一种包含胶原的基底膜蛋白组合物的粘合剂。其公开了多种商业制剂，例如P和

以下出版物公开了纤维蛋白胶组合物在椎间盘中的用途。

US-A-2005/0148512涉及将纤维化试剂或包含纤维化试剂的组合物注入受损的椎间盘中，以促进愈合并支持椎间盘纤维环。包含纤维蛋白原的制剂，如在可被递送到椎间盘的多种组合物中述及。

US-B-6,428,576描述了一种采用原位固化密封剂修复纤维环缺损的方法。该专利公开了一种能固化成粘弹性材料的制剂，粘弹性材料可模拟纤维环的结构、物理特性和生物力学功能。该固化聚合物可以是合成的或天然存在的。该专利公开了合成的聚合物更可靠。该专利还公开了若干种天然存在的蛋白质，例如白蛋白、胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白以及弹性蛋白。这些蛋白可以得自任何来源，例如，从血液中分离的蛋白或重组蛋白，包括加工蛋白、变性蛋白或以其他方式改性的蛋白。

WO-A-07/089942公开了一种治疗椎间盘疾病的方法，其包括将纤维蛋白密封剂注入椎间盘以密封纤维环的至少一处缺损，同时监测正在注射的纤维蛋白密封剂的压力。该纤维蛋白密封剂包含纤维蛋白原和活化化合物，例如凝血酶。根据其具体实施方式，缺损可以是纤维环中的或脊柱关节纤维包膜中的撕裂或裂隙。其具体实施方式公开了可在人体中形成纤维蛋白的任何纤维蛋白原的用途。纤粘蛋白作为纤维蛋白原组合物的多种可能添加剂之一而被提及。

WO-A-06/050268公开了将纤维蛋白密封剂注入纤维环撕裂处或裂隙处。该密封剂包含纤维蛋白原和活化化合物，例如凝血酶。根据该专利申请，纤维蛋白原组分可以是自体同源、包括混合人纤维蛋白原的人来源、重组来源以及牛或其他非人类来源。纤粘蛋白在作为可用于纤维蛋白密封剂的额外添加剂的多种组分中述及。

另外，WO-A-06/050267公开了将纤维蛋白密封剂和麻醉剂注入脊柱区，以密封纤维环中的缺损，例如撕裂或裂隙。根据其具体实施方式，纤维蛋白原组分包括可以在人体内形成纤维蛋白的任何纤维蛋白原。该专利申请提及了得自如Baxter制造商的商品试剂盒，例如WO-A-06/050267的具体实施方式公开了替代量的纤维蛋白原可用来改变混合组分的密度。

WO-A-07/089948涉及一种治疗椎间盘疾病的方法，其中髓核正渗入和/或渗透纤维环的至少一处缺损。该方法包括采用多腔导管将生物密封剂，例如纤维蛋白原溶液和活化溶液注射到脊柱区。其具体实施方式还涉及一种试剂盒，其包含生物密封剂以及将纤维蛋白密封剂注入人椎间盘的生物密封器械。

US-B-6,468,527描述了包含生物或非生物试剂的双组分纤维蛋白密封剂。该组合物提供了将特定试剂递送到人体内特定的关键部位并提供延长的缓释治疗价值的一种方法。该专利具体描述了将纤维蛋白胶与皮质类固醇一起注入腰部硬膜外腔和盘内间隙。纤维蛋白密封剂具有维持皮质类固醇长期抗炎反应以及密封纤维环裂隙的作用。如果不密封纤维环裂隙，会导致破坏性化学物质从椎间盘间隙选出并浸没神经根，从而导致化学性神经根炎。另外，US-B-7,235,255公开了一种用于递送生物组织粘合剂的体系，其中粘合剂包含纤维蛋白原组分、凝血酶组分以及包含皮质类固醇的溶液。根据其具体实施方式，纤维蛋白密封剂可以用来治疗椎间盘退变疾病和椎间盘功能不全。示例了盘内注射。该递送体系可密封、保护裸露的神经根免受进一步的化学性损伤，并且充当使皮质类固醇保持长期沉积在神经根上的载体。

以下出版物报道了将组织工程作为一种可能的生物学方法，其目的在于联合使用细胞、适用的生物化学和生理化学因子以及任选用作支架的多孔结构来替换、修复、维持和/或增强组织功能。WO-A-04/093934公开了通过将干细胞材料注入椎间盘来填充和/或修复椎间盘的一种方法。干细胞材料在生物相容性晶格材料中提供。优选的晶格材料为脂源晶格，例如蛋白聚糖、糖蛋白、玻尿酸、纤粘蛋白、胶原(I型、II型、III型、IV型、V型、VI型等)等等。根据WO-A-04/093934的具体实施方式，脂源晶格可用作细胞生长的出色底物。仅示例了基于胶原的晶格材料。

WO-A-00/47621公开了一种用于制备病毒灭活冷沉淀物的方法，该冷沉淀物包含优选的从0.02至0.5的纤维蛋白原与纤粘蛋白比率，其例如可用来制备适于任何人细胞生长的、基于纤维蛋白的生物基质，同时还提及了角质形成细胞、成纤维细胞和软骨细胞。在一个优选的实施例中，使用了抗纤维蛋白溶解剂t-AMCHA(即氨甲环酸)，该试剂表现出有利于降低组合物的粘度。

美国专利申请US-A-06/0275273描述了将软骨细胞植入或注入退变椎间盘的一种方法。该专利公开了取自尸体的软骨细胞。根据其具体实施方式，软骨细胞可得自软骨组织，包括椎间盘软骨、或源于非椎间盘组织的软骨组织的软骨。其具体实施方式公开了添加到细胞组合物中的若干种生物相容性分子，例如层粘连蛋白、脱乙酰壳多糖、水凝胶、聚乙二醇化水凝胶、I型胶原、II型胶原、III型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、凝血酶、纤粘蛋白以及透明质酸。该发明公开了商品制剂纤维蛋白胶在细胞中的用途。这些例子也公开了冷沉淀猪纤维蛋白原和软骨细胞-凝血酶溶液的用途。

美国专利申请US-A-07/0093905公开了一种用于椎间盘修复和再生的混合物，其包含甘氨酸、浓缩单核细胞和纤维蛋白胶。该专利还公开了用于再插入椎间盘的切除并经处理的髓核或纤维环组织。再插入的椎间盘细胞可任选地与载体结合，载体例如为凝胶样载体或粘合剂。凝胶样载体可以是生物或合成水凝胶、透明质酸、胶原凝胶、基于蚌类的粘合剂、纤维蛋白胶、纤维蛋白凝块、血液、血块、血液组分、血液组分凝块等等。该专利申请并未提及所公开载体的具体组合，也未提及冷沉淀浓缩液。

EP-A-1,894,581公开了一种用作软骨修复植入物的包含软骨细胞或祖细胞的基质凝胶。根据其具体实施方式，凝胶基质提供了一种简单稀释原代软骨细胞的方法，从而使细胞外基质材料的产量增加。在一个优选的实施例中，软骨细胞从关节软骨分离而来。纤维蛋白胶在多种可用的基质凝胶材料中述及。该专利申请并未提及基质凝胶材料的具体组合，也未提及凝胶组分之间的具体相对浓度。

单层生长的椎间盘细胞呈成纤维细胞样表型。然而，在三维环境中，椎间盘细胞会变成圆形，形成集落，并且表现出更强的增殖和蛋白聚糖合成。已开发出多种体外培养技术，包括复合三维凝胶和可降解的聚合物支架，目的在于提供椎间盘细胞可在其上增殖的支持框架。已使用透明质酸、胶原、脱乙酰壳多糖和纤维蛋白凝胶来制备收集细胞的可交联聚合物。

尽管以上所有技术都报道了纤维蛋白胶在IVD中的用途，但Gruber等人(“Cell-based tissue engineering for the intervertebral disc：in vitrostudies of human disc cell gene expression and matrix production withinselected cell carriers”.Spine J.2004；4：44-55)(基于细胞的椎间盘组织工程：人椎间盘细胞基因表达以及所选细胞载体内基质生成的体外研究，《脊柱》杂志，2004年，第4期第44-55页)也指出纤维蛋白凝胶制剂是纤维环细胞增殖、ECM生成和基因表达的劣等微环境。术语“细胞外基质”，缩写为“ECM”，是指由哺乳动物组织内的细胞所生成的复合结构材料。细胞外基质通常为结缔组织，例如软骨细胞的定义特征。体内ECM通常为细胞提供结构支持。

有必要获得适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，例如椎间盘退变的最佳纤维蛋白组合物。

发明内容

纤维蛋白胶已为人所熟知，并广泛应用于各种临床环境。这些纤维蛋白胶在外科手术中使用时，既可作为进行缝合从而得到最佳伤口结合的添加物用于止血，又可用于预防或治疗粘连。目前，有关纤维蛋白胶在重建椎间盘、密封纤维环裂隙以及恢复中枢神经系统方面的用途的文献已有所公布。

根据本发明发现，增加涂布平板中纤维蛋白原的浓度显著降低了椎间盘髓核细胞对平板的贴壁能力，而增加纤粘蛋白/纤维蛋白原浓度的比率会得到相反的结果。另一方面，由于选择性去除了纤维蛋白原并包含高浓度纤粘蛋白的纤维蛋白胶组合物，例如冷沉淀物，不会固化，因此不能形成细胞的三维支撑支架。本发明解决了这一技术难题，并提供了适用于椎间盘的包含纤粘蛋白和纤维蛋白原最适浓度的冷沉淀物。

根据本发明发现，纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率对于髓核细胞贴壁、增殖和迁移至关重要，并完全取决于纤粘蛋白相对于纤维蛋白原的高含量。例如，根据本发明发现，与在包含较低比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原的混合物中培养的细胞相比，在包含比率增至约1/10-1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原的混合物中培养的髓核细胞表现出细胞贴壁和增殖能力更强。另外，本文发现包含增加比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原的冷沉淀物，当注入髓核区时，能够恢复椎间盘高度。因此，所含纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率高于1/12并在1/10-1/5范围内，例如1/7的冷沉淀物可用作恢复椎间盘高度的基质的优势组分，同时作为髓核细胞的最适支架。

研究表明，脊索细胞可以诱导髓核和CNS细胞的形成和/或可用作这些细胞的祖细胞。因此，根据本发明的冷沉淀物可以用来帮助椎间盘和中枢神经系统(CNS)的重建。

氨甲环酸是一种合成的纤维蛋白溶解抑制剂，已表明其可以影响中枢神经系统(CNS)，引起兴奋过度和惊厥，这可能是由于其为γ-氨基丁酸(GABA)的拮抗剂(Furtmüller et al.“Tranexamic acid，a widely usedantifibrinolytic agent，causes convulsions by a gamma-aminobutyric acid(A)receptor antagonistic effect”.J Pharmacol Exp Ther.2002；301：168-173；Roger et al.“Evaluating the differences between fibrin sealants：recommendations from an international advisory panel of hospitalpharmacists”.The European Journal of Hospital Pharmacy Science Volume12，2006，Issue 1，P.3-9)(Furtmüller等人，广泛使用的抗纤维蛋白溶解剂氨甲环酸通过γ-氨基丁酸(A)受体拮抗作用引起惊厥，《药理学与实验治疗》杂志，2002年，第301期第168-173页；Roger等人，评价纤维蛋白粘合剂之间的差异：医院药剂师国际顾问团的推荐，《欧洲医院药学》杂志，第12卷，2006年，第1期第3-9页)。

另外，已表明牛抑肽酶是一种高度致免疫的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可引起一种非常罕见且不可治愈的退行性神经病变，称为Creutzfeldt-Jakob病(CJD)，会造成脑部和脊髓海绵样变性。从而，根据本发明的方法，本发明的冷沉淀浓缩也不包含氨甲环酸和牛抑肽酶类物质，以用于脊柱。

因此，现有公开领域既未公开也未建议用于脊柱的由下述冷沉淀制剂制备的最适纤维蛋白胶，所述冷沉淀制剂包含合适的纤维蛋白原和纤粘蛋白比率并且不含氨甲环酸和/或牛源抑肽酶。

在一方面，本发明涉及病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)的用途，其任选地与包含脊索来源细胞的细胞组合物联合使用，其中冷沉淀物包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原，适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，条件是该冷沉淀浓缩液不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，VIPCC包含比率为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的另一个实施例中，VIPCC为活化的。

在本发明的另一个实施例中，VIPCC包含造影剂。造影剂可以为碘。

在本发明的另一个实施例中，将VIPCC用来治疗椎间盘疾病、异常或病症。

在本发明的一个实施例中，将VIPCC用来至少部分恢复受损IVD的高度。

在本发明的另一个实施例中，将VIPCC用来预防椎间盘突出。

在本发明的另一个实施例中，该疾病为椎间盘退变疾病的早期。

在本发明的另一个实施例中，活化的VIPCC用作在椎间盘退变疾病晚期重建髓核细胞的支架。

在本发明的另一个实施例中，活化的VIPCC用作重建受损或断裂脊髓的支架。

在另一方面，本发明涉及一种试剂盒的用途，所述试剂盒包括：第一容器，其包含病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)，该冷沉淀浓缩液包含比率高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原；以及第二容器，其包含在与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的酶，该试剂盒适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，条件是试剂盒不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，所述VIPCC包含比率为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的另一个实施例中，将所述试剂盒用来治疗椎间盘疾病、异常或病症。该试剂盒还包含造影剂，例如碘。

在另一方面，本发明涉及一种支架的用途，所述支架包含病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)，该冷沉淀浓缩液包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原，适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，条件是冷沉淀浓缩液和支架不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，所述VIPCC包含比率为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的另一个实施例中，将所述支架用来治疗椎间盘疾病、异常或病症。

在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，所述试剂盒包括：第一容器，其包含病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)，该冷沉淀浓缩液包含比率高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原；第二容器，其包含在当与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的酶；以及第三容器，其包含选自丝氨酸肽酶、半胱氨酸肽酶、天冬氨酸肽酶、金属肽酶、透明质酸酶以及它们的组合的蛋白水解酶。

在本发明的另一个实施例中，蛋白水解酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、胶原酶、明胶酶、链霉蛋白酶、软骨素酶、透明质酸酶以及它们的组合。所述试剂盒还可以包含造影剂，例如碘。

本发明的另一目的是提供一种适用于将细胞组合物递送到受损脊柱组织中的载体，所述载体包含病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)，该冷沉淀浓缩液包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原，和脊索来源细胞，条件是冷沉淀浓缩液不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的另一个实施例中，所述VIPCC包含初始相对浓度为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的另一个实施例中，所述受损脊柱组织为椎间盘。在本发明的另一个实施例中，所述脊索来源细胞为髓核细胞。

本发明的另一方面涉及一种组织或细胞库，其包含组合物中的脊索来源细胞，所述组合物包含病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)，该冷沉淀浓缩液包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的一个实施例中，所述VIPCC包含比率为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的另一个实施例中，所述细胞为髓核细胞。

本发明的另一目的涉及病毒灭活血浆活化冷沉淀浓缩液的用途，其中所述冷沉淀物包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原，适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，条件是冷沉淀浓缩液不含牛抑肽酶。

冷沉淀物可以包含初始相对浓度为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的一个实施例中，将所述冷沉淀物用来治疗椎间盘疾病、异常或病症。

可根据本发明得到的试剂盒、来源于组织或细胞库的细胞和/或载体，可用来治疗脊柱疾病、异常或病症，例如脊柱组织，如椎间盘退变。

在本发明的另一方面，将病毒灭活血浆活化冷沉淀浓缩液用来增加或至少部分地恢复椎间盘高度。该冷沉淀浓缩液包含初始相对浓度为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原，并且不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，所述冷沉淀物包含初始相对浓度为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在另一方面，本发明涉及一种有利于脊索来源细胞生长、增殖、分化、维持、修复和/或恢复的方法，其包括将所述细胞的细胞群与包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原的病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)接触，条件是该冷沉淀浓缩液不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，所述VIPCC包含比率为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

在本发明的另一个实施例中，所述细胞为髓核细胞。在本发明的另一个实施例中，所述VIPCC为活化的。

在本发明的另一个实施例中，所述接触在体外进行。在本发明的另一个实施例中，所述接触在体内进行。

本发明的一个目的是提供一种治疗脊柱疾病、异常或病症，例如脊柱组织，如椎间盘退变的方法，其包括将病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)施用到有需要的受试者的脊柱，可任选地结合包含脊索来源细胞的细胞组合物，其中所述冷沉淀物包含初始相对浓度高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原，条件是该冷沉淀浓缩液不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，所述VIPCC为活化的。

在本发明的另一个实施例中，结合包含脊索来源细胞的细胞组合物施用VIPCC。在本发明的另一个实施例中，所述细胞为髓核细胞。

在本发明的另一个实施例中，在施用VIPCC与细胞前，将所有或部分髓核组织切除。

在本发明的另一个实施例中，在施用细胞前，将细胞在体外培养于VIPCC上，该VIPCC包含比率为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

本发明的另一个目的是提供一种治疗脊柱疾病、异常或病症，例如脊柱组织，如椎间盘退变的方法，其包括将根据本发明的试剂盒、来自组织或细胞库的细胞和/或载体施用于有需要的受试者。

附图说明

参照以下具体实施方式、实例、权利要求以及附图，本发明的特征、方面和优点将变得更易理解。

图1示出了凝血酶、病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)及其组分对纤维环细胞贴壁和增殖的影响。在97mm的塑料培养皿周围涂布VIPCC、凝血酶、白蛋白以及纤维蛋白原。然后，将纤维环细胞悬液接种到培养皿中央(原点)。14天后，通过苏木素与伊红染色，确定VIPCC、凝血酶、白蛋白以及纤维蛋白原对细胞贴壁的影响。

图2示出了胰蛋白酶消化过程和/或传代对纤维环细胞贴壁和增殖的影响。将解离的纤维环细胞接种到97mm塑料培养皿的中央，其中在培养皿周围涂布了VIPCC、纤维蛋白原、纤粘蛋白以及纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物(1∶10)。9天后，通过苏木素与伊红染色，评估细胞贴壁能力。

图3A-3B示出了髓核(A)和纤维环(B)细胞在不同涂层上的贴壁能力。所得结果以在相同实验中纤粘蛋白涂层的贴壁细胞(100％)的倍数表示。Fn表示纤粘蛋白；Fgn表示纤维蛋白原。

图4示出了在不同涂层上培养1天和5天时代谢活跃的髓核细胞的水平。结果以相对于纤粘蛋白涂层中吸光度(100％)的百分比表示。VIPCC表示病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液；Fn表示纤粘蛋白；Fgn表示纤维蛋白原。

图5示出了在涂层基质中以恒定量的纤粘蛋白和增加量的纤维蛋白原培养时(A)，以及在涂层基质中以恒定量的纤维蛋白原和增加量的纤粘蛋白培养时(B)，代谢活跃的髓核细胞的水平。

图6A-6D示出了纤维环软骨细胞(上图)和髓核软骨细胞(下图)的形态和功能，其中软骨细胞分别处于使用VIPCC制备的连接(A，C)和分离(B，D)三维支架中。

图7示出了髓核细胞在活化的VIPCC中的迁移。

图8示出了对照样本(A，生理盐水)与活化的VIPCC(B，使用VIPCC和凝血酶制备)注射进椎间盘的荧光自显影图。

图9示出了在图8所述的注射程序后14天时分离的腰椎。

图10示出了如图8中所述的注射了生理盐水(A)和活化的VIPCC(B)的脱钙椎间盘(IVD)。

图11示出了如图8中所述的注射了生理盐水(A)和活化的VIPCC(B)的IVD的髓核区组织学研究。

图12示出了如图8中所述的注射了对照样本(A)和活化的VIPCC(B)的IVD的髓核中心区。

图13示出了在注射了对照样本(A)和活化的VIPCC(B)的IVD的周边区域中的髓核细胞群。

图14示出了在分离的椎间盘内设置在三维支架中的髓核软骨细胞的形态及硫酸软骨素的生成，该三维支架由稀释20倍的VIPCC和凝血酶混合物形成。在注射程序后1小时和3天(分别为A和B)时使用倒置荧光显微镜进行组织学评价。N表示细胞核；CS表示硫酸软骨素。

硫酸软骨素在细胞膜上的生成较为明显(箭头所示)。

图15示出了在对未处理的椎间盘、清空的椎间盘以及重新填充的椎间盘(PBS，或VIPCC和凝血酶)增加外力负荷的情况下，椎间盘的压缩百分比。

图16示出了注射了活化的VIPCC或PBS的椎间盘的高度恢复情况。结果基于图15中所示的测量值(500N下进行压缩)。结果以在相同实验中未处理的椎间盘在500N负荷下最大压缩可能值(100％)的百分比表示。

具体实施方式

本发明涉及病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)的用途，所述冷沉淀浓缩液包含合适比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原，适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，例如椎间盘(IVD)退变。

令人惊讶的是，根据本发明发现纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率对于髓核细胞贴壁、增殖和迁移至关重要。根据本发明揭示了，髓核(NP)上的冷沉淀物的导引特性完全取决于纤粘蛋白相对于纤维蛋白原的最适比率。

术语“冷沉淀物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当冷冻血浆在低温下，通常在0-4℃下解冻，并且例如通过离心收集沉淀物时，就可以获得冷沉淀物。通常，形成富含纤维蛋白原、因子VIII、von Willebrand因子、因子XIII以及纤粘蛋白的冷沉淀物。冷沉淀物组分可由自体血浆、包括混合血浆的人血浆、或非人类来源的血浆制备。

根据本发明所得的结果表明，增加涂布平板中纤维蛋白原的浓度显著降低了髓核细胞对平板的贴壁能力，而增加平板中纤粘蛋白的浓度会得到相反的结果。然而，选择性去除了纤维蛋白原并包含高浓度的纤粘蛋白的冷沉淀物不会固化，因此如果没有纤维蛋白原，就不能形成支持三维组织形成的支架。

更具体地讲，根据本发明发现了，与具有较低纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的混合物相比，比率在1/10至1/5的经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物更适于髓核细胞的贴壁和增殖。令人惊讶的是，与纤维环相反，据发现髓核细胞在涂布有纤维蛋白原的平板中贴壁能力会受纤维蛋白原浓度增加的影响。事实上，随着纤维蛋白原浓度增加，髓核细胞的贴壁能力按照剂量依赖方式明显下降。相比之下，增大纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率会得到相反的结果。这些结果表明了纤粘蛋白/纤维蛋白原比率对髓核细胞贴壁起着关键的作用，并且证明了使用高的纤粘蛋白/纤维蛋白原比率培养髓核细胞的优点。所得结果表明，与包含高和相近的纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的、经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物相比，髓核细胞在VIPCC上的贴壁能力更强。值得注意的是，纤维环软骨细胞在这两种涂层上的细胞贴壁能力是相似的。

与包含经纯化的纤粘蛋白和纤维蛋白原混合物的涂层相比，髓核和纤维环细胞在VIPCC涂层上的细胞增殖能力更强。然而，与纤维环软骨细胞相比，髓核软骨细胞的增殖更易受到不同涂层的影响。还监测了髓核细胞在包含高纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的VIPCC涂层上以及在经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物上的活力。结果表明，高纤粘蛋白/纤维蛋白原比率能够缓和仅含纤维蛋白原的涂层中观察到的细胞活力下降。使用VIPCC涂层对于髓核细胞的这一积极影响尤其明显。这些结果示出了使用包含高纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的VIPCC，而不是较纯的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物作为培养髓核细胞的涂层的优点。据发现，髓核软骨细胞可感测各种VIPCC稀释比例的趋化梯度，并且在存在此VIPCC浓度梯度的情况下会发生迁移。因此，包含高纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的VIPCC制剂可具有软骨导引特性。

总之，根据本发明的结果显示，根据本发明的VIPCC包含的纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率高于1/12、或为约1/11至约1/5、或为约1/10至约1/5、或为约1/10至约1/7、或为约1/7时，适于与髓核细胞一起使用。因此，本发明的活化VIPCC可以用作髓核细胞体外生长的支架，或可以将其注入椎间盘间隙以用作髓核细胞体内生长的支架。

根据本发明发现了，将VIPCC和凝血酶注入动物模型的椎间盘中并未改变IVD的结构，并且保持了IVD中软骨细胞组织的典型结构。另外，还显示了活化的VIPCC可以发挥基本上恢复椎间盘正常高度的作用，并且该恢复的椎间盘能够像天然髓核组织一样抵抗压缩负荷。

此外，证明了当与根据本发明的活化的VIPCC联合注射时，注射进IVD的髓核软骨细胞的形态和功能可以维持。

因此，包含高于1/12、或为约1/11至约1/5、或为约1/10至约1/5、或为约1/10至约1/7、或为约1/7的纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)，可有利地用于实现髓核组织细胞的贴壁、增殖和迁移。结果还显示，在根据本发明的活化VIPCC中培养的髓核细胞可维持其形态和硫酸软骨素的合成。由于髓核细胞来源于脊索区和/或由脊索区诱导形成，因此这些结果就为受损的由脊索细胞诱导形成的脊柱的治疗新方法铺平了道路，受损的脊柱例如为髓核和源于中枢神经系统的运动神经元。因此，相对于不含纤粘蛋白或包含低纤粘蛋白/纤维蛋白原比率的冷沉淀物，包含最适比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原的冷沉淀物更适合在脊柱中应用。

人IVD髓核组织细胞主要为较小的软骨样细胞，但还存在第二群较大的细胞：脊索细胞，据推测，脊索细胞是诱导神经管和髓核胚胎发育形成的残留胚胎组织(Hunter等人，2003年)。一些研究表明存在于髓核组织中的脊索细胞可以诱导髓核和CNS细胞的形成。因此，髓核组织可以用来帮助椎间盘和CNS的重建。

在一个方面，本发明涉及一种有利于脊索来源细胞，例如髓核细胞生长、增殖、分化、维持、修复和/或恢复的方法，所述方法包括将所述细胞的细胞群与病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)接触，该浓缩液包含初始相对浓度高于1/12、或为约1/11至约1/5、或为约1/10至约1/7、或为约1/7的纤粘蛋白/纤维蛋白原。在本发明的一个实施例中，纤粘蛋白/纤维蛋白原的初始相对浓度为约1/10至约1/5。

术语“脊索来源细胞”是指其形成由脊索区诱导的细胞。换句话讲，脊索来源细胞是指脊柱髓核细胞和脊柱神经细胞(即CNS细胞)。

氨甲环酸是一种合成的纤维蛋白溶解抑制剂，已表明其可以影响中枢神经系统(CNS)，引起兴奋过度和惊厥，这可能是由于其为γ-氨基丁酸(GABA)的拮抗剂(Furtmüller et al.“Tranexamic acid，a widely usedantifibrinolytic agent，causes convulsions by a gamma-aminobutyric acid(A)receptor antagonistic effect”.J Pharmacol Exp Ther.2002；301：168-173；Roger et al.“Evaluating the differences between fibrin sealants：recommendations from an international advisory panel of hospitalpharmacists”.The European Journal of Hospital Pharmacy Science Volume12，2006，Issue 1，P.3-9)(Furtmüller等人，广泛使用的抗纤维蛋白溶解剂氨甲环酸通过γ-氨基丁酸(A)受体拮抗作用引起惊厥，《药理学与实验治疗学》杂志，2002年，第301期第168-173页；Roger等人，评价纤维蛋白粘合剂之间的差异：医院药剂师国际顾问团的推荐，《欧洲医院药学》杂志，第12卷，2006年，第1期第3-9页)。

另外，已表明牛抑肽酶是一种高度致免疫的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可引起一种非常罕见且不可治愈的退行性神经病变，称为Creutzfeldt-Jakob病(CJD)，会造成脑部和脊髓海绵样变性。

因此，根据本发明的方法，冷沉淀浓缩液不包含氨甲环酸和/或牛抑肽酶类物质，以用于脊柱。降低了血纤维蛋白溶酶原和血纤维蛋白溶酶含量的VIPCC使得这些物质的使用不再必要。在本发明的一个实施例中，VIPCC中血纤维蛋白溶酶原和血纤维蛋白溶酶被降至等于或小于15μg/ml，例如5μg/ml。

根据本发明的血浆冷沉淀物可以是活化的或非活化的。术语“活化的VIPCC”是指与一种能使纤维蛋白原形成纤维蛋白的活化组分组合后的冷沉淀组合物。该组合的混合物可产生三维结构。活化组分可以是凝血酶和/或可得自蛇毒的溶液。本发明的VIPCC与细胞接触可以在体外进行，包括与或不与其他类型细胞一起进行体外细胞培养，或在体内受损部位进行。

本发明所公开的领域既未公开也未建议这样的冷沉淀制剂的用途：所述冷沉淀制剂具有优选的纤维蛋白原和纤粘蛋白比率，而不含氨甲环酸和牛源抑肽酶，适用于在脊柱中应用。

在一个方面，本发明涉及一种治疗和/或预防脊柱疾病、异常或病症，例如椎间盘退变的方法，其包括将病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)注入有需要的受试者的脊柱，该冷沉淀浓缩液包含比率高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原初始，条件是不含氨甲环酸和牛抑肽酶。根据本发明的VIPCC组合物可以与包含脊索来源细胞，例如髓核细胞的细胞组合物联合注射。

在本发明的一个实施例中，VIPCC包含初始相对浓度为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。根据本发明，所述VIPCC可以为活化的或非活化的。

如本文所述，术语“初始”是指冷沉淀浓缩液制备结束时的可变比率。

在另一方面，本发明提供一种可用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病、异常或病症的方法，其包括将病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)注入有需要的受试者的损伤或受损部位，该冷沉淀浓缩液包含比率高于1/12或为约1/11至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。在另一个实施例中，本发明可用于治疗CNS或脊髓损伤，并促进受试者的CNS恢复和轴突生长。

术语“脊柱疾病、异常或病症”是指椎间盘和/或中枢神经系统疾病、异常或病症。

术语“椎间盘疾病、异常或病症”是指涉及椎间盘退变和/或损伤的多种异常、疾病或病症，例如椎间盘突出、椎间盘裂隙、脊柱狭窄、黑椎间盘、椎间盘疼痛等等。

通常，术语“椎间盘疾病、异常或病症”以与术语“退变性椎间盘疾病(DDD)”同义使用。

根据“改进的达拉斯CT椎间盘造影”命名系统，存在六种描述放射状纤维环撕裂严重程度的可能类别(0-5级)(Sachs et al.“Dallasdiscogram description.A new classification of CT/discography in low-backdisorders”.Spine.1987；12：287-294)(Sachs等人，达拉斯CT椎间盘造影评价系统：一种在腰部疾病中进行CT/椎间盘造影术的新分类方法，《脊柱》杂志，1987年，第12期第287-294页)。0级表示正常的椎间盘，其中无造影剂渗出髓核，而5级撕裂表示椎间盘外层完全破裂并且造影剂正渗出椎间盘的一类撕裂。

椎间盘营养不足，例如当来自相邻椎骨的血液供应受损时，会加速椎间盘退变。这可能是由髓核脱水引起，从而导致胶原纤维降解。这样脱水的椎间盘可以通过MRI扫描观察到，由于在MRI上出现颜色变化，故也称为“黑椎间盘”。最终，椎间盘可能丧失其减震能力。椎间盘间隙将变窄，丧失其减震能力，并且在该节段处的运动会出现异常。这就将过大的压力转移到脊柱中的相邻结构，从而导致压迫神经根，出现称为脊柱狭窄的疼痛病症(http://www.saspine.org/conditions/ddd disease.htm)。

对脊柱疾病、异常或病症的诊断测试包括但不限于X射线照相术、脊髓造影术、计算机断层扫描、磁共振成像、正电子发射断层扫描以及本领域已知的其他诊断测试。

如本文所用，术语“中枢神经系统疾病、异常或病症”是指破坏脑部或脊髓正常功能或通信的任何疾病、异常或创伤。可根据本发明治疗的CNS损伤是多种多样的，并且本领域的技术人员可容易地理解。这可以包括但不限于因神经外科、创伤、缺血、缺氧、神经退行性疾病、代谢紊乱、传染病、椎间盘压缩、肿瘤以及自身免疫疾病引起的脑部和脊髓损伤。

将VIPCC组合物施用到椎间盘可以通过注射方式进行。在此类实施例中，注射程序可按如下所述进行。有需要的受试者可以采取侧卧并前弯的姿势。可将针或套管插入待治疗的椎间盘的髓核。当治疗中枢神经系统缺损时，可以将针或套管设置在硬脑膜附近。可以在示踪剂引导下将针或套管插入。术语“示踪剂”可与如下定义的术语“造影剂”互换。可用于本发明方法的技术包括荧光自显影术、扫描、磁共振成像、断层扫描、纳米技术、数字视频、X射线或本领域已知的任何其他技术。示踪剂的非限制性实例为有机染料、食用染料和/或荧光染料。造影剂可以选自多种无毒试剂，例如碘。如果人眼不能看见示踪剂的光谱，那么可以通过适当的设备检测示踪剂。一旦正确定位后，即可将针或套管插入髓核，例如在横穿纤维环后。然后，注射造影剂，以验证准确的应用部位。造影剂可以存在于针尖或套管末端。验证位置后，将VIPCC和例如等体积的活化组分注射进椎间盘间隙中。注射程序可以采用任何次序，例如，组分可以同时或相继施加，并当组分混合时形成支架。

术语“活化组分”是指一种能够使纤维蛋白原形成纤维蛋白的化合物，包括凝血酶和/或可得自蛇毒的溶液。在本发明的一个实施例中，凝血酶从人类或哺乳动物血浆中分离而来。还可以通过重组方法制备能够形成纤维蛋白的酶。

活化的VIPCC可以与包含脊索来源细胞，例如髓核细胞的细胞组合物联合注射。

活化的VIPCC可以按照适于重建受损区域的量使用，并取决于损伤程度。

可以将组分注射进缺损的基部，并当遇到阻力时，可以将针或套管从纤维环中拔出。过多的溶液会溢出注射部位，从而在注射后形成固体凝胶，并且封闭孔或切口。

在本发明的一个实施例中，VIPCC包含比率为约1/7的纤粘蛋白/纤维蛋白原。术语“病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液”涉及所含纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率高于1/12的全血冷沉淀物，例如EP-B-534,178和WO-A-9305822中所述，其可以通过以下步骤获得：

-解冻冷冻糊状物；

-溶于pH值为7.0至7.2的缓冲液；

-预热到30至35℃；

-将pH值调到7.0至7.2；

-一边搅拌，一边加入氢氧化铝；

-离心，弃去沉淀；

-加入CaCl₂；

-灭活病毒；

-通过超滤浓缩，使蛋白浓度达到60至100mg/ml。

目前，已公开了用于椎间盘和中枢神经系统再生的纤维蛋白胶或纤维蛋白制剂，然而，根据本发明我们发现，与具有较低纤粘蛋白/纤维蛋白原比率并包含氨甲环酸和/或牛抑肽酶的组合物相比，下述冷沉淀物，例如根据Martinowitz和Bal的方法制备的冷沉淀物更适于促进髓核组织细胞的贴壁、增殖、生长、分化和/或维持：所述冷沉淀物包含高的纤粘蛋白/纤维蛋白原比率，接近于初始冷沉淀物的比率，并且其中该冷沉淀组合物不含氨甲环酸和/或牛抑肽酶。现有公开领域既未公开也未建议以下冷沉淀制剂的用途，其包含优选的纤维蛋白原和纤粘蛋白的比率，不含氨甲环酸和牛源抑肽酶，适用于在异常髓核中使用。

其他商业制剂，例如所含的纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率低于初始冷沉淀物，并包含氨甲环酸和/或牛抑肽酶，因此与任何其他可商购获得的冷沉淀物相比，本发明的冷沉淀物更适于治疗椎间盘和中枢神经系统疾病，所述其他可商购获得的冷沉淀物例如为基于Schwartz等人的方法制备的冷沉淀物，其不保持初始冷沉淀物中存在的纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率，或具有等于或小于1/12的比率(Bar等人，2005年)，并且包含氨甲环酸和/或牛抑肽酶，而本发明的冷沉淀物中相应比率高于1/12、为约1/11至约1/5、为约1/10至约1/5、为约1/10至约1/7以及为约1/7，例如按EP-B-534,178中所述制备的BAC；Omrix，IL，其中如EP-B-1,390,485和WO-A-02095019所述去除了血纤维蛋白溶酶和血纤维蛋白溶酶原。

根据本发明的冷沉淀物包含某些物质和特定的纤粘蛋白/纤维蛋白原比率，可促进脊索来源细胞的贴壁、迁移和增殖，这种现象可有助于治疗脊柱疾病、异常或病症，例如椎间盘退变性疾病和中枢神经系统疾病、异常或病症。

根据本发明的冷沉淀物可以包含稳定剂，例如精氨酸或赖氨酸或精氨酸与赖氨酸的混合物、或其可药用盐。冷沉淀溶液包含如下蛋白的混合物，例如纤维蛋白原、因子VIII、因子XIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等等。冷沉淀溶液可以包含除牛抑肽酶和/或氨甲环酸之外的蛋白酶抑制剂。这些冷沉淀物在WO-A-9833533和US-B-6,121,232中有所描述，其中如EP-B-1,390,485和WO-A-02095019中所述，去除了血纤维蛋白溶酶和血纤维蛋白溶酶原。可以通过纳米过滤、有机溶剂/去污剂处理、加热处理或本领域已知的任何其他方法来实施病毒灭活程序，所述加热处理例如但不限于巴氏灭菌、γ或UVC(＜280nm)辐射。术语“感染性粒子”是指可在生物有机体细胞中感传染或繁殖的微观粒子，例如微生物或朊病毒。感染性粒子可以是病毒粒子。

可通过在纯化步骤前和/或在纯化操作中将某种分子加入到组合物中进行病毒灭活。可通过重力作用、柱层析法或本领域已知的任何其他方法将所加的分子及其产物去除。

可通过纳米过滤或通过选择性吸收方法，例如亲和、离子交换或疏水层析，去除感染性粒子。病毒灭活可以WO-A-9114439中所述的程序进行。基本原理是用特定的去污剂处理冷沉淀物，随后从冷沉淀物中除去去污剂。可进行多步骤病毒灭活程序。例如，可让组合物经受有机溶剂/去污剂处理、热处理、选择性层析以及纳米过滤。在本发明的一个实施例中，冷沉淀物经两步病毒灭活处理。根据本发明，冷沉淀物是一种浓缩的冷沉淀物。冷沉淀物浓缩系数在约2至约5的范围内。在本发明的一个实施例中，浓缩系数为约3。在本发明的一个实施例中，通过超滤浓缩冷沉淀物，使蛋白浓度达到60至100mg/ml。VIPCC中纤维蛋白原的浓度可以很高，并且可以在约15至约150mg/ml、40至约100mg/ml、或约40至约60mg/ml的范围内。

如实例中所示，增加的纤维蛋白原的浓度会阻碍髓核细胞贴壁、生长和增殖。然而，VIPCC中纤粘蛋白/纤维蛋白原的高比率似乎可以缓解由VIPCC中存在的高浓度纤维蛋白原引起的不良影响。

在本发明的一个实施例中，血浆冷沉淀物为活化的。在本发明的另一个实施例中，冷沉淀物为非活化的。活化程序可通过将所述冷沉淀物与等体积的能与纤维蛋白原反应形成纤维蛋白的酶进行混合来完成。在本发明的一个实施例中，所述酶为凝血酶和/或可得自蛇毒的溶液。凝血酶通常从人体分离而来。还可以通过重组方法制备能够形成纤维蛋白的酶。根据本发明的冷沉淀物和/或活化化合物可以溶液或固体形式，例如以冻干粉形式提供。溶液可以为冷冻状态。

本发明的活化的VIPCC具有髓核的生物力学和生理学特性，可有利地用于替换受损的天然髓核组织。

冷沉淀物可以包含造影剂。“造影剂”是指可使观察脊柱解剖结构成为可能的示踪剂。可用于本发明方法的技术包括扫描、磁共振成像、断层扫描、纳米技术、数字视频、X射线或本领域已知的任何其他技术。

造影剂的非限制性实例为有机染料、食用染料和/或荧光染料。造影剂可以选自多种无毒试剂，例如碘。如果人眼不能看见造影剂的光谱，那么可通过适当的设备检测造影剂。

本发明公开了适于脊索来源细胞生长的二维基质的形成。还提供了一种用于体内和/或体外应用的三维支架，包括用于体内组织工程以及用于体外细胞培养的生物相容性植入物。术语“组织工程”通常是指联合使用适当的生物化学和生理化学因子来恢复、替换、维持和/或增强组织功能或全器官。术语组织工程有时与术语再生医学同义。

术语“支架”通常是指一种三维基质，其能够提供结构完整性并支持三维组织形成，从而可使组织重建。

本发明的支架具有如下性质：无毒、生物相容、可生物降解、可使脊索来源细胞贴壁和迁移以及可使活细胞扩散。

本发明的支架还可以用来递送和保持包含脊索来源细胞，例如髓核细胞的细胞组合物。

在本发明的一个实施例中，所述能在体内形成三维支架的活化冷沉淀物可通过注射方式施用于受损脊柱，例如注入有需要的受试者的退变性椎间盘的髓核或受损CNS。体内的活化冷沉淀物可用来提供机械支撑、恢复高度、和/或用作将细胞锚定在缺损或受损部位原位的细胞锚定源、和/或用来提供可使来自受损部位的细胞在其中迁移、侵入、生长、增殖和/或分化的基质。

在体内形成的支架可以是一种可注射的材料，其可以通过套管或针以液体形式注入受损脊柱中，然后在体内硬化。在本发明的一个实施例中，在体内形成的支架可以适形于腔体的形状，并完全填充椎间盘间隙，从而实现脊柱节段更好的稳定性。

冷沉淀物可与活化化合物同时注射，然后在体内硬化。在本发明的一个实施例中，沿着受损的脊髓注射活化组分和VIPCC，活化的VIPCC作为用于重建例如由椎间盘压缩引起的受损和/或断裂脊髓的支架。

VIPCC组合物可用来在疾病、异常或病症的不同发展阶段重建退变的椎间盘。在本发明的一个实施例中，根据本发明的方法用来预防椎间盘突出。在本发明的另一个实施例中，根据本发明的方法用来在椎间盘突出发生前为处于椎间盘疾病早期的受试者施用。在本发明的另一个实施例中，活化的冷沉淀物充当为患有晚期的例如由椎间盘压缩或椎间盘突出引起的椎间盘疾病和/或脊髓损伤的受试者重建髓核的支架。

VIPCC可以用来恢复高度和/或减轻或缓解椎间盘疼痛。可对退变性椎间盘疾病的高危个体，例如骨质疏松症患者监测椎间盘高度的变化，当检测到高度下降时，就可以使用本发明的VIPCC，以恢复或升高椎间盘高度。

作为另外一种选择，根据本发明的方法包括在使用所述冷沉淀物前切除所有或部分髓核的步骤。切除步骤可以通过分解细胞外基质的酶法、使用Nucleotome针的机械方法和/或本领域已知的任何其他方法来进行。

例如，可以在分别通过例如全身或局部麻醉使患者处于深度睡眠或无痛感时进行外科手术。可以在退变部位上通常在后腰中线进行切入。可将绕着和覆盖脊髓的骨骼(椎板)切除(椎板切除术)，以及可将引起神经或脊髓压迫的组织切除。可以增大神经穿过的孔，以防止进一步压迫神经。有时，可采用一块骨头(植骨)、椎间融合器或椎弓根螺钉来加固手术区。可将本发明的冷沉淀物通过孔引入和/或可以用来涂布用于增强手术区的装置。

在本发明的一个实施例中，患者接受局部麻醉，而手术为微创手术(MIS)。

机械分离技术的非限制性实例包括切碎、截断、切片、铣削、粉碎、剪切、磨削、修剪、剥除、剥皮。采用其他已知的分离技术，例如过滤器、离心机、分离柱、亲和柱或本领域已知的任何其他技术，可进一步促进椎间盘细胞的分离。

能够降解软骨组织的蛋白水解酶包括但不限于：丝氨酸肽酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰弹性蛋白酶；半胱氨酸肽酶，例如木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶；天冬氨酸肽酶，例如胃蛋白酶；金属肽酶，例如胶原酶、明胶酶、链霉蛋白酶、软骨素酶；透明质酸酶和/或能够以相同或相似方式降解椎间盘物质的替代化学物质，以及它们的组合。

应当理解，降解哺乳动物椎间盘组织所需的酶药理适用溶液的量是可变的。

术语“药理适用溶液”是指能溶解有效量蛋白水解酶的溶液。可将该溶液的pH值调至为约7.40的生理相容pH值，以最大程度活化蛋白水解酶。为了得到更好的结果，溶液可以包含活化蛋白水解酶所需的所有组分。

能够降解软骨组织的蛋白水解酶可以溶液和/或固体形式，例如冻干粉提供。溶液和/或粉末在使用前为无菌、不含热原的冷冻干燥状态。通常可将装有冻干粉的小瓶温热至室温，然后使冻干粉复原为无菌水溶液。

如本文所用，术语“热原”是指感染性粒子，例如病毒、朊病毒、内毒素和/或外毒素，其可以在生物有机体细胞中传染或繁殖。

患者可以采取侧卧并前曲的姿势，然后可以在引导下，例如通过扫描、磁共振成像、断层扫描、纳米技术、数字视频和/或X射线或本领域已知的任何其他技术，将针或套管选择性定位在髓核中。

导向剂的非限制性实例为无毒有机染料、食品染料和/或荧光染料。如果人眼不能看见导向剂的光谱，那么可通过适当的设备进行检测。

验证位置后，即可应用蛋白水解酶溶液，例如通过注入受损区，以降解所有或部分髓核组织。可将消化后的组织吸出并置于试管中。再将生长培养基例如DMEM/Ham’s F12培养基添加到悬液中。

在本发明的另一个实施例中，通过Nucleotome探头切除髓核组织。患者可采取侧卧并前曲的姿势，并在上述引导下将包括Nucleotome探头的套管插入。Nucleotome探头具有可从腰椎间盘切割和吸出髓核组织的圆形顶端。可采用上述能够降解软骨组织的蛋白水解酶溶液，在37℃下将采集的髓核组织部分地或完全地消化。

可在体内固化的本发明的活化VIPCC可与获取的髓核细胞联合注射，从而提供有效的构造，注射的细胞可在其中以三维方式生长。

在使用蛋白水解酶处理髓核细胞的情况下，在注射程序前，通过加入有效量的灭活剂和/或通过离心并弃去上清液的方法去除蛋白水解酶，或通过本领域已知的任何其他方法，可将蛋白水解酶溶液从解离的髓核细胞和/或组织中清除。

可将获取的解离髓核细胞经液氮冷冻，然后保存在-80℃下直至使用。

作为另外一种选择，根据本发明的方法可以包括自体细胞、同种异体细胞、异种细胞和/或包含重组DNA的细胞，但不排除其他可能性。

术语“自体同源”细胞是指源于要重新植入的同一个体的细胞。

术语“异源”细胞是指取自相同物种的供体机体的细胞。

“异种”细胞是那些从另一物种的个体分离而来的细胞。

注射的细胞可以包括细胞组合物，其包含选自脊索来源细胞的细胞。

因此，可将本发明的冷沉淀物注入椎间盘，可选地结合脊索来源细胞，例如髓核细胞。

细胞群还可以包含纤维环细胞(例如取自尸体)。

在本发明的一个实施例中，注射的细胞为髓核细胞。在本发明的另一个实施例中，细胞来自自体同源。在本发明的另一个实施例中，自体同源髓核去除和细胞递送或重新植入步骤在同一外科手术中进行。

待递送进受损脊柱的细胞可包含在活化组分，例如凝血酶中，包含在冷沉淀物组分中，和/或可以为单独的组分。

根据本发明的一个实施例，可在施用程序前将待施用到受损脊柱的细胞体外培养于冷沉淀物上，该冷沉淀物包含比率高于1/12的纤粘蛋白/纤维蛋白原。在本发明的另一个实施例中，所述比率为约1/11至约1/5。在本发明的另一个实施例中，所述冷沉淀物包含相对浓度为约1/10至约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原。在本发明的另一个实施例中，所述冷沉淀物包含相对浓度为约1/10至约1/7的纤粘蛋白/纤维蛋白原。在本发明的另一个实施例中，纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率为约1/7。

体外培养的细胞可在活化的和/或非活化的冷沉淀物上生长。活化步骤可以通过将所述冷沉淀物与能与纤维蛋白原反应生成纤维蛋白的酶混合来完成。在本发明的一个实施例中，所述酶为凝血酶，并以相同体积添加到所述冷沉淀物中。在本发明的另一个实施例中，所述酶为可得自蛇毒的溶液。凝血酶可以从人或哺乳动物血浆中分离而来和/或通过重组方法制备。本发明的冷沉淀物和/或能形成纤维蛋白的酶可以溶液或固体形式，例如以冻干粉形式提供。该溶液可以为冷冻状态。

如本文所用，“体外”细胞培养是指将细胞培养于机体之外。体外细胞培养包括将细胞体外培养于例如悬液中、或单孔或多孔板中。体外培养还包括将细胞与不同类型的细胞共培养，以及在二维或三维基质中或基质上培养。

在另一方面，本发明涉及一种试剂盒的用途，其适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，例如退变性椎间盘。该试剂盒包括：第一容器，其包含根据本发明的VIPCC；以及第二容器，其包含当与纤维蛋白原反应时能形成纤维蛋白的酶。根据本发明，该试剂盒不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，使用其中血纤维蛋白溶酶原和血纤维蛋白溶酶已被降至等于或低于15μg/ml，例如5μg/ml或更低的VIPCC。

在本发明的另一个实施例中，所述试剂盒旨在在对脊柱和脊髓损伤或受损轴突的其他迁移进行急救时，将治疗溶液施用到受损的中枢神经系统中。

试剂盒还包含造影剂，目的在于例如定位施用部位并促进成像。造影剂可存在于包含冷沉淀组分的容器中、包含酶组分的容器中和/或单独的容器中。在本发明的一个实施例中，造影剂与冷沉淀物一起配制。在本发明的另一个实施例中，造影剂与能够形成纤维蛋白的酶一起配制。造影剂的例子包括但不限于，有机染料、食品染料和/或荧光染料。造影剂可以选自多种无毒试剂，例如碘。可用来检测造影剂的技术包括扫描、磁共振成像、断层扫描、纳米技术、数字视频、X射线或本领域已知的任何其他技术。如果人眼不能看见显像剂的光谱，那么可通过适当的设备进行检测。

在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括：包含根据本发明的VIPCC的第一容器；包含在与纤维蛋白原反应时能形成纤维蛋白的酶的第二容器；以及包含能够降解细胞外基质的蛋白水解酶的第三容器，所述蛋白水解酶例如为能够降解软骨组织的蛋白水解酶，选自由丝氨酸肽酶、半胱氨酸肽酶、天冬氨酸肽酶、金属肽酶、透明质酸酶以及它们的组合。

在本发明的一个实施例中，蛋白水解酶选自胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、胶原酶、明胶酶、链霉蛋白酶、软骨素酶、透明质酸酶和/或能够以相同或相似方式降解椎间盘物质的替代化学物质以及它们的组合组。如上所述的该试剂盒还可以包含造影剂，例如碘。

冷沉淀物和/或能够形成纤维蛋白的酶和/或蛋白水解酶和/或造影剂可以在椎间盘和中枢神经系统重建试剂盒中以溶液和/或固体形式，例如冻干粉提供。溶液可以为冷冻状态。试剂盒可以包包括使用说明书。试剂盒还可包括针，例如脊椎穿刺针，包括例如弯曲的脊椎穿刺针。作为另外一种选择，可使用脊椎套管。单筒、双筒或多筒注射器或其他纤维蛋白密封剂递送装置可以包括在试剂盒中。

本发明的主题涉及一种支架的用途，其适用于治疗脊柱疾病、异常或病症，例如用于再生椎间盘和中枢神经系统。该支架使用根据本发明的冷沉淀物和活化化合物制备。根据本发明，VIPCC组合物不含氨甲环酸和/或牛抑肽酶。

脊柱重建试剂盒或制剂的组分可以存在于单独的容器中，例如可以按任何次序施加的注射器中，例如可以同时或相继施加组分，并当组分混合时形成支架。

在本发明的一个实施例中，所述单独的容器可以构造用于施加所述冷沉淀物、能形成纤维蛋白的酶以及脊索来源细胞。在本发明的另一个实施例中，在混合组分前，可将脊索来源细胞与所述冷沉淀物和/或能够形成纤维蛋白的酶结合。

根据本发明，试剂盒的组分可以溶液和/或固体形式提供。溶液可以为冷冻状态。

本发明的另一个目的是建立在上述支架中生长的脊索来源细胞的组织或细胞库。

在本发明的一个实施例中，所述组织或细胞库可以用于椎间盘的修复和/或再生以及中枢神经系统重建。在本发明的一个实施例中，脊索来源细胞为髓核细胞。

根据本发明，所述组织或细胞库可以包含自体同源细胞、异源细胞、异种细胞和/或包含重组DNA的细胞。

如本文所用，“组织或细胞库”是指通过一种能够建系脊索来源细胞的方法建立的组织或细胞库，适于修复、再生和/或替换受损脊柱，例如椎间盘组织和中枢神经系统组织，例如轴突和运动神经元。所述组织或细胞库中的细胞可以保持其行使特有功能所必需的特性，例如生化、形态和/或物理特性。有利地，该细胞具有在二维结构模式或三维构造上增殖和/或分化成髓核细胞的能力。

本发明的另一方面涉及一种载体，由于根据本发明的冷沉淀物可提供一种合适的支架，脊索来源细胞可在其上贴壁、迁移、生长、分裂、维持其功能、形态和/或分化，所述载体可有利地用于将包含脊索来源细胞的细胞组合物递送到受损脊柱中，例如受损的椎间盘和中枢神经系统组织中。该载体或构造包含根据本发明的冷沉淀物以及脊索来源细胞。该冷沉淀组合物不含氨甲环酸和牛抑肽酶。在本发明的一个实施例中，脊索来源细胞为髓核细胞。该细胞递送载体还可以包含纤维环细胞。

术语“载体”是指将细胞递送进体内特定组织的工具。将活细胞掺入根据本发明的细胞递送载体并施用于受损的脊柱，例如椎间盘或中枢神经系统，从而重建、修复或恢复受损部位。细胞递送装置可以为液态的或为固化构造。

递送的细胞可为自体同源细胞、异源细胞、异种细胞和/或包含重组DNA的细胞。单层培养的椎间盘细胞往往会去分化并丧失其典型的细胞表型(Benya and Shaffer.“Dedifferentiated chondrocytes reexpress thedifferentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels”.Cell.1982；30：215-224)(Benya和Shaffer，培养于琼脂糖凝胶中时去分化的软骨细胞重新表达出分化的胶原表型，《细胞》杂志，1982年，第30期第215-224页)。根据本发明已经发现的是，培养于本发明冷沉淀物中的纤维环细胞和脊索来源细胞，例如髓核细胞，可维持其表型，并提供一种可用于体外和体内扩增的基质，适用于椎间软骨和中枢神经系统的重建外科手术。根据本发明发现，VIPCC包含软骨导引组分，如果将纤维环和髓核细胞接种于涂布有VIPCC的培养皿中，则这些软骨导引组分可促进细胞贴壁和增殖。根据本发明的结果表明，在传代培养或胰蛋白酶消化过程中，未出现可觉察的形态变化或损伤。此外，即使细胞迁移到整个培养皿，也可观察到细胞对VIPCC和纤粘蛋白贴壁能力的差异。该结果证明，纤粘蛋白，公认为可促进细胞粘附的试剂，是VIPCC中的基本组分，需要与纤维蛋白原构成特定的比率才有利于髓核软骨细胞的贴壁和增殖。

因此，本发明的另一主题是提供一种有利于脊索来源细胞生长、增殖、分化和/或维持的方法，其包括将脊索来源细胞的细胞群与根据本发明的VIPCC接触。在本发明的另一个实施例中，脊索来源细胞为髓核细胞。髓核细胞与冷沉淀物的接触可在体外和/或体内进行。

VIPCC可为活化的或非活化的。所接触的细胞可为自体同源细胞、异源细胞、异种细胞和/或包含重组DNA的细胞。

本发明的冷沉淀物可以具有导引和诱导能力。

本发明的所述冷沉淀物的导引或诱导能力可以通过以下方法确定：使用冷沉淀物，随后评估对所培养的纤维环和脊索来源细胞，例如髓核细胞的贴壁、迁移、增殖和/或分化的促进作用。这些特性的评估可以通过本领域已知的任何技术进行，例如，通过使用血球计数器或通过苏木素与伊红染色评估增殖；通过测定硫酸软骨素的表达情况评估分化；通过使用如下示例的迁移试验评估迁移。

如本文所用，术语“导引”是指活化的冷沉淀物充当支架的能力，特定细胞可在其上贴壁、生长、迁移、增殖和/或分化，“导引”包括“软骨导引”或“神经导引”等。

如本文所用，术语“诱导”是指冷沉淀物促进特定细胞贴壁、生长、迁移、增殖和/或分化的能力，包括“软骨诱导”或“神经诱导”等。

用于“导引”的另一个术语是“趋化”。术语“趋化”是指引起细胞朝向化学刺激发生特征性运动或取向的生理反应。

盘内注射或鞘内注射可引起髓核细胞群典型结构的变化，例如坏死性损伤、核固缩以及核溶解。根据本发明发现，通过将根据本发明的冷沉淀物加入到要施用于受损脊柱，例如退变性椎间盘和受损中枢神经系统的制剂中，可以解决或改善这一问题。

根据本发明的试剂盒、制剂、支架、组织或细胞库和/或载体可以包含一种或多种添加剂，例如但不限于：支持细胞扩增同时保持其分化能力的生化因子、治疗剂(例如抗生素、抗炎药)、止痛药、抗肿瘤药、生长因子、蛋白、激素、软骨诱导因子、例如聚集蛋白聚糖的蛋白聚糖、I型和II型胶原、含氧组分、酶等等。

这些组分的一种或多种可以存在于冷沉淀物组分中，存在于活化组分，例如凝血酶中，和/或可以为单独的组分。

施用于有需要的受试者以重建中枢神经系统的试剂盒、制剂、支架、组织或细胞库和/或载体可以包含Rho激酶抑制剂，例如Y-27632、C3等等。

本发明的另一个目通过提供一种治疗脊柱疾病、异常或病症，例如椎间盘和中枢神经系统疾病的方法来实现，该方法包括将根据本发明的试剂盒、VIPCC、来自组织或细胞库的细胞和/或载体施用于有需要的受试者。

本发明的另一个方面涉及根据本发明的病毒灭活血浆活化冷沉淀浓缩液的用途，其适用于治疗脊柱疾病、异常或病症。根据本发明，该冷沉淀组合物不含牛抑肽酶。在本发明的一个实施例中，所述冷沉淀物包含初始相对浓度为约1/10至约1/5、或约1/10至约1/7的纤粘蛋白/纤维蛋白原。

所述冷沉淀物可以用来治疗椎间盘疾病、异常或病症，或受损的CNS。

根据本发明发现，与注射了PBS的椎间盘相比，活化的VIPCC可基本上恢复IVD的高度。因此，本发明的活化VIPCC可用作具有合适机械性能的基质或装置，其可有利地用于基本上恢复正常的椎间盘结构、高度，并能在负荷下保持椎间盘间隙。

因此，在另一方面，本发明涉及使用根据本发明的VIPCC来升高或恢复椎间盘高度。例如，可将根据本发明的活化VIPCC注射进黑椎间盘，以恢复该椎间盘的高度。在椎间盘退变的早期，当髓核细胞仍存在于椎间盘中时，本发明的VIPCC将有利地升高椎间盘的高度，并作为引导髓核细胞的支架。在这种情况下，冷沉淀浓缩液不含氨甲环酸和牛抑肽酶。

在本发明的一个实施例中，所述冷沉淀物包含初始相对浓度为约1/10至约1/5、或约1/10至约1/7的纤粘蛋白/纤维蛋白原，例如该比率为约1/7。

根据本发明所述的适用于预防和/或治疗受损脊柱的试剂盒、制剂、组织或细胞库和/或载体可任选地包含自体同源、异源、异种纤维环细胞和/或包含重组DNA的纤维环细胞。

技术人员能容易地理解在本发明描述中公开的范围。这表示公开了范围限内的连续值和数字，并包括限定数字和值。例如，如果给定的范围为1/11至1/5，那么它至少表示1/11、1/10、1/9、1/8、1/7、1/6和/或1/5，以及中间子范围的所有组合，例如，1/11-1/10、1/11-1/9、1/11-1/8、1/11-1/7、1/11-1/6、1/11-1/5；或1/10-1/9、1/10-1/8、1/10-1/7、1/10-1/6、1/10-1/5等等。

以上或以下引用的专利申请、专利和出版物的公开内容在此均以引用方式并入。

以下实例为示例性的，而非限制性的。

实例

实例1：

制备纤维环和髓核软骨细胞。

该实例示出了软骨细胞培养物的制备。在宰杀后12小时分离猪腰椎(L1-L6)(在4℃下运输)，通过septal scrab灭菌10分钟，再在70％的乙醇中浸泡5分钟。去除肌肉和其他结缔组织，再将各椎体从中切开，以便可以得到分离的椎间盘(IVD)。然后将分离的IVD在盛有PBS与200μg/ml叠氮化钠的量筒中浸泡几秒。接着浸泡在包含10U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2.5μg/ml两性霉素、50μg/μl庆大霉素、10μg/ml万古霉素、65.6μg/ml先锋霉素以及10％胎牛血清(FBS)的无菌PBS中。然后将样本转移到无菌层流下，余下操作均在无菌条件下进行。

使用解剖刀将各IVD切成两半，小心分离髓核组织，然后将其置于97mm细胞培养皿中。在添加有上述抗生素和FBS的PBS中将髓核组织漂洗三次，以去除残渣。然后，用胶原酶溶液(Sigma产品目录号C-6885；与DMEM/Ham’s F12培养基(Biological industries)按1∶1混合，浓度为3mg/ml，其中培养基添加了10U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素、100mg/μl庆大霉素、10μg/ml万古霉素以及6.56μg/ml先锋霉素)在含5％CO₂的潮湿气氛中于37℃下将髓核组织温和消化3小时。

在消化步骤前，将胶原酶溶液经0.45μm过滤器(MilliporeSLHV033RS)过滤。

通过无菌纱布过滤消化后的组织，然后在800g下离心5分钟。离心后，弃去上清液，再用2ml添加有10U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素、100mg/μl庆大霉素、10μg/ml万古霉素以及6.56μg/ml先锋霉素的DMEM/Ham’s F12重悬细胞。

从开放的IVD上切下纤维环组织，将其置于97mm细胞培养皿中，然后在包含10U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素、2.5μg/ml两性霉素、50μg/μl庆大霉素、10μg/ml万古霉素、65.6μg/ml先锋霉素以及10％FBS的PBS中漂洗两次。用解剖刀将纤维环组织切成糜(3-5mm)。将该组织糜于37℃下、含5％CO₂的潮湿气氛中孵育过夜。孵育后，用胶原酶溶液(按上述方法制备)在5％CO₂中于37℃下将组织消化5小时。完成消化后，将细胞悬液通过无菌纱布过滤。之后，将800g悬液离心5分钟，再用2ml新鲜的DMEM/Ham′s F12培养基(添加物同上)重悬包含纤维环软骨细胞的沉淀颗粒。

实例2：

凝血酶、病毒灭活血浆冷沉淀浓缩液(VIPCC)及其组分对纤维环细胞贴壁和增殖的影响。

实施以下实例以研究凝血酶、VIPCC及其组分对纤维环细胞贴壁、增殖和趋化性的影响。为此，在97mm塑料培养皿周围涂布80μl下列溶液：VIPCC(BAC；Omrix，IL；按EP-B-534,178中所述进行制备，其中纤维蛋白(原)按EP-B-1,390,485中所述去除)；纯化的人纤维蛋白原(Enzyme research，产品目录号FIB12800L)；凝血酶(Omrix，IL，按US-B-5,143,838和EP-B-378,798中所述进行制备)；以及人血清白蛋白(Sigma，产品目录号A7030)(参见图1)。每种溶液含5-20μg/ml总蛋白。在生理盐水中稀释。纯化的纤维蛋白原涂层和VIPCC涂层中的纤维蛋白原含量为约8μg。将溶液在无菌层流下风干。然后，将150μl悬浮于生长培养基(添加有上述抗生素和10％FBS的DMEM/Ham’sF12)的纤维环细胞(5×10⁶)置于培养皿中央(图1原点)，盖上培养皿，在含5％CO₂的潮湿气氛中于37℃下孵育过夜。孵育后，弃去培养基，另更换为10ml生长培养基(添加有抗生素和10％FBS的DMEM/Ham′sF12培养基)，然后将培养皿再孵育14天。

通过苏木素与伊红染色方法，对以上二维培养物进行组织学评估。简言之，将培养的软骨细胞用95％的乙醇固定15分钟，用H₂O冲洗干净，再将其置于苏木素溶液Gill NR1(Sigma，产品目录号GHS116)中3分钟。然后，用H₂O将培养物冲洗干净，用伊红Y(Sigma，产品目录号E4382)复染30秒，再在95％的乙醇和H₂O中漂洗。然后，用H₂O将细胞冲洗三次，再从宏观和微观上分析。如图1所见，接种于培养皿中央的纤维环细胞均匀迁移到整个视野，但是与未涂布的平板或者用人纤维蛋白原、凝血酶、或人血清白蛋白涂布的斑块相比，培养于包含VIPCC的涂布斑块上的纤维环细胞表现出更强的贴壁和增殖能力。结果表明VIPCC包含软骨导引组分，这些软骨导引组分可以促进纤维环细胞贴壁和增殖，并可有利于退变性椎间盘的重建。

实例3：

胰蛋白酶消化过程和/或传代对VIPCC介导的纤维环细胞贴壁和增殖的影响。

传代数是指细胞系的“年龄”或指细胞传代培养的次数。一些细胞系在传代后可能出现形态变化。此外，用于传代培养的细胞培养方法，例如胰蛋白酶消化，可能会破坏细胞膜，从而导致细胞贴壁能力不佳、细胞聚集或细胞膜变成“碎片”状。本研究的目的在于确定胰蛋白酶消化和/或传代对VIPCC介导的纤维环软骨细胞贴壁和增殖的影响。为此，将来源于纤维环的软骨细胞(如实例1中所述)分离，然后将500μl包含0.625×10⁵个细胞的悬液加到未涂布的24孔板的一个孔中。将培养物在含5％CO₂的潮湿气氛中于37℃下孵育11天。孵育后，通过将100μl胰蛋白酶(胰蛋白酶-EDTA，Biological Industries，03-050-1A)加到各个孔中，在37℃下将细胞酶解5分钟。将三个孔中的解离软骨细胞收集到一个小瓶中，然后将800g细胞悬液离心5分钟。弃去上清液，用200μlDMEM/Ham’s F12培养基(添加有抗生素和10％FBS)重悬细胞，再将其置于97mm塑料培养皿的中央，该培养皿周围涂布有80μl以下溶液的液滴：含6.4μg总蛋白(其中4.7μg为纤维蛋白原)的VIPCC、3μg纯化的人纤维蛋白原、0.18μg纤粘蛋白(根据Miekka et al.“Rapid methodsfor isolation of human plasma fibronectin”.Thromb Res.1982；27：1-14(Miekka等人，分离人血浆纤粘蛋白的快速方法，《血栓研究》杂志，1982年，第27期第1-14页)提出的方法制备)、以及浓度分别为0.3∶2.7μg的经纯化的纤粘蛋白/人纤维蛋白原混合物(比率大约为1/10)。将培养物在5％CO₂中于37℃下孵育24小时，用生长培养基冲洗两次以去除未贴壁的细胞，再加入10ml DMEM/Ham′s F12培养基(添加有抗生素和10％FBS)。将培养物再孵育9天。使用苏木素与伊红溶液对细胞染色，然后从宏观和微观上观察以进行形态评估。

结果显示传代培养或胰蛋白酶消化过程不会导致纤维环细胞发生任何形态变化。此外，明显的是细胞迁移到整个培养皿，但也观察到了细胞对VIPCC和纤粘蛋白涂层的贴壁能力的差异(图2)。结果证明纤粘蛋白，公认为可促进细胞粘附的试剂，是VIPCC中的一种基本组分，可促进软骨细胞贴壁和增殖。

实例4：

纤维蛋白原/纤粘蛋白比率对纤维环和髓核细胞贴壁和增殖的影响。

以上实例说明了存在于VIPCC组分中的纤粘蛋白在促进纤维环软骨细胞迁移、增殖和贴壁方面的作用。本实验旨在研究不同比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物对髓核和纤维环软骨细胞贴壁和增殖的影响。为此，将24孔板的孔分别用200μl以下组分之一进行涂布：0.626μg纯化纤粘蛋白；10μg纯化人纤维蛋白原(fgn)；或用以下浓度的纤粘蛋白和纤维蛋白原混合物涂布：0.626μg∶3.13μg、0.626μg∶6.26μg或0.626μg∶12.52μg(比率分别为1/5、1/10和1/20)。因此，在以上组分中，纤粘蛋白的量保持不变，而纤维蛋白原的量增加。

将溶液放在无菌层流下，使其附着到微孔上。3小时后，弃去过多的溶液，再将微孔板倒置孵育2小时，使其干燥。将500μl新分离的髓核或纤维环细胞悬浮于DMEM/Ham’s F12培养基(添加有上述抗生素和10％FBS)中，然后以每孔6×10⁴个细胞的浓度接种于上述涂层孔中。将培养物在含5％CO₂的潮湿气氛中于37℃下孵育5和12天。

在5和12天体外培养后，对以上二维培养物进行组织学评估。按上述方法固定经培养的软骨细胞，并置于苏木素与伊红Y溶液中。然后，将培养物用结晶紫(100m乙酸中溶有1g)染色10分钟，再用H₂O冲洗干净。

为了量化细胞贴壁水平，用100μl 70％的乙醇处理10分钟，从细胞中萃取出染料。将75μl等分试样转移到96孔板中，使用分光光度计测量590nm波长下的吸光度。将生长在纤粘蛋白涂层孔中的细胞的吸光度视为100％细胞贴壁。

图3A和B分别表示在不同涂层上培养5天后，髓核和纤维环细胞贴壁情况的结果。令人惊讶的是，发现与纤维环细胞贴壁形成对比，髓核细胞贴壁能力会受不同涂层的影响。结果显示随着纤维蛋白原浓度增加，髓核细胞的贴壁能力按照剂量依赖方式显著下降。然而，增大纤粘蛋白/纤维蛋白原的比率，可得到相反的结果(图3A)，例如，比率为1/5的经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物与比率为1/10和1/20的经纯化的混合物相比，表现出更高比率的髓核细胞贴壁(图3A)。这些结果证明了比率为约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原与包含较低比率纤粘蛋白/纤维蛋白原的混合物相比，更适于髓核细胞的贴壁和增殖。

这些结果表明了纤粘蛋白/纤维蛋白原比率对髓核细胞贴壁起着关键作用，并且证明了高比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原用于髓核细胞的优点。

评估了包含1/10-1/5比率范围的纤粘蛋白/纤维蛋白原的VIPCC，以及比率为1/10的经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物对髓核和纤维环细胞增殖的影响。细胞增殖的计算方法是，从第12天贴壁细胞的百分比中减去第5天贴壁细胞的百分比。这些结果基于以上实验中进行的测量。结果汇总于表1中，该表示出了培养5天和12天后贴壁细胞的百分比。

表1：在VIPCC和纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物(1/10)涂层上髓核和纤维环贴壁细胞的百分比。

表1中的结果以相对于同一实验中纤粘蛋白涂层上的贴壁细胞(视为100％)的贴壁细胞百分比表示。

所得结果表明，在第5天，与比率为1/10的经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物相比，髓核细胞在VIPCC涂层上的贴壁能力明显更强(在VIPCC和经纯化的混合物上的贴壁细胞分别为56％和22％)(图3A和表1)。相比之下，纤维环软骨细胞在两种涂层上的细胞贴壁能力相似(在VIPCC和经纯化的混合物上的贴壁细胞分别为62％和65％)(图3B和表1)。

此外，在第12天所得的结果显示，与经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物涂层上的细胞数量增量(第5天和12天分别为65％和71％，Δ＝6％)相比，接种在VIPCC涂层上的纤维环细胞培养物表现出细胞数量明显增加(第5天和12天分别为62％和88％，Δ＝26％)。髓核细胞培养物表现出相似却更显著的影响。VIPCC涂层导致细胞数量增加21％(第5天和12天分别为56％和77％)，而纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物涂层导致贴壁细胞数量下降(第5天和12天分别为22％和14％，Δ＝-8％)。这些结果表明，与由经纯化的纤粘蛋白和纤维蛋白原混合物组成的涂层相比，髓核和纤维环细胞在VIPCC涂层上的增殖能力更强，也表明了髓核软骨细胞更易受到不同涂层的影响。

实例5：

VIPCC和经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物对培养的髓核的影响。

使用XTT分析，进一步评估了不同浓度的纤粘蛋白和纤维蛋白原混合物对髓核细胞贴壁和活力的影响。该分析是基于活细胞可将2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-甲酰胺(XTT)从黄色四唑盐还原成可溶性橙色甲臜化合物的能力。

使用实例1中所述的相同程序制备髓核细胞。用30μl以下溶液之一涂布平底96孔板：0.626μg纯化的纤粘蛋白、10μg纯化的人纤维蛋白原、稀释的VIPCC(包含约1.57μg纤粘蛋白和10μg纤维蛋白原)以及纤粘蛋白/纤维蛋白原的混合物(0.626μg∶6.26μg，1/10)。将溶液放在无菌层流下风干，然后将100μl细胞悬液以每孔1×10⁴个细胞的密度分配到预涂布的孔中。将未涂布的孔用作对照组。经4小时孵育期后，用新鲜培养基更换此前的生长培养基(添加有上述抗生素和10％FBS的DMEM/Ham′s F12培养基)，以去除未贴壁的细胞。将培养物在含5％CO₂和95％空气的潮湿气氛中于37℃下孵育24小时。在孵育期结束时，每孔加入50μl XTT试剂(XTT细胞增殖试剂盒，Biological industries，产品目录号20-300-1000)，再将培养物放在37℃的培养箱中4小时。根据制造商方案，使用spectro-ELISA酶标仪读取显影的颜色。弃去上清液，然后加入新鲜生长培养基。5天后重复该分析。吸光度与代谢活跃细胞的量成正比。结果以相对于纤粘蛋白涂层中代谢活跃细胞(100％)的代谢活跃细胞百分比表示。

如图4所示，与纤粘蛋白涂层相比，纤维蛋白原涂层引起代谢活跃的髓核细胞的量显著下降(第1天和5天分别为86.4％和19.6％，D＝-66.8％)。包含相同纤维蛋白原含量并且纤粘蛋白/纤维蛋白原比率为1/5-1/10的VIPCC涂层，以及比率为1/10的经纯化的纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物，能够缓解在纤维蛋白原涂层中观察到的代谢活跃细胞的下降。该影响在VIPCC涂层中尤其明显。这些结果证实了之前的结果，并显示了使用VIPCC替代纯纤粘蛋白/纤维蛋白原混合物作为髓核细胞培养涂层的优点。因此，使用活化的VIPCC制备的髓核组织工程支架优于那些用活化的纯纤粘蛋白/纤维蛋白原制备的支架。

实例6：

纤粘蛋白和纤维蛋白原含量对代谢活跃的髓核和纤维环细胞百分比的影响。

本研究的目的在于确定纤维蛋白原和纤粘蛋白的含量对代谢活跃的髓核和纤维环培养细胞百分比的影响。为此，按实例1所述制备来源于髓核和纤维环的细胞。将平底96孔板涂上30μl纤粘蛋白/纤维蛋白原涂层。该涂层由恒定量的纤粘蛋白(0.626μg)和如下含量增加的纯化纤维蛋白原组成：0、3.13(比率为1/5)、6.26(比率为1/10)、12.5(比率为1/20)以及146μg(比率为1/233)。在另一组实验中，纤粘蛋白/纤维蛋白原涂层是由含量不变并且含量较高的纤维蛋白原(9.125μg)和如下含量增加的纯化纤粘蛋白组成：0.0313(比率为1/291)、0.042(比率为1/217)、0.0626(比率为1/145)以及0.125μg(比率为1/73)。

将溶液放在无菌层流下风干，然后将100μl细胞悬液(对两种细胞制备而言，每孔均含1×10⁴个细胞)加到孔中。

将培养物孵育4小时，然后更换当前的生长培养基(添加有上述抗生素和10％FBS的DMEM/Ham’s F12培养基)，以去除未贴壁的细胞。将培养物在含5％CO₂和95％空气的潮湿气氛中于37℃下再孵育24小时。在第7、10-13和16天，通过上述XTT分析评估纤维蛋白原对细胞贴壁的影响。吸光度与代谢活跃细胞的量成正比。结果以相对于纤粘蛋白吸光度(100％)的百分比表示。数据以至少三个独立实验(在各个实验中，均从三个不同的猪脊椎获取细胞)的平均值±标准偏差表示。

图5显示了代谢活跃的髓核细胞在包含恒定含量的纤粘蛋白和含量增加的纤维蛋白原的涂层基质中的百分比(A)；以及在包含恒定并且较高含量的纤维蛋白原和含量增加的纤粘蛋白的涂层基质中的百分比(B)。图5A中的结果显示出，保持纤粘蛋白含量恒定，增加涂层中纤维蛋白原的含量导致代谢活跃的髓核细胞百分比下降。纤维环细胞因加入纤维蛋白原而受到的影响较少(纤维环软骨细胞培养物的结果未示出)。在存在固定浓度的纤维蛋白原的情况下，增加纤粘蛋白的量未使代谢活跃的髓核细胞的百分比升高。另外，这些结果与之前的结果一致，表明比率为约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原与其他比率的纤粘蛋白/纤维蛋白原相比，更适于髓核软骨细胞贴壁。

实例7：

由活化的VIPCC制备的三维构造对生长在该构造中的软骨细胞的形态和功能的影响。

研究(Haudenschild et al.“Differential expression of multiple genesduring articular chondrocyte redifferentiation”.Anat Rec.2001；263：91-98(Haudenschild等人，多种基因在关节软骨细胞再分化过程中的差异表达，《解剖学报》，2001年，第263期第91-98页)；Li et al.“Chondrocytephenotype in engineered fibrous matrix is regulated by fiber size”.TissueEng.2006；12：1775-1785(Li等人，工程化纤维基质中的软骨细胞表型由纤维大小调控，《组织工程》杂志，2006年，第12期第1775-1785页)；Peretti et al.“A biomechanical analysis of an engineered cell-scaffoldimplant for cartilage repair”.Ann Plast Surg.2001；46：533-537(Peretti等人，用于软骨修复的工程化细胞支架植入物的生物力学分析，整形外科学纪事，2001年，第46期第533-537页))表明软骨细胞体外扩增会引起表型变化以及蛋白聚糖合成减少。前面的实例显示包含比率为约1/5的纤粘蛋白/纤维蛋白原的VIPCC更适于髓核细胞生长。因此，本实验的目的在于确定在由活化的VIPCC组成的三维基质中生长的软骨细胞的形态。为此，使用稀释5倍的VIPCC制备750μl纤维环或髓核细胞悬液，该VIPCC包含14mg/ml的可凝固纤维蛋白原。为了活化VIPCC组分并使之形成凝块，将上述悬液与等体积的凝血酶溶液(2IU，Omrixbiopharmaceuticals LTD，IL)同时加到6孔板培养皿中。三维软骨细胞构造形成，其中每孔包含6×10⁵个细胞。

凝块形成后，向细胞构造添加0.5ml包含上述抗生素和10％FBS的DMEM/Ham′s F12培养基。将微孔板在37℃下在含5％CO₂的潮湿气氛中培养。12小时后，去除培养基，用解剖刀将一部分构造从侧壁分离，以减弱张力状态。附着的构造，其被视为生长在较高的张力条件下，用作对照组。

将构造培养于包含上述抗生素和10％FBS的DMEM/Ham’s F12培养基中，再分别孵育纤维环或髓核8天或14天。弃去培养基，用3.7％的多聚甲醛溶液固定培养物10分钟，然后用阿尔新蓝(Sigma，产品目录号A5268)在室温下染色10分钟。阿尔新蓝染色旨在显示特别由软骨细胞产生的粘多糖和糖胺聚糖(GAG)。属于GAG家族的硫酸软骨素通常以蛋白聚糖的形式存在，其构成软骨组织细胞外基质中的基质。

这些结果汇总于图6中，并示出了阿尔新蓝对纤维环软骨细胞(图6，上图)和髓核软骨细胞(图6，下图)的染色情况。结果表明纤维环和髓核软骨细胞均为功能性的，并且都能产生硫酸软骨素。分离的支架(图6B和D)呈丝状和分支状表型，而张力更大的附着支架(图6A和C)呈球状表型。因此，这些结果表明了在活化的VIPCC三维支架中生长的软骨细胞为功能性的，并且所形成的支架的张力会影响表型分化。

实例8：

由活化的VIPCC制备的不同三维制剂对VIPCC软骨导引能力的影响。

本实验的目的在于研究制剂对VIPCC软骨导引特性的影响。将VIPCC稀释于包含上述抗生素的DMEM/Ham’s F12培养基中，得到三种溶液(1∶2.5、1∶5、1∶10，分别包含最终浓度为28、14和7mg/ml的可凝固纤维蛋白原)，使用此三种溶液来制备分离的髓核软骨细胞的悬液。然后，将上述悬液与等体积的凝血酶组分(1IU/ml，如US-B-6,121,232中所述)混合。所述构造的最终体积为30、60或90μl，其中VIPCC的最终稀释度为1∶5、1∶10或1∶20，凝血酶的最终浓度为0.5IU/ml。所有稀释溶液均含1.6×10⁵个髓核细胞。将每种混合物置于24孔板培养皿其中一个孔的中央。在凝块形成后，在周围加入200μl包含0.5IU/ml凝血酶和稀释20倍的VIPCC的混合物。形成凝块后(约30分钟)，加入0.5ml生长培养基(添加有抗生素和10％FBS的DMEM/Ham′s F12培养基)，然后将微孔板在37℃下在含5％CO₂的潮湿气氛中孵育22天。通过评估髓核软骨细胞从中央构造(包含不同稀释度的VIPCC和不同体积(30、60或90μl))向周边VIPCC构造迁移的能力，来评估VIPCC的软骨导引特性。培养22天后，弃去培养基，用3.7％多聚甲醛溶液固定培养物10分钟，然后用阿尔新蓝在室温下染色10分钟。通过监测微孔板中细胞的位置，发现仅在60μl体积、稀释10倍的活化VIPCC(包含7mg/ml可凝固的纤维蛋白原)中发生迁移。图7显示，在100倍显微镜视野下，60μl体积、稀释10倍的活化VIPCC(左图，细胞排列成带状结构)中的髓核软骨细胞发生迁移，与之形成对比的是，30μl体积、稀释20倍的活化VIPCC中的髓核软骨细胞不能迁移(右图)。另外，所有实验组中的软骨细胞都能在中央构造上增殖，并且都能够产生硫酸软骨素(结果未示出)。这些结果表明髓核软骨细胞能够感测趋化梯度，并且只有在存在化学浓度梯度的情况下才发生迁移。

实例9：

椎间盘注射液中的VIPCC的生物相容性。

之前的实例表明VIPCC适用于髓核细胞。因此，VIPCC可用于髓核细胞体外生长，或可以将其注射到椎间盘间隙中，以促进髓核细胞体内生长。以下实验旨在研究购自Omrix的活化VIPCC注射进椎间盘间隙后的生物相容性。为此，将VIPCC和凝血酶注射进猪椎间盘。

根据当前的伦理学要求，将体重为74kg、年龄为6个月的母猪(n＝1)关在经批准的设施中。肌内注射氯胺酮(10mg/kg)和甲苯噻嗪(2mg/kg)的混合物，诱导麻醉。

在外科手术前，进行体格检查(体重、体温、心率、呼吸频率)。在手术中，监测心电图、脉搏和血压。

外科手术：使动物侧卧并前曲。使用造影剂，作为用荧光自显影术定位IVD腔体的视觉引导。所用的造影剂为碘(0.37g/ml碘，TelHashomer，IL)。使用连接到90mm长的23G脊椎穿刺针的注射器(“phoenix”Kobayashi Shoji K.K Tokyo，Japan)进行注射。

为了执行注射程序，用稀释的碘液(与生理盐水按1∶1混合)填充IVD胸椎段10-11(T₁₀-T₁₁)。

当符合注射要求后，即按以下顺序进行IVD注射：

1.将约200-300μl生理盐水注射到IVD L₁-L₂和L₃-L₄中。

2.使用Omrix注射装置，将VIPCC和凝血酶(US-B-7,125,569中所述)同时注射(总体积为约200-300μl，两者体积接近)到IVD L₂-L₃和L₄-L₅中，以形成固体凝胶。

在每次注射前，将极少量(存在于针尖处)的按1∶10稀释的造影剂注射进IVD间隙，以查实准确的应用部位(注射少量造影剂，以使得椎间盘间隙留下足够的空间容纳注射的活化VIPCC)。

图8显示了对照样本(A，生理盐水)和注射活化的VIPCC(B)的荧光自显影图。造影剂在注射活化VIPCC的IVD中变为不可见。

在注射程序后，采集照片和数字视频记录。

术后护理：在术后头两天，动物接受非甾体镇痛药(30mg/kg安乃近)和抗生素(0.02ml/kg麻佛微素)。动物留院14天，监控观察步行活动(例如站立、行走)、饮食方式和行为特征。

在观察期间，动物饮食正常。在头6天，动物醒来的能力得到改善。动物表现出后腿无力，行走时肢腿交叉。到了第6天，动物能够平稳行走。在观察期间，未检测到发烧。在第13天时，动物体重为77.5kg(增重4.5kg)。

样本采集：将动物在术后14天宰杀，取出腰椎用于组织学分析。

分离的注射后腰椎未表现出周围组织损伤或发炎的症状(图9)。

根据上述方法(实例1)分离注射后的IVD样本，然后在8％的甲酸中脱钙，直到组织足够软化可用于组织学评估。

图10显示了注射生理盐水的对照样本(A)和注射活化VIPCC(B)的脱钙IVD样本。通过苏木素与伊红染色髓核区进行组织学评估。注射生理盐水的对照IVD出现软骨细胞聚集，这些细胞具有典型的坏死性损伤、核固缩以及核溶解(图11A、13A)。注射活化VIPCC的IVD在周边区域出现活软骨细胞群，这些细胞具有典型的空泡化细胞质结构(图11B、13B)。在两个实验组中，髓核中心区都比周边区染色更深(图12A-对照组，图12B-注射活化的VIPCC的组)。对照组中的差异更为明显。着色较浅的周边区域表明具有分散细胞群的正常结构，而着色较深的部分代表坏死细胞。以上所示结果表明注射活化的VIPCC不会引起任何结构变化，并且可以保持软骨细胞组织的典型结构。

实例10：

在体外IVD器官培养中，用活化的VIPCC制备的三维支架对髓核软骨细胞形态和功能的影响。

本实验的目的在于，在分离的IVD内将髓核软骨细胞置于购自Omrix的活化VIPCC构造中时确定其形态和功能。

本实验使用了两块猪腰椎(L1-L6)，一块用来获取细胞，另一块用来获取不含髓核组织的分离IVD。

用实例1中所述的方法灭菌第一块腰椎，再从中间切开椎体，以便可以得到分离的椎间盘。然后，按如下方式获取细胞：使用连接到16G针的1ml注射器，将250μl消化液注射进髓核组织，该消化液在PBS中包含6mg/ml胶原酶和2mg/ml透明质酸酶(Sigma产品目录号分别为C-6885和H-2126)。将包含消化液的椎间盘在37℃下孵育1小时。在孵育期后，吸出经消化的髓核组织，然后使用如下台盼蓝染料排除法评估细胞活力：将80μl台盼蓝溶液(Sigma产品目录号T8154；用PBS将其稀释到0.15％)与20μl细胞悬液混合，再用血球计测定细胞活力。细胞活力定义为活细胞数占总细胞数的比率。在所有实验中，细胞活力都超过了80％。

用电动骨锯将第二块腰椎从椎体中间切开，通过16G针(不使用蛋白水解酶)强力吸出髓核组织(0.2-0.5ml)，以获得不含髓核组织的分离IVD。将上述获取的细胞(通过消化液提取)悬浮于稀释20倍的VIPCC(用添加了上述抗生素的DMEM/Ham’s F12稀释)组分中(每毫升5×105个细胞)，然后通过连接到注射装置(Omrix，IL)的16G针将其与1000IU/ml凝血酶溶液(总体积为约200-500μl，两者体积相等)同时注射到不含髓核组织的IVD中。凝块形成后，将注射后的IVD放在塑料盒内的塑料平台上，该塑料盒预先填充了1cm厚的含抗生素(0.2％青-链霉素混合液)的PBS。以这样的方式提供潮湿环境(IVD不直接接触PBS)。

将注射了细胞的IVD在37℃下孵育2、3或6天。将孵育1小时的IVD用作对照组。孵育后，用解剖刀将椎间盘切成两半，去除髓核区内容物，再用3.7％的甲醛溶液固定至少24小时。然后将其浸泡在PBS中(3次，每次10分钟)。将样本在浓度递增，70％、85％、95％的乙醇中脱水，再用100％的乙醇清洗3次(每次清洗20分钟)，然后用组织透明液(Gadot BiochemicalIndustries Ltd.，产品目录号L80033240)清洗3次，每次30分钟。接着，将样本放入按1∶1混合的组织透明液和石蜡混合物中，在60℃的烘箱中加热2次，每次1小时。再用下列石蜡浸渍法处理样本：60℃加热2小时；60℃加热过夜；60℃加热2次，每次2小时。然后，将组织包埋在充满热石蜡的塑料组织包埋盒中，再放置在4℃下冷却。

将石蜡包埋的组织以8μm的厚度连续切片，然后用如前所述的阿尔新蓝对硫酸软骨素进行染色。按照制造商说明，用核固红(Sigma产品目录号8002)进行复染。

图14示出了置于三维支架中的髓核细胞的形态以及软骨细胞硫酸软骨素的生成，该三维支架由稀释20倍的VIPCC和凝血酶混合物在分离的椎间盘内形成。在注射程序后1小时、3天和6天，使用倒置荧光显微镜进行组织学评估。

对照组表现出在细胞周围环境中未表达硫酸软骨素(图14A)。从第3天起可见硫酸软骨素的表达。在注射后第3天(图14B)和第6天(未示出)，在整个凝块和细胞周围都明显出现显著的硫酸软骨素表达。第6天，在细胞周围区域可见一大空间，这明显是由细胞数量增加造成的，细胞数量的增加引起了蛋白水解酶的分泌，最终引起构造的溶解(未示出)。

另外，结果表明在注射后的所有时间点，软骨细胞在由活化的VIPCC形成的三维支架中始终呈现出典型的圆形表型(图14B)。

这些结果表明活化的VIPCC可支持注入椎间盘的髓核细胞的生长和功能，从而使细胞能够维持其球状野生型形态以及生成硫酸软骨素。

实例11：

使用可注射的活化VIPCC恢复椎间盘高度。

髓核能够抵抗压缩负荷，而纤维环能够经受张力并提供机械强度(Revell et al“Tissue engineered intervertebral disc repair in the pig usinginjectable polymers”.J Mater Sci Mater Med.2007；18：303-308)(Revell等人，使用可注射的聚合物对猪进行组织工程化椎间盘修复，《材料科学与医学材料》杂志，2007年，第18期，第303-308页)。以下实例示出了使用购自Omrix的活化VIPCC抵抗压缩负荷并基本上保持椎间盘初始高度的能力。使用电动骨锯将猪腰椎体从中切开，以得到分离的椎间盘。然后，使用电动砂光机磨平分离的椎间盘，以产生光滑、平行对称的上下表面。将分离的椎间盘放在拉压试验机(LF plus，LLOYDinstruments Ltd，Hampshire，UK)中，通过逐步增加负荷(25-500N)测量压缩。

测量各椎间盘在10N负荷下的压缩，以确定初始样本高度，接着测量在25-500N下的压缩。然后，通过注射如实例10中所述的消化液，将椎间盘清空。再将两个连接有16G针的注射器在分离的IVD的相对端处刺入，将至多2ml PBS注入IVD。清空、填充椎间盘间隙数次，然后弃去IVD内容物。后一操作进行三次。使用约2ml EDTA(10mM，Riedel-de-Haen产品目录号34549)重复该操作一次。随后，测量清空的椎间盘在逐步增加的负荷下的压缩。500N下的压缩视为最大压缩可能值。用16G针穿刺清空的椎间盘两次，从而共计产生4个16G孔。

使用Omrix注射装置将PBS或VIPCC和凝血酶(以等体积同时施加，Omrix biopharmaceuticals LTD IL)注射到经穿刺和清空的椎间盘中。将溶液注入现有的穿刺孔中，直到多余的溶液溢出注射位点。将重新填充的椎间盘在室温下孵育大约30分钟。孵育期后，对填充的椎间盘在不同的负荷下进行压缩测量。所有测量均重复5次。

图15显示了在对未处理的椎间盘、清空的椎间盘以及重新填充的椎间盘(PBS或VIPCC和凝血酶)增加外力负荷下的椎间盘压缩百分比。根据以下公式，结果表示为具体负荷下的压缩差值(未处理的椎间盘在10N负荷下的压缩-重新填充的椎间盘在X N负荷下的压缩)除以最大压缩可能值：

图16示出注射了活化的VIPCC或PBS的椎间盘高度恢复情况。结果基于图15中所示的测量值(500N下的压缩)。根据如下公式，结果表示为在相同实验中未处理的椎间盘在500N负荷下最大压缩可能值(100％)的百分比：

结果表明在所有实验组中增大施加给椎间盘的力都会造成椎间盘压缩程度变大。注射了活化的VIPCC的椎间盘的压缩行为随增大的力变化，这与未处理的椎间盘类似。

结果还表明与注射了PBS的椎间盘相比，注射了活化的VIPCC的椎间盘恢复了其初始高度。

这就清楚说明了活化的VIPCC可以发挥维持正常椎间盘高度的作用，并能如天然髓核一样抵抗压缩负荷。