马铃薯离体培养一步成苗培养基及其优化方法及成苗方法

摘要

本发明公开了一种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗，所述一步成苗培养基以MS培养基为基础培养基，并在1L MS培养基中，补加不同浓度和组合的6-苄氨基嘌呤，萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，而后经愈伤组织诱导直接分化不定芽和不定根，一步获得马铃薯再生植株。本发明无需将初代培养基中诱导获得的愈伤组织转接于分化培养基中再生成苗，与离体培养多步再生成苗相比，其步骤简化，培养周期短，重复性好，成苗率高。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种马铃薯离体培养一步成苗培养基，应用该培养基使马铃薯试管苗叶片一步成苗的方法，相应地，本发明也提供了一种优化该培养基的方法。

背景技术

马铃薯(Solanun tuberosum L.)是重要的粮、菜、饲料和工业原料兼农作物，在我国农业生产中占有相当重要的地位。为了创新种质资源，组织培养技术被广泛的应用于马铃薯育种研究中，并取得了显著成果。

植物组织培养一般是采用脱分化、再分化芽和生根壮苗等几个培养程序，称为多步成苗。为了简化培养程序，提高培养效率，人们研究建立了一种一步成苗的新方法。一步成苗又称一次成苗或直接成苗，是指外植体在一种培养基上同时完成脱分化和再分化过程，直接分化出完整植株的培养方法。组织培养一步成苗，已在烟草、小麦、水稻、大豆、棉花、辣椒等方面均有报道。目前以马铃薯叶片、茎段、叶柄、根等多种外植体进行了的再生植株培养，均采用多步成苗培养。其具体技术实施方案为：将马铃薯试管苗的叶片、茎段、叶柄、根等的外植体进行愈伤组织培养，诱导30d左右后进行愈伤组织的继代培养，再将愈伤组织转接分化培养基中再生植株，多步培养途径烦琐、再生率普遍较低且诱导时间较长。该一步成苗方法具有再生周期短，繁殖系数和再生频率高，易操作，培养程序简单等优点，马铃薯离体培养一步成苗未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的一个目的是优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化成苗，提高了马铃薯试管苗叶片愈伤组织的再生效率、缩短了培养时间、简化了操作步骤，为马铃薯优良种苗复壮快繁和品种改良提供了一条有效途径。

本发明的另一目的是提供一种马铃薯离体培养一步成苗培养基。

本发明的再一目的是利用上述马铃薯离体培养一步成苗培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培养方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：一种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗，包括以下步骤：

(1)以不加任何激素的MS培养基作为对照，采用三因素三水平的L₉(3⁴)正交试验设计，在MS培养基中，添加不同浓度的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的不同组合，配制成马铃薯离体培养一步成苗培养基，其中6-苄氨基嘌呤浓度为：1.5mg/L、2.0mg/L和2.5mg/L，萘乙酸浓度为：0.1mg/L、0.2mg/L和0.4mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸浓度为：0.0mg/L、0.1mg/L和0.2mg/L；将所得的不同激素组合的培养基置于培养瓶中；

(2)将马铃薯试管苗叶片接种在步骤(1)所述不同激素组合的培养基中；

(3)将步骤(2)所得的接种后培养基置于温度为22±2℃条件下，全黑暗培养7～10天后进行16h/d光照培养，光强为2000lx；

(4)光照培养20d后，统计愈伤组织诱导率及愈伤组织的形成情况，光照培养40d后统计愈伤组织分化率及成苗状况；

(5)分析步骤(4)所得的实验数据，以质优、量多、高分化率及成苗状况良好所对应的愈伤组织诱导培养基为优化的培养基。

一种马铃薯一步成苗培养基，使马铃薯试管苗叶片一步成苗离体培养，所述一步成苗培养基以MS培养基为基础培养基，并在1L MS培养基中，还需补加如下组分，并使各组分的终浓度如下：

6-苄氨基嘌呤           1.5～2.5mg/L；

萘乙酸                 0.1～0.4mg/L；

2，4-二氯苯氧乙酸                   0～0.1mg/L。

较佳地，所述的马铃薯一步成苗培养基，以1L MS培养基计，补加的各组分的终浓度为：

6-苄氨基嘌呤             2.0mg/L；

萘乙酸                   0.4mg/L。

利用所述的马铃薯一步成苗培养基，使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培养方法，包括如下步骤：

(1)、提供所述马铃薯离体培养一步成苗培养基，并进行灭菌处理；

(2)、选取来源一致的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取顶端完全展开的叶片约0.5cm×0.5cm，以叶片背面贴于步骤(1)所述的培养基上；

(3)、将步骤(2)所得的接种后培养基置于温度为22±2℃条件下，全黑暗培养，7～10天后进行16h/d光照培养，光强为2000lx；

(4)、光照培养40d后，得马铃薯再生植株。

本发明的有益效果为：本发明所述的马铃薯离体培养一步成苗培养基和应用该培养基使马铃薯试管叶片离体培养一步成苗的方法，叶片外植体在形成愈伤组织后，不需要转移到分化培养基上，而是直接在原培养基上分化成苗，该方法具有再生周期短，繁殖系数和再生频率高，易操作，培养程序简单等优点，为马铃薯优良种苗快速繁殖及品种改良提供一条有效途径。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步描述和说明。

本试验以川芋10号马铃薯品种的脱毒试管苗为供试材料，由四川农业大学农学院马铃薯研究与开发中心提供。

MS培养基由成都科龙化工试剂厂生产；

萘乙酸(NAA)，6-苄氨基嘌呤(6-BA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)均为市售分析纯化学试剂。

所需激素的配制方法：

6-苄氨基嘌呤(6-BA)：配制浓度为1mg/ml，称取0.1g 6-苄氨基嘌呤用少许1NHCL溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，待用；

萘乙酸(NAA)：配制浓度为0.5mg/ml，称取0.05g萘乙酸用少许无水乙醇溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，待用；

2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)：配制浓度为1mg/ml，称取0.1g 2，4-二氯苯氧乙酸用少许1N HCL溶解后用蒸馏水定容至100ml容量瓶中，待用。

实施例1：

一种优化马铃薯离体培养一步成苗培养基的方法，该培养基使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗，包括以下步骤：

以不加任何激素的MS培养基作为对照，采用三因素三水平的L₉(3⁴)正交试验设计，在MS培养基中添加不同浓度和组合的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸，配制成10组不同的马铃薯一步成苗培养基。各组中，含有的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸的浓度及组合见表1

表1具有不同激素组合物的马铃薯一步成苗培养基正交实验设计L₉(3⁴)

对上述10种马铃薯一步成苗培养基进行灭菌处理，并取适量置于培养瓶中；

选取来源一致的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取顶端完全展开的叶片，并切取约0.5cm×0.5cm大小叶片，以叶片背面贴于所述马铃薯一步成苗培养基上；每瓶接种6个外植体，每个组合接种8瓶；接种后培养基置于温度为22±2℃条件下，全黑暗培养，7-10天后进行16h/d光照培养，光强为2000lx；光照培养20d后，由表2可知愈伤组织诱导率，即产生愈伤的外植体数/接种外植体数×100％，及愈伤组织的形成情况。在原培养基中继续光照培养40d后得愈伤组织分化结果(见表3)，即分化芽的愈伤块数/总愈伤块数×100％，及成苗状况。

表2不同激素组合对叶片愈伤组织诱导的影响

注：+越多表明愈伤组织量越多(下同).

表3不同激素组合对叶片不定芽分化的影响

分析表2所得的实验数据可知，除对照组外，各组马铃薯一步成苗培养基均能较好的诱导马铃薯叶片形成愈伤组织，其诱导率均达到80％以上，第3，6，7，8，9组，诱导率达到90％以上；而第2，3，4，5，6，8，9组均有较好的愈伤质量，其中，第3，8，9组的愈伤质量最好。再分析表3中数据可知，第3，5，9组中的愈伤组织未能分化成芽，而在第2，4，6，8组中，第2组和第4组中的愈伤组织的分化率较差，出芽天数最长，丛生芽数量少而长势较差，第6组和第8组的分化率较好，出芽天数较短，以第6组分化率最好，出芽天数最短，丛生芽数量多而长势较好。

再结合表1分析第2，4，6，8组所对应的培养基中的各激素的浓度和组合，其中，6-BA在第2，4，6，8组中的浓度依次为1.5mg/L，2mg/L，2mg/L，2.5mg/L；NAA在第2，4，6，8组中的浓度依次为0.2mg/L，0.1mg/L，0.4mg/L，0.2mg/L；2，4-D在第2，4，6，8组中的浓度依次为0.1mg/L，0.1mg/L，0mg/L，0mg/L；综上可知，能够使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培养基组分为：以MS培养基为基础培养基，并在1L MS培养基中，还需补加的组分及各组分的终浓度为：

6-苄氨基嘌呤                 1.5～2.5mg/L；

萘乙酸                       0.1～0.4mg/L；

2，4-二氯苯氧乙酸            0～0.1mg/L。

再结合表1分析第6组所对应的培养基中的各激素的浓度和组合，可知，最佳的马铃薯一步成苗培养基的组分为：1L MS培养基中，含有终浓度为2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤和终浓度为0.4mg/L萘乙酸。

实施例2

为了避免人为因素所造成的实验结果的误差，本申请人请不同的研究人员在相同条件下，利用与实施例相同的马铃薯一步成苗培养基，进行了与实施例1相同的实验操作，其实验结果见表4和表5。

表4不同激素组合对叶片愈伤组织诱导的影响

表5不同激素组合对叶片不定芽分化的影响

分析表4所得的实验数据可知，除对照组外，各组马铃薯一步成苗培养基均能较好的诱导马铃薯叶片，其诱导率均达到85％以上，第3，4，6，8，9组，诱导率达到100％；而第3，4，5，6，8，9组均有较好的愈伤量，其中，第6，9组的愈伤量最好。再分析表5中数据可知，第3组中的愈伤组织未能分化成芽；而在第4，5，6，8，9组中，第4和第5组分化率太低，丛生芽数量少而长势较差；第9组出芽天数太长，丛生芽数量少；以第6，8组的分化率较好，出芽天数较短，丛生芽数量多而长势较好，以第6组分化率最好，出芽天上最短，丛生芽数量最多，芽的长势最好。

再结合表1分析第4，5，6，8，9组所对应的培养基中的各激素的浓度和组合，其中，第5组分化率和出芽率均极低，可以视为实验误差，因此，该组所对应的培养基中的各激素的浓度可以不计。6-BA在第4，6，8，9组中的浓度依次为2mg/L，2mg/L，2.5mg/L，2.5mg/L；NAA在第4，6，8，9组中的浓度依次为0.1mg/L，0.4mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L；2，4-D在第4，6，8，9组中的浓度依次为0.1mg/L，0mg/L，0mg/L，0.1mg/L；综上可知，能够使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培养基组分为：以MS培养基为基础培养基，并在1L MS培养基中，还需补加的组分及各组分的终浓度为：

6-苄氨基嘌呤          1.5～2.5mg/L；

萘乙酸                0.1～0.4mg/L；

2，4-二氯苯氧乙酸     0～0.1mg/L。

再结合表1分析第6组所对应的培养基中的各激素的浓度和组合，可知，最佳的马铃薯一步成苗培养基的组分为：1L MS培养基中，含有终浓度为2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤和终浓度为0.4mg/L萘乙酸。

综上可知，实施例1和实施例2的结果基本相同，具有较好的重复性。

实施例3

利用所述的马铃薯一步成苗培养基，使马铃薯试管苗叶片离体培养一步成苗的培养方法，包括如下步骤：

(1)、配制马铃薯一步成苗培养基：1LMS培养基中，加入2.0mg 6-苄氨基嘌呤和0.4mg萘乙酸，进行灭菌处理，待用；

(2)、选取来源一致的马铃薯无菌试管苗，无菌条件下，切取顶端完全展开的叶片约0.5cm×0.5cm，以叶片背面贴于步骤1所述的培养基上；

(3)、将步骤(2)所得的接种后培养基置于温度为22±2℃培养箱，全黑暗培养，7～10天后进行16h/d光照培养，光强为2000lx；

(4)、培养60d后，得马铃薯再生植株。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。