抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法

摘要

本发明涉及抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法。其包括以下操作步骤：(1)用牙龈卟啉单胞菌国际标准菌株培养分离取得牙龈卟啉单胞菌；(2)获取牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白；(3)以牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原与福氏不完全佐剂混匀成静脉注射剂，对产蛋母鸡鸡翅下静脉注射，收集所产鸡蛋；(4)提取鸡蛋中的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白。本发明生产成本低，产出率高，一个鸡蛋可以获得100毫克的卵黄免疫球蛋白；该方法操作简便快捷，并具有耐热、耐酸、稳定性好等优点。在温度不高于75℃和在pH4以上的酸性环境中，仍能很好地保持其生物学活性，常温下可以储存3个月左右，4℃可以保存6-12个月而抗体活性不下降。

说明书

技术领域

本发明属于一种生物制剂的制备方法，具体涉及抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法。

背景技术

慢性牙周炎是最为常见的口腔疾患之一，不仅是导致人类失牙的主要因素之一，还是一些系统疾病的危险因素。有报告称牙周炎患者发生冠心病和中风的几率分别为牙周正常者的1.4倍和2.1倍；牙周炎会增加呼吸道病原菌在患者咽部的定植，发生慢性肺部感染及肺功能降低的几率是口腔卫生良好者的2倍；患重症牙周炎的孕妇，发生早产和低体重儿的危险性是牙周正常孕妇的7.5倍；糖尿病患者中慢性牙周炎发病率明显增高；急性或亚急性感染性心内膜炎患者中有30％与牙源性感染有关；细菌产生大量的内毒素并进入血液，可诱发或加重动脉粥样硬化，引发心瓣膜炎甚至缺血性心脏病。究其原因，可能是慢性牙周炎累及多个牙，感染的面积大，创口开放，细菌及产生的毒素随血液循环系统进入并定植在其他器官，引起的病变；同时因患牙松动，咀嚼时将牙向根尖部压迫而将微生物及毒素挤压到血管和淋巴管中，使得牙周组织中的细菌持续性感染刺激宿主的免疫反应。革兰阴性厌氧菌---牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)以及其他革兰阴性厌氧菌是慢性牙周炎病变区及活动部位的主要优势致病菌，是公认的慢性牙周炎优势致病菌之一，与牙周炎的发生、治疗后复发或病情加重密切相关。

目前，牙周炎的治疗主要包括基础治疗、药物治疗和牙周手术等。常规的洁治、刮治和翻瓣术只能暂时控制菌斑，消除炎症，阻止病变加重，在中度牙周炎治疗中有较好的效果。但重度牙周炎由于其牙周袋结构的复杂性导致刮治器械进入困难、难以彻底清除龈下致病菌。龈下刮治术对于医师的临床操作要求较高，医师必须经过系统性的长期培训后才能有效的清楚菌斑，消除炎症。这对基层医院和基层医师在相当长的一段时期内还是需要解决的难点。在慢性牙周炎外用治疗药物中，主要是防腐剂和抗菌缓释剂，如氯已定含漱液和盐酸米诺环素软膏，但是此类药容易产生细菌耐药和毒副作用，不宜长期使用。日本学者Yokoyama等[1]用纯化后的牙龈素免疫母鸡，结果发现抗牙龈素的卵黄免疫球蛋白(IgY)可明显抑制牙龈素对人类上皮细胞的降解，阻止细胞基质的破坏；进一步的临床研究显示卵黄免疫球蛋白(IgY)软膏有助于洁刮治和根面平整后的临床症状改善和减少牙龈卟啉单胞菌的数量[2]。Hamajima[3]使用抗重组的40kDa的牙龈卟啉单胞菌381外膜蛋白的卵黄免疫球蛋白能有效抑制Pg菌在口腔细菌上的共聚集。但是，采用特异性卵黄免疫球蛋白生物制剂治疗慢性牙周炎在国内尚未见到相关研究和有关产品报道。对穿入组织内的致病菌而言，单纯的基础治疗难以完全杀灭，往往辅助抗生素治疗。然而，抗生素频繁给药极易造成细菌耐药，且具有毒副作用。

卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk，IgY)是鸡蛋卵黄中的多克隆抗体，具有耐热、耐酸碱、制备成本低，易于商品化等突出优点。

发明内容

为了寻找一条有效安全的治疗慢性牙周炎的途径，本发明提供一种抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法。

本发明利用牙龈卟啉单胞菌制成抗原免疫良种鸡，从其所产蛋中制备出抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)，研发高效无毒，易于标准化制备的卵黄免疫球蛋白牙周袋生物疫苗制剂，依托工业化生产，试图开辟生物抗体防治牙周炎的新途径。

本发明抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法包括以下操作步骤：

(1)牙龈卟啉单胞菌的培养和鉴定

用牙龈卟啉单胞菌国际标准菌株培养分离取得牙龈卟啉单胞菌备用；

(2)获取牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白

将分离出的牙龈卟啉单胞菌在牛脑心浸液(BHI)羊血液体培养基中37℃，80％氮气(N₂)、10％二氧化碳(CO₂)、10％氢气(H₂)增菌厌氧培养48h，收集细菌，超声震碎至90％细胞完全破碎，4000r/min×10min离心，收集上清液，即为牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原，温度4℃保存备用；

(3)蛋鸡免疫

选5个月龄的未免疫的健康罗曼产蛋母鸡，隔离饲养；以1mg/ml牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原1ml与福氏不完全佐剂1ml吹打混匀成油包水状静脉注射剂，对上述产蛋母鸡鸡翅下静脉注射，每只鸡注射量为0.5mg；每周注射免疫一次，共注射免疫4次；同时，收集每天产下的鸡蛋，温度4℃保存；

(4)提纯抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)

用卵黄免疫球蛋白纯化系统试剂盒(EGG stract^TM IgY Purification System，Promega公司，美国)提纯每天产下鸡蛋的卵黄免疫球蛋白，所述试剂盒包括试剂盒A液和试剂盒B液，具体操作如下：

a、将蛋黄和蛋清分开，收集蛋黄，缓慢加入蛋黄3倍体积的试剂盒A液，搅拌5min，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，收集上清液；

b、在上清液的中加入1/3体积的试剂盒B液，搅拌5min，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，弃上清液，用无菌PH值7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀处理，取得沉淀物；

c、在沉淀物中加入1/3体积的试剂盒B液，搅拌5min，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，弃上清，用无菌PH值7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)重悬沉淀，获得高纯度的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白，4℃保存；

抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白的相对分子质量约为180，所含的2个亚单位即65～70的重链和22～30的轻链。卵黄免疫球蛋白不激活补体，与哺乳动物间种系发生距离大，不会发生免疫球蛋白间的交叉血清学反应，从而避免了免疫检测过程中产生的假阴性或假阳性结果。卵黄免疫球蛋白具有耐热、耐酸以及一定的抗酶降解的能力。4℃贮存5年或室温下放置6个月，其抗体活性几乎不受影响；将其溶解于生理盐水中且于4℃贮存6～7年，抗体活性降低不超过5％；但在温度超过75℃以后，卵黄免疫球蛋白则出现变性。当pH值大于3时，其抗体活性无明显影响，尤其在pH值为5～7时相当稳定；当pH值小于3时，其抗体活性明显下降。此外，卵黄免疫球蛋白还具有耐高渗的性能和较好地耐反复冻融的特性。

以抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白为主要成分，制备有效浓度为1mg/ml的凝胶。在临床使用时，由医师制作成长度×宽度×厚度＝0.2cm×0.1cm×0.2mm的凝胶薄膜，放置在牙周袋的袋底且不使该凝胶薄膜滑出牙周袋，每周1次，共4周。

本发明方法制备的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗较现有的疫苗的优势如下：对于牙龈卟啉单胞菌免疫治疗的研究集中在主动免疫和被动免疫两方面。用于人工主动免疫的制剂大部分是由病原微生物制成的，被称为疫苗。预防牙周炎疫苗的研究类型包括：灭活死疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗、基因工程疫苗等，这些疫苗已用于动物实验，并获得了一定的成功。有学者在动物实验中将牙周致病菌的全菌细胞、外膜成分或合成多肽用于主动免疫，结果显示牙周炎的发展可以通过主动免疫而被阻断。Klausen[4]等用部分纯化的牙龈卟啉单胞菌菌毛免疫鼠，证实菌毛具有高度的免疫原性，且T细胞反应也在菌毛免疫后显著增加。由于高纯度疫苗提纯构建十分因难，有不少学者转向进行被动免疫预防牙周炎的研究。人工被动免疫具有产生作用快的优点，但由于该免疫力非自身免疫系统产生，易被清除，故免疫作用维持时间较短。Okuda[5]等用提纯的牙龈卟啉单胞菌的血凝素蛋白免疫兔，然后将获得的兔的抗血清反复接种于感染了牙龈卟啉单胞菌的仓鼠的牙周，观察发现免疫鼠的牙龈卟啉单胞菌的数量较对照组大大减少。

通过皮下注射牙龈卟啉单胞菌(Pg)蛋白抗原，母鸡可产生相应的特异性抗体并可从血清传递到蛋黄中，即为抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)。它具有以下几大优势：

1)免疫蛋白经母鸡转化，对人的毒性已经大大降低。卵黄免疫球蛋白不激活补体，是一种很有前途、安全的抗体疫苗。

2)利用母鸡作为生物发生器，生产成本低，产出率高，同时环保，一个鸡蛋可以获得100毫克的卵黄免疫球蛋白，远远高于其他动物生产的抗体，从而使疫苗的价格大大降低，为疫苗的广泛应用提供了可能。

3)提纯简便快捷，并具有耐热、耐酸、稳定性好等优点。在温度不高于75℃和在pH4以上的酸性环境中，仍能很好地保持其生物学活性，常温下可以储存3个月左右，4℃可以保存6-12个月而抗体活性不下降，适合长期保存和运输。

4)由医师操作给药，患者可有很好的依从性。操作简单易学，便于在基层开展慢性牙周炎的防治工作。

本发明抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗，高效无毒，无副作用，辅以蛋白质抗体稳定剂的生物制剂，将具有广阔的临床应用前景和产业化前景。

附图说明

图1为本发明技术路线图，

图2为抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)纯化前后的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析图，

图3为抗原免疫后抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白随时间的吸光度值变化曲线图，

图4为抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白制剂在动物模型上使用4周后的临床效图，

图5为无菌磷酸盐缓冲液在动物模型上使用4周后的临床效果图，

图6为抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白制剂在动物模型上使用4周后组织切片图，

图7为无菌磷酸盐缓冲液在动物模型上使用4周后的组织切片图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明。

实施例：

抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：

(1)牙龈卟啉单胞菌的培养和鉴定

将牙龈卟啉单胞菌国际标准菌株ATCC 33277用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)0.2ml充分溶解后，接种于牛脑心浸液(BHI)羊血琼脂固体培养基，37℃，80％氮气(N₂)，10％二氧化碳(CO₂)，10％氢气(H₂)厌氧培养7～10天。观察菌落形态进行鉴定。牙龈卟啉单胞菌具有黑色、凸起、有光泽、表面光滑的典型菌落形态，革兰氏染色阴性，细菌呈球杆菌或短杆菌。保存分离出的牙龈卟啉单胞菌备用。

(2)获取牙龈卟啉单胞菌菌体蛋白

将分离出的牙龈卟啉单胞菌在牛脑心浸液(BHI)羊血液体培养基中37℃，80％氮气(N₂)，10％二氧化碳(CO₂)，10％氢气(H₂)增菌厌氧培养48h，收集细菌，超声震碎至90％细胞完全破碎，4000r/min×10min离心，收集上清液，即为牙龈卟啉单胞菌全菌可溶性蛋白抗原，4℃保存备用。

(3)蛋鸡免疫

选5个月龄的未免疫的健康罗曼产蛋母鸡共8只，隔离饲养。以1mg/ml牙龈卟啉单胞菌全菌蛋白与1ml福氏不完全佐剂吹打混匀成油包水状，对母鸡鸡翅下静脉注射，每只鸡翅下0.5mg/ml。每周以相同方式再次免疫，共免疫4次。同时，收集每天产下的鸡蛋，4℃保存。

(4)提纯抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)

用卵黄免疫球蛋白纯化系统试剂盒(EGG stract^TM IgY Purification System，Promega公司，美国)提纯每天产下鸡蛋的卵黄免疫球蛋白，该试剂盒包括试剂盒A液和试剂盒B液，操作如下：

a、将蛋黄和蛋清分开，用针尖划破蛋黄腐衣，收集蛋黄于烧杯中，称蛋黄的净重(1g蛋黄等同于1ml体积)。缓慢加入3倍体积的试剂盒A液，搅拌5min后，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，收集上清。

b、测量上清的重量，加入1/3体积的B液，搅拌5min后，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，弃上清，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)重悬沉淀。

c、测量重悬后的液体重量，加入1/3体积的B液，继续搅拌5min后，冷冻离心机4℃条件下离心10000r/min×15min，弃上清，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)重悬沉淀可获得高纯度的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白疫苗。加入硫酸庆大霉素使其浓度达5μg/ml以防止细菌污染，即4℃保存。

(5)抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)的聚丙烯酰胺凝胶电泳

(SDS-PAGE)分析

制备聚丙烯酰胺凝胶板，将纯化前后的特异性卵黄抗体进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。上样量为10μl，电泳后凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，脱色后观察(见图2)。在凝胶板上可见2条清晰条带，分别为相对分子质量为65000的重链和25000的轻链。由此可证明已经成功的从鸡蛋中提取出特异性的抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(IgY)。

(6)间接酶联免疫吸附剂测定实验(ELISA法)检测抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)滴度

用牙龈卟啉单胞菌抗原以10μg/ml包被96孔板，4℃过夜，次日用pH 7.4的0.05％无菌磷酸盐洗涤液(PBS-Tween20)洗涤5遍，5％小牛血清封闭12h，洗涤，扣干。用无菌磷酸盐缓冲液将免疫后每隔5天提纯的卵黄免疫球蛋白倍比稀释(从1:10开始，共8个浓度组)后每孔加100μl，37℃孵育1h；洗涤扣干后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白(HRP-IgG，浓度为1∶10⁵)100μl，37℃孵育1h。邻苯二胺37℃避光显色15min，2mol/L硫酸终止反应，在酶标仪上读取A450值。无菌磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)为空白对照。绘制吸光度变化曲线图。由曲线图(见图3)发现初次免疫后第5天开始产生特异性抗体，随着时间的推移，抗体滴度逐渐上升，至免疫后第50-55d达到高峰，效价达1∶10⁵。

(7)抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)抑菌试验

a、牙龈卟啉单胞菌在牛脑心浸液(BHI)羊血琼脂培养基中后，挑取数个典型菌落混悬于牛脑心浸液(BHI)羊血液体培养基37℃，80％氮气(N₂)，10％二氧化碳(CO₂)，10％氢气(H₂)厌氧培养48-72h进行扩增；

b、用无菌的磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)对抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白进行稀释，将其浓度调整为4.0mg/ml，2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml 0.0mg/ml。取100μl各浓度组抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白加入无菌的96孔细胞培养板中，每个浓度组做3个复孔；

c、盐酸米诺环素、小牛血清、无菌磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.2)作为阳性对照组、阴性对照组和空白组，调配浓度为4.0mg/ml，2.0mg/ml，1.0mg/ml，0.5mg/ml 0.0mg/ml。每组各浓度分别取100μl加入无菌的96孔细胞培养板中，每组每个浓度做3个复孔进行对比实验。

d、取牙龈卟啉单胞菌菌液100μl加入到各孔中。将96孔细胞培养板置37℃，80％氮气(N₂)，10％二氧化碳(CO₂)，10％氢气(H₂)厌氧培养48-72h。

e、取出96孔细胞培养板，紫外分光光度计读取A450值，由吸光度值对比各孔的抑菌效果。实验结果表明抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白(抗Pg-IgY)对牙龈卟啉单胞菌的抑菌效果稍次于盐酸米诺环素，较小牛血清和无菌磷酸盐缓冲液有明显的抑菌作用，且在1--2mg/ml具有最佳抑菌浓度。

f、动物实验：用无菌磷酸盐缓冲液(PH7.2)将抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白配制成浓度为1mg/ml的抗体药液，供动物实验使用。

选SD大鼠10只，人工制备慢性牙周炎模型。丝线结扎法+牙龈卟啉单胞菌龈沟内接种+高糖饮食处理大鼠双侧上、下颌第1磨牙，待出现了牙龈红肿、易出血和牙石、牙周袋等不同程度的牙周炎表现后开始实验。具体分组如下：

实验组：造模+牙周袋内使用抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白制剂

对照组：造模+牙周袋内使用无菌磷酸盐缓冲液(PH7.2)冲洗

模型组：造模

分别在治疗前、治疗后每周观察记录结果，4周后处死动物，指标如下：

大体观察：包括大鼠的体重，大鼠的一般状态

临床指标：牙龈指数，菌斑指数，探诊出血指数，松动度

其他检查：影像学检查，组织学检查

通过4周的观察记录，可发现实验组较对照组有明显的疗效。实验组大鼠在使用抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白制剂后探诊出血指数明显下降，菌斑指数也较对照组下降。组织学检查也可证明抗牙龈卟啉单胞菌卵黄免疫球蛋白制剂在慢性牙周炎治疗上的效果，(见图4-7)。

参考文献

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