用于研究粒子和肺部的相互作用的装置

摘要

本发明涉及一种用于研究粒子在呼吸道的气血屏障中的溶解的配置和方法。一种用于仿真传递到呼吸道的气血屏障中粒子的相互作用的装置，该装置包括：灌注室(10)，用以接收并传递灌注液体流；半透膜(205)，其在一侧上覆盖有屏障层(204)，用以与粒子相互作用；及第一薄片组织(202)，该组织的一面分布有粒子。为仿真在灌注液体沿膜(205)流过灌注室(101)时粒子在气血屏障中的溶解，膜(205)布置为流体接触于灌注流体，而第一薄片组织(202)布置为接触膜(205)的屏障层(204)。沿该膜设置灌注流体流能够更为精确地仿真气血屏障的自然过程。

说明书

技术领域

本发明针对涉及对悬浮粒子怎样与肺部相互作用的改进，该改进包括用于仿真干粉药物在肺部的溶解率的装置和方法。

背景技术

对于干粉气雾剂，所吸入药物的效果的关键因素是溶解入肺液。缓慢的溶解能够被用作增加药物在肺部的持续时间的策略。但是，缓慢溶解又可能导致相当部分的所吸入粒子随黏膜纤毛升降而被重分配到消化道或者由肺泡巨噬细胞吞噬并且在它们的消化器官中被潜在地降解(Lundborg，Falk et al.1992)。测量可溶解粒子在肺部中的溶解非常困难。对于溶解更快的物质，必须采用间接方法，比如吸入给药后在循环系统中出现溶质。缓慢溶解的粒子，比如一些粒子放射性核，在从收集的肺部组织中回收粒子后进行定量分析。若干方法已经被提出用于仿真肺部中的固态粒子的溶解率。这些方法中的大部分意图用于具有低溶解性的不溶的核的源于环境因素的复杂粒子。实例如放射性粒子(Kanapilly，Raabe et al.1973)、矿物粒子或纤维(Johnson1994)。但是，在最近，提出了过滤器法用以仿真药物在肺部中的溶解率(Daves和Feddah，2003)。药物粒子沉积在玻璃纤维过滤器上，并且然后被置于过滤器盒中。在溢流构造中清洗该过滤器并重复分析单次通过的洗出液中溶解的药物。但就发现更为精确的、可靠的并且生理学上正确的模型来研究药物粒子的相互作用及在肺部组织中的溶解而言仍有改进的空间。

发明内容

在本说明书中，术语“气血屏障”指空气与呼吸道的组织之间的界面。典型地，传导动脉的粘膜组织和肺部的小泡组织是气血屏障的实例。

本发明的最通用的形式是用于研究粒子与肺液和肺部细胞的相互作用的装置。该装置包括：灌注室；半透膜；及具有分布有粒子的面的薄片组织。

灌注室用以接收并传递灌注流体流。在一侧上覆盖有屏障层(barrierlayer)的半透膜布置成流体接触于灌注流体。装置还包括第一薄片组织，该薄片组织具有分布有粒子的面，并布置为接触于膜的屏障层。屏障能够构成用以类似于或仿真肺部上皮细胞的天然膜的或者物理化学屏障或生物屏障。在本配置中，物理化学屏障构成有多糖胶体以仿真气道黏液，并构成有磷脂散布以仿真上皮细胞的脂质膜。在另一个实例中，上皮细胞的生物屏障被添加到胶体层以能够研究屏障中的均衡活性传输机制。在一个方面中，屏障是与灌注流体等渗并用以接收粒子的胶体。在一个实施方式中，胶体可能包括磷脂散布。在另一个实施方式中，胶体包括另外配置有包括磷脂或适当的两性脂质的多个单层(比如十层)以仿真在肺部的黏液外膜层顶部的表面活性剂层。在另一个提供生物屏障的方面中，设置上皮细胞作为屏障层以能够在屏障中进行均匀的活性输送机构。

灌注室包括用于建立灌注流体进入/流出灌注室的流体连接的装置，优选地，在室中设置定距环用于输送流体。灌注流体沿整个膜流过灌注室以仿真对于从肺部中的粒子分离出的溶质的溶解和吸收。灌注流将接收通过屏障层和膜的溶解的和散布的制剂并且然后被输送离开用于随后的分析。

与其中灌注流体趋于流过膜的方案相比，一个重要的特性在于灌注流趋于沿覆盖有粒子的膜流动。灌注流体沿膜的流动更精确地仿真气血屏障的自然过程。

灌注室另外包括上薄片组织，即，盖体玻璃。灌注室优选地包括：第二上薄片组织；在一侧上附接到第二上薄片组织的第二上薄片组织及在另一侧上的所述膜；在一侧上附接到所述膜的下定距装置和在另一侧上的所述板。上定距装置优选地设置有用于输送流入和流出的灌注流体的通道。在一个优选实施方式中，所述室从上部观察基本上是圆形，而比如基本上矩形的另外的形式也能够想象得到。装置的膜优选地由具有微孔结构的多糖制成，微孔直径和微孔面积的部分能使扩散物快速通道而阻止流体通过膜的显著对流运动。在一个优选实施方式中，膜由于多糖制成并具有直径约为0.01μm到1μm的微孔。但是，能够选择其它的膜材料、微孔尺寸、及运行状态通过用于溶解的不同制剂来针对不同的大气粒子调节装置。

优选地采用第一薄片组织以使能够用光学检测器研究溶解。屏障层或者是用以类似于或仿真肺部中的上皮细胞的天然膜的物理化学屏障或生物屏障。在一个方面中，屏障是胶体，该胶体与灌注流体等渗并被用以接收粒子。在一个实施方式中，胶体是多糖胶体，该胶体包括散布的磷脂。在另一个实施方式中，胶体包括散布的磷脂，该散布的磷脂另外设置有包括磷脂或适当的两性分子脂的多个单层(比如十层)的界面以仿真肺部的黏液外膜层顶部上的表面活性层。在另一个方面中，设置了生物屏障，在胶体层的膜上培植了单层上皮细胞以仿真活体肺部上皮细胞并设置用于研究屏障中的均匀活性输送机制的装置。大气粒子优选地从气雾剂型的流束而分布在板上。优选地，气雾粒子的尺寸在0.3μm到10μm的范围内，并包括至少一个药物活性组分。可选地，大气粒子通过板曝露于包括大气粒子的环境而分布在板上。灌注流体通常用以以类似于自然的血液流的方式与屏障层相互作用。更为具体地，灌注流应该是生理可接受的流体，其具有适应于胶体层的等渗性的等渗性并且如果使用包括活性细胞的屏障，其与细胞类型兼容。本领域技术人员能够发现许多可用于器官灌注的类血流体，这些类血流体能用于本发明的应用，并能另外通常容许肝素化全部血液作为可想像的灌注流体。在本发明的特别的实施方式中，灌注流体包括散布的两性分子脂质，比如磷脂和缓冲溶液，比如白蛋白缓冲溶液。

在另一方面，本发明涉及用于研究粒子在肺部的溶解的配置，其包括：前述的装置；光学检测器装备；用于收集灌注流部分的装置和用于将所述装置固定到固定的结构的装置。优选地，固定装置包括：带有用于将灌注流体引导进入和离开室的连接管的上部；用于将膜固定在上定距装置的中部；及用于施压薄片组织的下部，其具有相对于膜的分布有大气粒子的面。

在本发明的再一个方面中，涉及制备前述装置的方法，包括如下步骤：提供用以接收并传递灌注流体流的灌注室，该灌注室具有半透膜构成的壁；用胶体层覆盖半透膜膜；反转所述设备；使所述胶体层与所述第一薄片组织接触，大气粒子分布在其接触面上；将所述第一薄片组织固定到所述膜。可以通过使用楔形机构进行接触并固定，使膜以垂直运动而朝向固定的第一薄片组件位移以最小化对于粒子的初始分布图样的任何干扰。

在再一个方面中，本发明涉及研究大气粒子之间的相互作用的方法，该方法包括如下步骤：提供粒子的空气流束的取样；提供采用前述配置的前述装置。该方法另外包括：提供灌注流体流至所述灌注室，同时检测来自粒子的空气流束的制剂的溶解，收集并分析灌注流体的取样。能够采用光学检测器用于检测以记录粒子的溶解，可选地同时采用数字图像分析或任何类似技术进行。

本发明有利地允许确定所期望的粒子制剂溶解率，这对于分析和评估通过呼吸系统给药的受试药具有显著的重要性。受试药在气血界面(即，呼吸系统的黏膜)中的行为因此能够通过分析结果得到的灌注液而被仔细地可视地/光学地、重量测定地和化学地分析。另外能够预期受试药在循环系统中出现的时间。因此，可以总结出，本发明提出了用于快速地分析通过呼吸系统给药的适当的固体药物及评估效果的形成的有力工具。

附图说明

图1示出了根据本发明的配置的示意图。

图2示出了灌注室的更详细的视图。

图3示出了具有灌注通道的灌注室的视图。

图4示出了固定装置的更为详细的视图。

具体实施方式

图1示出了根据本发明的用于体外研究粒子203在肺部中的溶解的配置，该配置包括：灌注流室101；计算机控制注射泵102；及具有高解晰度摄像机的倒置显微镜103，用于记录粒子203的图像105。在流动室101的下游侧，灌注液被收集在计算机化部分的收集器104中。

穿过该室的流动仿真了黏膜的生理学过程并且构建成交叉流动(图2)。在实验中，黏膜建模被限定于两个平行的盖片201和202之间的550μm的空间。药物粒子203沉积在12mm的下盖片202的顶部。药物粒子203接触于仿真支气管黏膜的上皮细胞层的50μm的胶体层204。胶体层位于仿真气道黏膜的基底膜的10μm多糖膜205。在多糖膜205上方是500μm厚的灌注流室101。灌注流室101的灌注流沿整个膜205从一侧流动到另一侧。灌注液在室中的驻留时间仅为数秒。这意图仿真血液在紧接在气道黏膜中的基底膜下的丰富的毛细血管袢中的短暂的通过时间(Laitinen，Laitinen et al.1989)。上定距装置207被用于将上盖片从膜205分离并形成灌注流室101。另外，下定距装置208被用于将膜205从下盖片202分离。

图3是定距装置207中采用的用于灌注液的灌注室101的水平视图，示出了入口和出品通道301。灌注流室101的水平横截面具有基本上圆形的形式。

灌注液组分在多糖膜205的另一侧上与胶体204等渗。例如，灌注液的基本组分是白蛋白缓冲剂，其中能够添加磷脂以增加向亲脂溶剂的萃取能力。

灌注流体流动室101具有12mm的直径和0.5mm的厚度，这提供了56μL的容积。50μm的胶体层204具有5.7μL并且多糖膜205的透过部是1.1μL，总计提供了63μL的屏障容积。作为对比，非患病人群中的人体支气管上皮中的气血屏障的厚度从气管的60μm变化到细支气管的5μm到8μm。由此，装置中的屏障厚度对应于气管上皮。黏膜的良好灌注部的总的厚度在上气道中具有估计为约200μm(2001，Gerde & Scott)。装置的总计厚度约为510μm。

为用装置制备样品，能够通过使用在《Inhalation Toxicology》2004，16，42-52中由P Gerde et al所述的改进喷粉器使粒子203沉积在玻璃盖片202上。三个盖片在一起组合成三角形并将掩膜它们的1mm的周长以防止粒子沉积在未直接接触于胶体层的面上。修改的气溶胶保持室及三角形玻璃盖片保持器能够制成允许在一个气溶胶生成循环的时间均匀沉积在三个玻璃盖片上。

当运行图1和图2所述的配置时，溶出度测量包括下面的主要步骤：

1.制备灌注液和胶体层204。

2.气溶胶生成并沉积在玻璃盖片202上。

3.启动灌注流室101和胶体层204。

4.在显微镜103下进行溶出度试验。

5.对显微镜检测的记录进行图像分析。

6.对洗出的灌注液进行化学分析。

灌注液是基于带有混合于磷脂的白蛋白缓冲剂以增加向亲脂溶剂的析出能力。亲脂溶剂将进行彻底的超声处理以实现稳定的散布。在位于灌注器的悬浮体将保持悬浮直到被泵入灌注流室101时，这具有关键的重要性。磁搅拌器被布置在灌注室中以使亲脂溶剂在位于灌注室时保持悬浮。胶体204由多糖悬浮体制成(1989，Gerde & Scholander)。将测试的有若干不同类型的屏障，细胞悬浮体。一个将要测试的细胞类型是A549。

用于覆盖盖片203的气溶胶用《Inhalation Toxicology》2004，16，42-52中由P Gerde et al描述的系统生成以由气溶胶为各盖片产生近似10μg的涂层。盖片被一次三件地放置入专门的保持器。生成之后，气溶胶通过盖片保持器并且进入总的过滤器。将设计不带阀的新的保持室以最大化沉积在盖片上的加载的干粉的部分。采用当前的室，3mg所加载的干粉中有大约3×10μg沉积在盖片上。

在所准备的带有灌注室101的装置中，多糖膜205被伸展在适当的位置。在灌注流已经连接并且室101中的残留气泡被移除之后，施加胶体层204。通过吸液或雾化器将胶体层204施加于散布的磷脂。通过对计算机存储的溶出过程的显微照片进行图像分析计算出溶出度曲线。初始的沉积在屏障204中的粒子体203的量在溶出试验之前通过重量的确定。

图4示出了用于包括灌注流室101的装置的固定装置。图中仅示出用于入口流402的连接。但是，附图对于出口流也是有效的。固定装置包括：带有用于入口灌注流和出口灌注流的连接402的上屏障组件部401；用于将膜205固定于上屏障组件部401的下屏障组件部403。组件部401和组件部403设置有用于伸展膜205的伸展装置405和密封装置405。

一旦已经将料子盖片202置于它的安装到显微镜台的保持器400，则启动自动控制程序来进行测量。显微镜的焦点被手动地调节并且然后控制程序获取粒子205的预接触图像。屏障组件401、403被下沉到粒子盖片202上，并且在接触之后马上记录初始的后沉积图像。然后记录第一组图像105以确定溶出率。依据这些初始图像的变化率，采用数据收集方案以给出溶出过程的足够良好的时间精度。

使用反转显微镜103和高解析度的数字摄像机对溶出过程进行光学检测。带有沉积的粒子205的粒子盖片202被置于安装到显微镜台的专用保持器400上。粒子205将被置于焦点并且带有胶体204的灌注室101将被置于粒子盖片202上方的引导柱上。在粒子205与胶体204接触之前记录若干图像。在接触之后，记录一系列快速图像105以确定溶出过程的速率。然后记录足够的常规图像105以确定整个溶出过程。全部图像105存储在计算机上并且强化对比以更容易地标出粒子203。通过作为时间的函数计算与粒子相关的像素的消失而确定溶出。用不同的计算模型以将像素消失与粒子的溶出连接起来。

还可以使用另外形式的光学检测。这样的方法能够基于用光源照明带有分布的粒子203的粒子盖片202并通过研究照明光的反射或折射来确定溶出率。

在光学检测溶出率的同时，通过使用部分收集器104收集流出灌注流室101的单遍灌注液测量吸收率。取样间隔被调整为能够给出吸收过程的足够的精度。溶出曲线和吸收曲线将依据相同的时间轴进行描绘。另外粒子盖片能够易于进行重量测定分析以进一步研究与化学分析的相互关系并且由此能够获得粒子溶出过程和吸收过程的更为完全的图片。