八角科植物“孩儿莲”的组织培养繁殖方法

摘要

本发明公开了一种八角科植物“孩儿莲”的组织培养繁殖方法。它以“孩儿莲”当年生枝条顶端的萌动芽组织培养繁殖的外植体，先在乙醇溶液中进行表面处理，再在HgCl

说明书

技术领域

本发明涉及一种八角科植物“孩儿莲”的组织培养繁殖方法，具体涉及“孩儿莲”组织培养过程中的外植体种类选择、初代培养方法、继代培养方法及其培养基成分。

背景技术

八角科(Illiciaceac)为单属科植物，全世界约50种，我国有28种和2个变种，主要分布于我国西南部至东部地区；它们为常绿小乔木或灌木，有香气，喜阴湿环境，多生长于林间溪水边；花两性，腋生或近顶生，红色，花被片为7～21枚，花期一般在4～6月，具一定的观赏价值。八角科植物主要靠种子繁殖，其果实大多有毒，如莽草、红茴香和地枫皮等八角科植物的果实都具有一定毒性，致使此类植物在园林绿化上的应用受到了环境安全因素的限制。

珍稀观赏植物“孩儿莲”为八角科八角属(Illicium Linn.)植物，常绿小乔木，树高约3～8m，树冠倒卵形；树皮灰褐色，单叶互生或近轮生，披针形，叶片革质化程度高，对折易断，枝叶具特殊香味；花形莲花状，花色红润，花期在4～5月，开花时，花色红润，呈倒挂莲花状，如同微小的灯笼，数朵挂于枝头，镶嵌于绿叶之间甚是美丽，具有很高的园林观赏价值。尤其是“孩儿莲”在苏州地区迄今未观察到其正常结果现象，从而可以避免人畜误食果实而造成中毒的缺陷，可广泛应用于街道、公园的绿化和庭院美化。

据《太湖备考》一书记载：“孩儿莲，木似桂，花如棋子大，色状与莲花同，花不香，挼其叶嗅之，辛芬似茴。吴中向无此种，顺治间东山翁汉津为云南河西县令，携归，后为席氏所有，珍为奇品。第花布结子，根无萌芽，欲传其种不可得，……”。虽然“孩儿莲”传入江浙地区已有300多年的历史，但其资源极其匮乏，人工栽种的极少，目前，在苏州地区仅存数株成年树，堪称珍稀树种。这是由于“孩儿莲”不结果实，无法收获种子；嫁接缺少砧木，扦插繁殖成活率很低，无性繁殖困难，导致一苗难求，这些都限制了“孩儿莲”在园林绿化上的应用。

近年来，植物组织培养技术在观赏植物上的应用越来越广泛，尤其是在自然繁育率低的植物上的应用备受人们重视，在木本植物的组培快繁方面也已经有了一系列的成功报道，但在八角科植物中迄今未获成功，前人对“孩儿莲”组织培养的关键技术环节也没有进行过系统研究，其组培过程中诸如外植体污染严重、离体芽生长停止、易褐化枯死等问题没有得到有效解决。

发明内容

本发明的目的是提供一套适用于八角科植物“孩儿莲”组织培养的外植体种类、灭菌处理方法、初代培养方法、继代培养方法及其培养基成分，解决“孩儿莲”外植体容易污染、“烂芯”及褐化等难题，为珍稀植物“孩儿莲”的快速繁殖提供有效的技术支持。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案是：一种八角科植物——“孩儿莲”的组织培养繁殖方法，为离体组织培养，包括如下步骤：

1)以“孩儿莲”当年生枝条顶端的萌动芽为起始材料，经洗涤液浸泡、流水冲洗工序洗净后，在室内晾干，用作组织培养繁殖的外植体；

2)将上述外植体在浓度为体积比70～75％的乙醇溶液中进行5～6秒钟的表面处理后，在浓度为重量体积比0.1％的HgCl₂溶液中进行5～6分钟的杀菌处理，再用无菌水充分清洗5～6次，完成对外植体的消毒灭菌处理；

3)从上述消毒灭菌后的枝条上切取芽片，接种到初代培养基上，在每天光照12～15小时，光照强度为1500～2000LX、温度为23℃±1℃的条件下培养，待新叶萌发后转移到继代培养基上继续培养，得到发育正常的组培苗。

所述的初代培养基为White培养基+500mg.L^-1抗褐化剂PVP+6-BA 2.0mg.L^-1+NAA 0.5mg.L^-1，添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3％，琼脂粉浓度为初代培养基的0.6％；调节pH为5.6～5.8。

所述的继代培养基为White培养基+500mg.L^-1抗褐化剂PVP+6-BA 2.0mg.L^-1+NAA 0.1mg.L^-1，添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3％，琼脂粉浓度为初代培养基的0.6％；调节pH为5.6～5.8。

本发明与现有技术相比具有下列优点：

1、本发明使用的植物材料为“孩儿莲”，它在某些地区表现为只开花不结果，这与其他八角科植物果实大多有毒的情况不同，采用本发明技术方案提供的“孩儿莲”组培苗，可作为一种观赏植物新品种，在园林绿化中的应用具有更好的安全性。

2、本发明提出的技术方法具有简便易行、可操作性及重现性好的特点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例：分别采用“孩儿莲”当年生枝条顶端的未萌动芽和萌动芽为起始材料，进行对比试验。将上述两种材料经洗涤液浸泡、流水冲洗后，分别用浓度为体积比75％的乙醇溶液中进行5秒钟的表面处理后，在浓度为重量体积比0.1％的HgCl₂溶液中进行6分钟的杀菌处理，最后用无菌水清洗5～6次，置滤纸上吸干多余水分，在芽体下侧切取外植体接种于培养基。

培养结果是，“孩儿莲”未萌动芽的培养效果较差，易产生内源性污染，褐化率较高为22.2～46.9％，而存活率较低，仅为2.8～6.2％。其次，在采用萌动芽为外植体的场合，用0.1％HgCl₂溶液灭菌处理3分钟时，污染率高达100％；灭菌时间为9分钟时，虽然未见污染，但芽体茎尖死亡率达33.3％，褐化率达50.0％；而灭菌6分钟时，污染率仅为8.3％，存活率可高达91.7％。由此表明，“孩儿莲”萌动芽更适用于组培快繁的外植体材料，有利于建立无菌培养体系。

以MS(Murashige & Skoog，1962)为基本培养基，附加不同浓度的抗褐化剂PVP、6-BA和NAA作为初代培养基进行比较试验。其中培养基I为MS+500mg.L^-1抗褐化剂PVP+6-BA 2.0mg.L^-1+NAA 0.5mg.L^-1，培养基II为1/2MS+500mg.L^-1抗褐化剂PVP+6-BA 2.0mg.L^-1+NAA 0.5mg.L^-1，培养基III为B5培养基+500mg.L^-1抗褐化剂PVP+6-BA 2.0mg.L^-1+NAA 0.5mg.L^-1，培养基IV为White培养基+500mg.L^-1抗褐化剂PVP+6-BA 2.0mg.L^-1+NAA 0.5mg.L^-1；各培养基均添加蔗糖和琼脂粉，按重量体积比，蔗糖浓度为初代培养基的3％，琼脂粉浓度为初代培养基的0.6％；调节pH 5.6～5.8。

培养结果是，外植体在培养基I、II中的生长状况较差，褐化率在90％以上；在培养基III、IV中，生长状况良好的外植体占80％以上，褐化率较低。在培养基I、II、III中，外植体下部切口都产生愈伤组织，只有培养基IV中的外植体下部切口不产生愈伤组织，且生长状况良好的外植体比率达到了90.9％，表明培养基IV比较适合用于“孩儿莲”离体芽的初代培养，在继代培养中也得到了相似的培养结果。

在继代培养基中，分别添加500mg.L^-1和1000mg.L^-1抗褐化剂PVP，以不添加PVP作为对照，比较不同处理后的外植体褐化情况。结果表明，当不添加PVP时，外植体下部切口全部褐化，继而蔓延到整个外植体；当添加1000mg.L^-1PVP时，外植体下部切口及其本身褐化率虽有降低，但其生长发育不良；当添加500mg.L^-1抗褐化剂PVP时，外植体下部切口及其本身褐化率都很低，且生长发育良好。因此，添加500mg.L^-1的抗褐化剂PVP对外植体具有较好的抗褐化效果，且对离体芽培养的生长发育几无影响。