一种菌株耐药性的快速测定方法

摘要

本发明公开了一种菌株耐药性快速测定的方法，其包括以下步骤：A.制备含有噻唑蓝的培养液；B.制备菌悬液；C.制备抗生素溶液；D.将上述含有噻唑蓝的培养液、抗生素溶液、菌悬液加入到培养板的孔中，系列稀释抗生素溶液；E.实时扫描测定，根据扫描结果测定菌株对抗生素的耐药性。与现有技术相比，本发明具有的优点是可简单、快速、经济、高效地测定菌株的耐药性。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种菌株耐药性的快速测定方法，特别是涉及一种采用扫描获得的菌株生长曲线而快速测定菌株对抗生素敏感性的方法。

背景技术

目前世界卫生组织认为，随着抗生素的滥用，所有主要的传染病病原都会逐渐对药物产生抗性。耐药菌产生之快、传播之迅速、耐药率之高已经引起了世界性关注。菌株的耐药性不仅使药物疗效减弱，还会使药物失去疗效，导致病人死亡率升高。菌株耐药性的研究已成为当今的一个世界性热点。快速、简便地测定菌株耐药性是控制耐药菌的关键所在，可及早发现耐药菌、阻断耐药菌传播、尽量缩小耐药菌危害，具有非常重要的意义。

目前耐药菌的检测方法有纸片扩散法、肉汤稀释法和琼脂稀释法、自动化药敏仪、Etest法和耐药基因检测。其中普遍采用的纸片扩散法，通过测量抑菌环直径并比照美国临床实验室标准化委员会的标准进行判定是否耐药。该方法价格便宜、操作简便，是世界卫生组织推荐的标准方法，但是该方法花费时间长，无法测定生长缓慢的微生物，还可能存在感染危险。肉汤稀释法和琼脂稀释法是将抗生素倍比稀释在肉汤或琼脂中，定量测定最低抑菌浓度的方法。该方法可准确定量最低抑菌浓度，但是该方法耗时、费力，尤其对于大批量菌的耐药性测定，工作量太大。自动化药敏仪，通过检测浊度或荧光指示剂的荧光强度或底物水解反应来判定结果。该方法快速，适合大量检测，但是需要昂贵的药敏仪，无法在基层广泛普及。Etest法，原理是在一条塑料条背面吸附有浓度连续变化的抗生素，其表面是相应的抗生素浓度刻度；当Etest条放在已接种了一定浓度细菌的特定药敏培养基上后，抗生素立即释放至琼脂中，呈单一方向扩散；经一定时间孵育后产生一椭圆形的抑菌环，抑菌环与Etest条交界处的刻度即为该菌株的最低抑菌浓度。该方法操作简易、结果准确、不需昂贵仪器，但是Etest条价格相当昂贵，也不适合大批量检测。耐药基因检测原理是根据耐药基因设计相应的特异引物，采用PCR方法直接检测耐药基因，确定被检菌是否具有耐药性。目前已经有几种菌的耐药基因研究得比较多，开发出了耐药基因检测方法，但是对于大多数菌来说，还无法采用该方法。

因此，本领域需要一种快速、方便并可大批量检测菌株耐药性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测菌株耐药性的方法，应用这种方法，可快速、简便地检测菌种的耐药性，确定该菌种的抗生素谱，为临床上确定采用何种药物治疗提供参考。

为实现上述目的，本发明提供了一种菌株耐药性的快速测定方法，其包括如下步骤：

A.制备含有噻唑蓝的培养液；

B.制备菌悬液；

C.制备抗生素溶液；

D.将上述含有噻唑蓝的培养液、抗生素溶液、菌悬液加入到培养板的孔中，系列稀释抗生素溶液；

E.实时扫描测定，根据扫描结果测定菌株对抗生素的耐药性。

由于只要有活菌存在，经过培养就能使噻唑蓝产生蓝色物质，因此可根据吸收峰，确定抗生素敏感性和最低抑制浓度。例如，以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的时间-吸收曲线。如有相应软件，可直接采用软件，制作生长曲线。

在上述培养板上，可设置一个阴性对照，即不加菌悬液；还可再设置一个阳性对照，即不加入抗生素。

本发明所述的菌株耐药性的快速测定方法将噻唑蓝显色用于测定菌株在含有抗生素的培养液中的生长情况。该方法与浊度法相比，具有更好的特异性；与荧光法相比无需特殊仪器。工艺步骤E优选使用酶标仪扫描以测定菌株在培养液中的生长情况，其与传统方法相比，操作更简便，使用的试剂更少、更经济。

本发明提供的菌株耐药性的快速测定方法是通过菌株在培养液中的生长情况，判定其对抗生素的敏感性和最低抑制浓度。

本发明适宜于菌株耐药性的快速测定，测定的菌株的耐药性为确定该菌种的抗生素谱、确定采用何种药物治疗提供参考。

在本发明方法中，可针对待测菌株的类别，设计抗生素。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌有两套不同的抗生素设计。

使用本发明的菌株耐药性的快速测定方法能够简单、快速、高效地大量测定菌株的耐药性，筛选出耐药菌，确定菌株的抗生素谱。

本方法测定的原理是，在培养板的每孔中，加入含有噻唑蓝(MTT)的培养液和各种不同浓度的抗生素，并将菌悬液接种到各孔中后，进行培养。抗生素对菌株不产生抑制时，随着培养时间加长，孔中活菌数量增加，MTT被细菌的琥珀酸脱氢酶利用后产生蓝色Fomazan颗粒，扩散到培养液中，随着细菌数量的增加，培养液的蓝色逐渐加深，该过程用酶标仪进行实时扫描，测定各孔的吸收值，做时间-吸收曲线，曲线中吸收峰的产生与细菌是否生长直接相关。针对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，可选用不同的抗生素。该方法操作简便，快速，经济，且可以使用酶标仪进行扫描，无需特殊仪器。

本发明所述的菌株耐药性的快速测定方法是将噻唑蓝显色用于测定菌株在含有抗生素的培养液中的生长状况。该方法与浊度法相比，具有更好的特异性；与荧光法相比无需特殊仪器。上述步骤A中的培养液优选为脑心浸液培养液；步骤D中的系列稀释的稀释梯度为10倍梯度；步骤E优选使用酶标仪进行扫描，以测定菌株在培养液中的生长情况。扫描后可将测定时间作为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的时间-吸收曲线。如有相应软件，可直接利用软件，制作生长曲线。本发明的测定方法与传统方法相比，操作更简便，使用的试剂更少、更经济。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌在含不同浓度的阿莫西林培养液中的生长曲线图谱。

图2为阪崎肠杆菌在含不同抗生素的培养液中的生长曲线图谱。

具体实施方法

根据本发明的菌株耐药性的快速测定方法的一个实施方案，该测定方法包括如下步骤：

A.将噻唑蓝用PBS配置成5±0.5％的储备液，灭菌，约4℃冰箱保存。将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液，使其终浓度达到0.1±0.05％，灭菌，约4℃冰箱保存备用；

B.制备1-10CFU/ml的菌悬液；

C.制备抗生素溶液；

D.将178±20μl含有噻唑蓝的脑心浸液加入到培养板的每一孔中，并加入菌悬液20±5μl，然后加入抗生素2±1μl，系列稀释抗生素溶液，抗生素溶液的最终浓度为系列浓度，如0.1、1、10和100μg/ml系列浓度，10^-5、10^-4、10^-3、10^-2、10^-1、1、10和100μg/ml系列浓度等；

E.用酶标仪采用动力学测定模式进行扫描测定，测定波长为520nm；根据扫描结果确定菌株对抗生素的耐药性。

在分析扫描结果时，可采用分析菌株生长曲线的方式来确定菌株对抗生素的耐药性，如以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的时间-吸收曲线，然后分析。

利用本发明的测定方法可以快速检测一种菌株对多种抗生素的敏感性，例如一个96孔板，一次可以检测一种菌株对23种抗生素的敏感性，当菌株为革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)时，所述抗生素可以为阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林、呋喃妥因、复方新诺明、红霉素、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、利福平、诺氟沙星、青霉素、庆大霉素、四环素、头孢噻吩、头孢噻肟、头孢唑林、万古霉素、亚胺培南、氯霉素、阿米卡星、复方磺胺甲恶唑或替考拉宁；当菌株为革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)时，所述抗生素可以为氨苄西林、哌拉西林、优立新、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢哌酮、头孢三嗪、头孢他啶、头孢噻肟钠、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、呋喃妥因、四环素、复方新诺明、泰能、氨曲南或舒普深。

下面，结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，这些实施例只用于举例说明本发明，并非用于对本发明的限定。

实施例1

以金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的例子。将噻唑蓝用PBS配置成5％的储备液，灭菌，4℃冰箱保存。将噻唑蓝储备液加入脑心浸液培养液，使其终浓度达到0.1％，灭菌，4℃冰箱保存备用。将178μl含有噻唑蓝的脑心浸液加入到96孔培养板的每一孔中。配制金黄色葡萄球菌(菌株IQCC22004)菌悬液，使其浓度达到10CFU/ml数量级，将20μl菌悬液加到微孔中。其中，A、B、C三行为三个重复，A1、B1、C1为空白对照，加入2μl无菌水；A2、B2、C2为加入了2μl浓度为100mg/ml的阿莫西林溶液，使其终浓度为1mg/ml；依次类推A3、B3、C3～A11、B 11、C11为阿莫西林浓度100μg/ml～10^-6μg/ml；A12、B12、C12为未加入阿莫西林的阴性对照。盖上微孔板盖子，将微孔板放入酶标仪中，培养温度设定为36℃，测定波长为520nm，使用动力学测定模式(Thermo公司multiskan speetrum酶标仪SkanItso软件)，每隔30分钟测定1次，连续测定8小时。以测定时间为X轴，以吸收值为Y轴，作每孔的时间-吸收曲线。由于只要该菌株对抗生素敏感，经过培养，该菌株无法生长，不能产生蓝色，仪器测定无吸收峰；如果该菌株对抗生素不敏感，经过培养，则该菌株能使噻唑蓝产生蓝色物质，仪器测定产生吸收峰。因此可根据出现吸收峰的孔的情况，确定阿莫西林对该菌株的最低抑制浓度。

从图1可见，A1、B1、C1～A6、B6、C6不出现吸收峰，A7、B7、C7开始出现吸收峰，A8、B8、C8～A11、B11、C11和阴性对照出现吸收峰。由此可见，金黄色葡萄球菌对阿莫西林敏感，其最低抑制浓度为0.01μg/ml。

实施例2

以阪崎肠杆菌作为革兰氏阳性菌的例子。将178μl含有噻唑蓝的脑心浸液加入到96孔培养板的每一孔中。配制阪崎肠杆菌(菌株IQCC 10424)菌悬液，使其浓度达到10CFU/ml数量级，将20μl菌悬液加到微孔中。两个孔重复试验。A1、A2为阴性对照，加入20μl无菌水代替菌悬液；A3、A4为空白对照，加入2μl无菌水代替抗生素。A5、A6，A7、A8为0.1μg/ml、0.05μg/ml万古霉素，以下依次类推，A9、A10～H11、H12为苯唑西林、头孢唑林、头孢泊肟、头孢噻吩、青霉素G、头孢西丁、阿莫西林、氨苄西林、亚胺培南、培氟沙星、庆大霉素、羧苄西林、奈替米星、头孢噻肟、头孢尼西、呋南妥因、复方新诺明、环丙沙星、头孢他啶、诺氟沙星、四环素、妥布霉素溶液。其余步骤同实施例1。

从图2可见，除了B9～B 12、E9～E 12、G9～G12对应的抗生素处理：青霉素G、头孢噻肟、头孢他啶，其余抗生素处理的孔中生长曲线的吸收峰相对于空白对照均出现了不同程度的减弱，可见，该菌株对青霉素G、头孢噻肟、头孢他啶具有抗性，而其余抗生素则对该菌株具有不同程度的抑制。例如A5～A8对应的万古霉素，浓度高的A5、A6处理，吸收峰相对于空白对照出现了明显降低，浓度低的A7、A8处理则与空白对照吸收峰相似，可见万古霉素对阪崎肠杆菌菌株(ATCC29544)有一定的抑制作用，但其浓度需达到0.05μg/ml以上。

与现有技术相比，本发明具有的优点为：可简单、快速、经济、高效地测定菌株耐药性。