优化的重组人骨形态发生蛋白-2的DNA序列及其编码蛋白的制备和用途

摘要

本发明涉及优化的基于大肠杆菌表达系统的重组人骨形态发生蛋白-2的DNA序列及重组人骨形态发生蛋白-2的制备。具体地，本发明提供了优化的、适合大肠杆菌表达系统的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)的DNA序列，高效生产rhBMP-2的方法，以及有关的工程菌的构建、rhBMP-2的表达和纯化的工艺。与表达未经优化的原hBMP-2基因相比，本发明的优化的hBMP-2基因在大肠杆菌工程菌中的rhBMP-2表达量提高了50％。此外，本发明还提供了复性效率更高、分离纯化得率更高的长链型rhBMP-2的制备方法。

说明书

技术领域

本发明涉及了基因工程领域。更具体地，本发明涉及优化的基于大肠杆菌表达系统的重组人骨形态发生蛋白-2(Recombinant human bone morphogeneticprotein-2，rhBMP-2)的DNA序列，一种高效生产rhBMP-2的方法，以及有关的工程细胞的构建、rhBMP-2的表达和纯化的工艺。

背景技术

骨折延迟愈合及骨不连、骨缺损的修复一直是骨科领域悬而未决的重大问题。长期以来，骨缺损的修复主要采用自体骨移植、同种异体骨移植和采用生物材料和制品进行替换、修复三种治疗方法。自体骨受来源数量限制，且取骨手术至少存在10％的外科并发症，植入后需要较长时间的爬行替代过程；异体骨存在不同程度的免疫排异反应及潜在的病源传播危险。因此，具有特殊功能的生物材料和制品在临床上备受关注。尽管目前已经有不少的生物材料在临床上获得使用，但传统生物材料的成骨活性不足和/或降解性不理想严重影响了其在临床上的使用效果。

对骨生长和修复有明显促进作用的生物活性细胞因子——骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)，为骨不连、骨缺损的治疗提供了新的方法。BMP既是多功能形态发生因子，同时又具有突出的诱骨成骨活性，具有巨大的基础研究价值和广阔的临床应用前景。

早在1965年，美国医师Urist首先发现脱钙的骨基质中存在着具有异位诱导成骨作用的物质，即骨形态发生蛋白BMP。到目前为止，已发现二十种BMP，分别命名为BMP-1，BMP-2，…。BMPs(除BMP-1以外)属于转化生长因子(transforming growth factor-beta，TGF-β)超家族。BMP在胚胎发育时就存在，不仅在胚胎早期参与调节多种器官的发育和细胞的定向分化，在生后仍能诱导机体内的间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨细胞，在骨和牙齿的生成发育和创伤修复中发挥重要作用。骨折后骨愈合过程中局部BMP的表达水平明显增高，并且局限于骨折骨痂形成区。将BMP植入软组织内，可异位诱导新骨的形成，这已被用作考察BMP活性的一个依据。

BMP-2是所有骨生长因子中对骨形成促进作用最强的生长因子，对其结构与功能的研究也最为深入。天然人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是一种疏水性非胶原酸性糖蛋白，不溶于水，易溶于高浓度的尿素和盐酸胍。由于BMP-2蛋白的非水溶性特性，给其分离、提取以及重组表达产品纯化带来困难。BMP-2分子上有一疏水核，有30％的酸性氨基酸，其pI为5.0左右。BMP-2蛋白一级结构中含有非常保守的七个半胱氨酸残基，组成三对链内二硫键和一对链间二硫键桥，这对于维持分子的天然活性构像具有重要作用。若使用还原剂将二硫键打开，其骨诱导活性将完全丧失。成熟的BMP-2分子以二聚体形式存在，由2个单体通过二硫键结合而成，每个活性单体均由114个氨基酸构成，分子量约13KD，含有糖基化位点。

Sampath等对直接从牛骨基质中提取的一种具有诱骨活性的蛋白质进行结构分析，发现经去糖基后，由16KD和14KD多肽组成的二聚体仍有诱骨活性，说明糖基化对活性并非必需。这使采用原核表达系统制备BMP-2成为可能。

在体内，BMP-2首先被合成为分子量较大的前体，前体由信号肽和100-125个氨基酸组成的羧基端(C-端)组成。BMP-2在其羧基C-端部分包括特征性的7个高度保守的半胱氨酸残基，这些残基对于前体互相正确结合成二聚体具有重要作用。当BMP-2的C-端被裂解释放后，2个单体以二硫键相结合发生二聚作用，有活性的同链或异链二聚体BMP-2即被分泌出来。BMP-2前体没有TGF-β1和TGF-β2前体序列所含的Arg-Gly-Asp潜隐性组织识别序列，成熟肽N端富含碱性氨基酸，可使其易于吸附于细胞外基质上，以延长其生物半衰期，充分发挥其诱骨活性或在发育和分化阶段使其形成hBMP-2信号梯度[Bi ochemBiophys Res Commun，2004；318(3)：704]。

BMP-2可从动物组织内提纯(p-BMP2)，也可用基因工程构建重组细胞表达合成(rhBMP-2)。早在1979年Urist[UAnn Thorac Surg，1990；49(6)：864-5]领导的小组率先从兔脱钙骨中成功地分离纯化了兔的BMP-2，于1982年从牛骨中提取出牛骨形态发生蛋白(bBMP)，1987年Urist[Clin Orthop Relat Res.，1987(214)：295-304]建立了一套从人及牛骨中提取BMP的标准步骤。目前，pBMP-2大多从牛、猪、羊、马、兔、鼠等动物的正常骨中提取。

然而，自然界中BMP虽然广泛存在于各种动物的骨组织中，但其含量甚微，每公斤湿重新鲜骨仅含有几微克BMP，且不同来源BMP在理化性质及分子结构上存在较大差别，诱导成骨活性和稳定性也都有所不同。由于骨组织中各种BMP与不溶性非胶原蛋白(insoluble noncollagenous protein，iNCP)紧密结合，很难从中分离出单一的任何一种BMP分子。因此，从动物骨组织中分离BMP，过程繁杂，重复性差，收率低，蛋白纯度不高并且不可避免地存在差异；对BMP的复性要求高，蛋白活性难以维持稳定。同时，这种动物来源的蛋白在人体使用，会引起不同程度的免疫排斥反应和潜在的病源传播危险。因此，完全依靠动物骨提取，难以满足实验和临床应用中的需求量。

利用基因工程方法生产人BMP-2，不仅可保证大量生产，还可避免免疫排斥反应，是极具发展前景和吸引力的方法。自1988年Wozney等获得了牛骨来源的BMP-2基因，并在重组大肠杆菌中成功表达后，基因工程大量生产人的BMP-2也就成为可能(Wozney JM，Rosen V，Celeste AJ，etal，Novel regulatorsof bone formation：molecular clones and activities，science，1988；242(4885)：1525-34)。

目前，用于表达BMP-2基因的系统既有真核，也有原核细胞，两种表达系统各有优缺点。Wozney JM(Wozney JM，Overview of bone morphogeneticproteins，Spine.2002，15；27(16Suppl 1)：S2-8)认为hBMP-2在COS-1细胞中的表达产物具有诱导生成软骨能力，但无诱导成骨的能力。赵明在真核细胞COS和CHO中已经获得具有诱导生物活性的重组人BMP-2。Genetics Institute的Wozney等从人U-20s细胞的cDNA文库中克隆了hBMP-2，结果显示hBMP-2的cDNA全长为1587bp，编码有396个氨基酸的多肽，可在蛋白酶作用下生成有活性的成熟肽[Sugiura T.，Biochem J.1999，338(Pt2)：433-40]，其长度为114个氨基酸。美国专利申请118363中公开了用COS、CHO等哺乳动物细胞表达人rhBMP-2。

由于使用哺乳动物细胞的真核表达系统的表达产物多为分泌型的，有更好的翻译后修饰，可以糖基化，活性相对较高，是BMP基因较理想的表达体系。

真核细胞表达的BMP-2是第一个在体内实验中证明具有诱骨活性的BMP分子。

如将未经纯化的细胞培养液直接植入肌肉内，并不表现诱导活性，必须在纯化后才能显示出与剂量相关的诱骨活性。目前，由Medtromic Sofamor Danek公司采用真核表达系统生产的BMP-2产品--Infuse^TM Bone Graft已用于脊柱融合和骨缺损填充修复。由Stryker Biotech公司采用CHO细胞培养生产的OP-1^Tm Implant(OP-1，又称rhBMP-7)已被FDA批准并开始应用于临床。然而，真核表达系统的缺点是表达率低，生产成本很高，产品价格昂贵，无法满足科研和临床的大量需要。

与真核表达系统相比，原核表达系统易于进行基因操作，表达效率高，细胞外有细胞壁，不如哺乳动物细胞娇嫩，营养要求低，对培养环境的耐受性强，易于培养，生产成本低，具有很强的竞争力。尽管原核表达系统不能使BMP糖基化，表达产物多以包涵体形式出现，且受复性过程难控制、制备工艺相对复杂等问题困扰，但对于BMP的表达，由于糖基化并不是BMP活性的必需条件，无糖基化修饰并不影响它们的生物活性[J.M.Wozney，Science，1988，242：1528-15]。因此，原核表达系统也可用于BMP的表达和生产。

在国外，Kubler NP[Int J oral Maxillofac Surg，1998，27：30]和RuppertR[Eur J Biochem，1996；237：295-302]均在E.Coli中成功表达了hBMP-2完整成熟肽基因。在国内，不同长短的hBMP-2成熟肽基因在E.Coli中也获得成功表达，而且重组hBMP-2具有一定的异位诱导成骨活性。但是国内外的研究机构却因无法进一步进行可重复性的复性和纯化大肠杆菌产生的人全长成熟肽BMP-2，使工作停留在实验室水平(只能得到毫克量)，无法实现产业化。

林松等[生物化学与生物物理学报，1996，28(1)：8]发现hBMP-2愈接近完整成熟肽的长度，其成骨活性愈好。专利CN 01116754.8利用基因重组技术在大肠杆菌中表达制备了具生物活性的截短型rhBMP-2-108蛋白，相应的表达基因长324bp，编码的截短型的rhBMP-2由108个氨基酸组成。该发明虽能实现rhBMP-2的产业化生产，但因生物半衰期短、体内稳定性差而限制了应用。可见，相对于完整成熟肽基因长度的rhBMP-2而言，截短型的rhBMP-2-108蛋白总体生物活性相对较低，影响其对骨折延迟愈合及骨不连、骨缺损等的重建修复效果。

对蛋白进行结构修饰是基因工程领域经常采用的一种方法，包括天然蛋白内氨基酸序列的改变、截短型的构建和长链型的构建等，目的是提高目标蛋白的表达、活性和稳定性等，如长链型IGF-1(insulin-like growth factors-1)等。前期本发明人申请了“长链型重组人骨形态发生蛋白-2及其制备方法和应用”(CN1951964)，以便克服现有技术中复性难、分离难、蛋白活性低且在体内不稳定等造成难以产业化的问题。

此外，基因工程大肠杆菌外源蛋白的高效表达一直是生物技术领域的研究热门，有多种因素影响外源蛋白的表达。多种提高外源蛋白表达的方法中，基因的优化是最重要的手段。

综上所述，虽然已经有rhBMP-2的真核和原核生产方法，但是总体而言生产工艺仍难以令人满意。因此，本领域迫切需要开发适合工业化生产的、基于大肠杆菌表达系统的高效生产活性rhBMP-2的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效表达和生产rhBMP-2的方法。

本发明的另一目的是提供相应的rhBMP-2编码序列、载体、工程细胞以及rhBMP-2的表达和纯化的工艺。

在本发明的第一方面，提供了一种编码人骨形态发生蛋白-2即rhBMP-2的多核苷酸，所述的多核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的rhBMP-2成熟肽，而且所述多核苷酸中具有以下特征：

SEQ ID NO：2中第9位氨基酸的密码子为cgc；

SEQ ID NO：2中第23位氨基酸的密码子为ttt；

SEQ ID NO：2中第34位氨基酸的密码子为gcg；

SEQ ID NO：2中第86位氨基酸的密码子为aaa；和

SEQ ID NO：2中第110位氨基酸的密码子为ggc。

在另一优选例中，所述的多核苷酸与SEQ ID NO：1所示的编码人BMP-2的多核苷酸相比，在大肠杆菌中表达rhBMP-2的表达量提高至少40％，更佳地至少50％。

在另一优选例中，所述多核苷酸中的rhBMP-2成熟肽编码区如SEQ ID NO：4所示。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：4或8所示。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它含有本发明第一方面中所述的多核苷酸。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，所述的工程细胞中含有上述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌。

在本发明的第四方面，提供了一种生产人rhBMP-2的方法，包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养如本发明第三方面所述的工程细胞，从而分泌表达人rhBMP-2，所述的工程细胞是大肠杆菌；

(b)分离纯化出表达的人rhBMP-2。

在另一优选例中，在步骤(b)中，包括从大肠杆菌中分离rhBMP-2包涵体、包涵体的变性、复性以及分离纯化复性后的rhBMP-2。

附图说明

图1 rhBMP-2的基因优化的表达质粒pRB-BMP2-1(4013bp)。

图2 长链型rhBMP-2的基因优化的表达质粒pRB-BMP2-L-1(4061bp)。

图3 rhBMP-2电泳图。

图4 rhBMP-2异位成骨形成的新骨。

图5 长链型rhBMP-2的电泳图。

图6 长链型rhBMP-2异位成骨形成的新骨。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对人的BMP-2的基因序列进行了大量筛选，从而选择出了特别适合在大肠杆菌中表达的优化序列，在此基础上完成了本发明。

人的BMP-2基因和蛋白

人BMP-2成熟肽的基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示：

caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga cac cct

ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att gtg gct ccc ccg

ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct ttt cct ctg gct gat cat

ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct

aag att cct aag gca tgc tgt gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ctg

tac ctt gac  gag aat gaa aag gtt gta tta    aag aac tat cag gac atg gtt

gtg gag ggt  tgt ggg tgt cgt (SEQ ID NO：1)

相应的人BMP-2成熟肽蛋白序列如SEQ ID NO：2所示：

Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro

Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro

Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His

Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Glu Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser

Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu

Tyr Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val

Glu Gly Cys Gly Cys Arg (SEQ ID NO：2，三字符)

QAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR (SEQ ID NO：2单字符)

长链型hBMP-2基因是hBMP-2成熟肽的前体，其cDNA序列如SEQ ID NO：5所示：

aaa cgt cat gat ggc aaa ggc cat ccg ctg cat aaa cgc gaa aaa cgc caa gcc

aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga cac cct ttg tac

gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att gtg gct ccc ccg ggg tat

cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct ttt cct ctg gct gat cat ctg aac

tcc act aat cat gcc att gtt cag acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att

cct aag gca tgc tgt gtc ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ctg tac ctt

gac gag aat gaa aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt

tgt ggg tgt cgt (SEQ ID NO：5)

长链型人BMP-2氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，其中下划线为hBMP-2成熟肽的N端前添加的16个氨基酸序列：

Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg GlnAla Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg His Pro Leu

Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile Val Ala Pro Pro Gly

Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro Phe Pro Leu Ala Asp His Leu

Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Glu Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys

Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr

Leu Asp Glu Asn Glu Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu

Gly Cys Gly Cys Arg (SEQ ID NO：6，三字符)

KRHDGKGHPLHKREKRQAKHKQRKRLKSSCKRHPLYVDFSDVGWNDWIVAPPGYHAFYCHGECPFPLADHLNSTNHAIVQTLVNSVNSKIPKACCVPTELSAISMLYLDENEKVVLKNYQDMVVEGCGCR(SEQ ID NO：6，单字符)

基因优化

基因的优化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子优化密码子序列。遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usagecodons)。实际上用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，Pichia，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母、果蝇、灵长类等每种生物都有独特的8个密码子极少被利用。大肠杆菌、酵母和果蝇中编码丰度高的蛋白质的基因明显避免低利用率的密码子。因此，重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用率低的或稀有的密码子合成基因，这种基因的重新设计叫密码子优化。

然而，密码子之外的一些其它因素也可以影响蛋白表达，包括使mRNA去稳定的序列、使DNA二级结构最小化，调整DNA的GC含量、基因翻译起始框架、翻译终止序列框架等。重新设计合成基因可以去除或改变这些序列，导致高水平表达，使得外源蛋白生产更有效和经济。

rhBMP-2成熟肽基因序列的优化

本发明提供了一种优化的，特别适合在大肠杆菌中表达的人rhBMP-2编码序列。该序列是根据大肠杆菌密码子偏爱性等原则而设计出的。设计出的rhBMP-2的编码序列用常规方法进行全基因合成，或在通过PCR方法获得的cDNA上进行点突变。

在一个实例中，在SEQ ID NO：1的基础上，根据大肠杆菌密码子使用频率采用优化软件初步优化以上蛋白序列的核苷酸得到一个新的cDNA序列(SEQ ID NO：3)：

cag gcg aaa cat aaa cag cgc aaa cgt ctg aaa agc agc tgc aaa cgc catccg ctg tat gtg gat ttc agc gat gtg ggc tgg aac gat tgg att gtg gtt ccgccg ggc tat cat gcg ttt tat tgc cat ggc gaa tgc ccg ttt ccg ctg gcg gatcat ctg aac agc acc aac cat gcg att gtg cag acc ctg gtg aac agc gtg aacagc aaa att ccg aag gcg tgc tgc gtg ccg acc gaa ctg agc gcg att agc atgctg tat ctg gat gaa aac gaa aaa gtg gtg ctg aaa aac tat cag gat atg gtggtg gaa ggt tgc ggc tgc cgc (SEQ ID NO：3)

再根据本发明人的经验和测试，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到了一个优化的hBMP-2基因的DNA序列，如SEQ ID NO：4所示。其中，SEQ ID NO：4与SEQ ID NO：3的区别如下：

cag gcg aaa cat aaa cag cgc aaa(成熟肽的第9位氨基酸的密码子为cgc)ctgaaa agc agc tgc aaa cgc cat ccg ctg tat

gtg gat(成熟肽的第23位氨基酸的密码子为ttt)agc gat gtg ggc tgg aac gat

tgg att gtg(成熟肽的第34位氨基酸的密码子为gcg)ccg ccg ggc tat cat gcg

ttt tat tgc cat ggc gaa tgc ccg ttt ccg

ctg gcg gat cat ctg aac agc acc aac cat

gcg att gtg cag acc ctg gtg aac agc gtg

aac agc aaa att ccg(成熟肽的第86位氨基酸的密码子为aaa)gcg tgc tgc gtg

ccg acc gaa ctg agc gcg att agc atg ctg

tat ctg gat gaa aac gaa aaa gtg gtg ctg

aaa aac tat cag gat atg gtg gtg gaa(成熟肽的第110位氨基酸的密码子为ggc)

tgc ggc tgc cgc

长链型hBMP-2基因序列的优化

本发明人还采用经优化的114肽成熟肽rhBMP-2DNA序列(SEQ ID NO：3)，在此成熟肽N端加上hBMP-2前肽的16个氨基酸残基(SEQ ID NO：6中第1-16位)Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：5中第1-48位)AAA CGT CAT GAT GGC AAA GGC CATCCG CTG CAT AAA CGC GAA AAA CGC，即为优化的长链型人BMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：7)。

类似地，采用经优化的114肽成熟肽rhBMP-2DNA序列(SEQ ID NO：4)，在此成熟肽N端加上hBMP-2前肽的16个氨基酸残基(SEQ ID NO：6中第1-16位)LysArg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：5中第1-48位)AAA CGT CAT GAT GGC AAA GGC CAT CCGCTG CAT AAA CGC GAA AAA CGC，即为优化的长链型人BMP-2基因的DNA序列(SEQID NO：8)。

AAA CGT CAT GAT GGC AAA GGC CAT CCG CTG CAT AAA CGC GAA AAA CGC caggcg aaa cat aaa cag cgc aaa cgc ctg aaa agc agc tgc aaa cgc cat ccg ctgtat gtg gat ttt agc gat gtg ggc tgg aac gat tgg att gtg gcg ccg ccg ggctat cat gcg ttt tat tgc cat ggc gaa tgc ccg ttt ccg ctg gcg gat cat ctgaac agc acc aac cat gcg att gtg cag acc ctg gtg aac agc gtg aac agc aaaatt ccg aaa gcg tgc tgc gtg ccg acc gaa ctg agc gcg att agc atg ctg tatctg gat gaa aac gaa aaa gtg gtg ctg aaa aac tat cag gat atg gtg gtg gaaggc tgc ggc tgc cgc

表达载体、工程菌和发酵

在优化基因的5’端与3’端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方法，将优化基因克隆入表达载体(如pBV220等)。然后，可用常规方法(如氯化钙法，见B.R.格利克，J.J.帕斯捷尔纳克编，陈丽珊、任大明主译，分子生物技术，化学工业出版社，2005年，p71)转化大肠杆菌，利用常规方法(如Amp抗性)选出转化株，从而获得表达rhBMP-2的工程菌。

在获得工程菌后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于大肠杆菌生长、表达的培养基都可用于本发明。

一种优选的培养条件如下：从转化的抗性平板中挑取含有表达载体的重组大肠杆菌单菌落，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在25-38℃的条件下以100-300rpm的转速在气浴振荡器中培养5～12小时，再按体积比为1∶5-15的比例将培养物接种到LB培养基中，在100-300rpm、25-38℃的条件下将基因工程菌培养至OD₆₀₀＝0.1-1.4；所说的LB培养液为为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；所说的抗生素选自氨苄青霉素、链霉素或卡那霉素；LB培养液中，抗生素的含量为10～100μg/ml；然后，升温至42℃，继续培养4-6小时，培养结束后，在7500-10000rpm、4±2℃条件下，离心分离，收集菌体。

包涵体的制备和复性

在本发明中，裂解菌体、提取包涵体以及复性的方法和条件没有特别限制，可以采用本领域中常用于rhBMP-2包涵体或其他包涵体的方法和条件。例如，细胞破碎技术可采用(但并不限于)：反复冻融法、超声波破碎法或高压均质法。

在本发明的一个优选例中，将收集的菌体，与TE溶液，按1g：5-15ml的比例混合，再按1g：0.3-5mg的比例，与溶菌酶混合，采用细胞破碎技术(超声波法或高压均质法)进行菌体破碎，然后在6000-10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入洗涤液，搅拌2～4h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用洗涤液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20ml Tris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；其中所说的TE溶液可以为6mM的Tris，和10mM的EDTA，pH 7.50；洗涤液为磷酸盐缓冲液、尿素水溶液、曲拉通水溶液等。然后，以1g包涵体：5～20ml裂解液的比例加入裂解液，在4±2℃下，搅拌裂解8～12小时，离心，离心转速6000～12000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为20～30分钟，弃沉淀，取离心上清液，稀释至蛋白含量为0.1-1mg/ml的样品，按体积比为1∶10～100的比例加入复性液中进行复性2-20天，所说的包涵体裂解液可为6M Gu-HCl或8M尿素、20mM PBS、10mM DTT等。

所说的复性液可以是(但并不限于)：20mM Na₂HHPO₄·12H₂O、1.5mMNaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

蛋白纯化

对于复性后的rhBMP-2蛋白，可以采用例如阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析等常规方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。

rhBMP-2重组蛋白及其应用

采用本发明的方法，获得的rhBMP-2蛋白，电泳结果表明，条带清晰，基本无杂带，其纯度达95％以上。

试验证明，本发明的rhBMP-2蛋白，具有很高的诱导成骨活性，可单独使用或与载体材料复合使用。

将本发明研制的rhBMP-2植入到昆明种小白鼠的大腿肌肉内，并以不含rhBMP-2的胶原组作为空白对照，通过测定不同剂量rhBMP-2植入相同时间和相同剂量rhBMP-2植入不同时间的碱性磷酸酶(ALP)活性和成骨量，以检测rhBMP-2的异位成骨活性。结果表明，植入本发明方法制备的rhBMP-2后，组织的ALP活性约为空白对照组的10倍；异位成骨量随rhBMP-2植入量和时间的增加而增加，具有剂量和时间呈正相关，而空白组并没有新骨生成。

将本发明研制的rhBMP-2填充到新西兰白兔的去骨膜的1.5cm桡骨节段缺损内，并以不含rhBMP-2的材料组作为空白对照，考察了骨缺损区域新骨形成、骨密度、骨痂生长、骨愈合情况。结果显示，采用本发明方法制备的rhBMP-2具有优异的原位成骨活性，rhBMP-2植入12周后1.5cm的桡骨骨缺损即能完全为新生骨质所充填，基本恢复正常骨形态，并形成正常的骨皮质。

采用物理吸附法、均相包埋法或非均相包埋法将本发明研制的rhBMP-2或其微囊与载体材料进行复合制备活性硬组织修复材料。结果表明，制备的活性硬组织修复材料能延缓蛋白的释放，且释放速度易控制。

所述的载体材料包括无机生物材料(如羟基磷灰石HAP，磷酸三钙，磷酸钙骨水泥，聚合磷酸钙，天然珊瑚，生物玻璃或微晶玻璃等或其复合物)、高分子材料(包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚β-羟基丁酸酯，聚原酸酯、聚碳酸酯等或其复合物)、天然生物材料(包括胶原、明胶等天然蛋白，壳聚糖、硫酸软骨素、透明质酸、糖胺聚糖等天然多糖等)或相互间的复合物。以rhBMP-2的重量计，所述的载体的含量为rhBMP-2的0-3000倍。

本发明的主要优点在于：

(a)采用原核表达制备rhBMP-2，其工艺简便，适合工业化大规模生产；

(b)与未经优化的hBMP-2基因及单独通过软件优化的基因相比，表达本发明优化hBMP-2基因的大肠杆菌工程菌株的rhBMP-2的产量提高了50％。

(c)本发明除了构建天然型hBMP-2优化基因外，同时也构建了长链型rhBMP-2的优化基因。长链型rhBMP-2与成熟肽rhBMP-2相比，具有复性效率高，分离纯化得率高的特点。

(d)采用原核表达制备的rhBMP-2不仅具有较强的骨诱导成骨能力，而且稳定性好、表达率高、生产成本低，是一种理想的骨生长因子。可单独或与载体复合后应用于脊柱外科、整形外科、口腔科、骨科(尤其在骨不连、骨延迟愈合方面)等领域。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人BMP-2成熟肽基因通过单独密码子优化软件优化，工程菌构建及rhBMP-2的制备

1.hBMP-2基因的DNA序列优化

根据大肠杆菌密码子使用频率采用优化软件优化hBMP-2cDNA序列，得到了优化的hBMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：3)。

2.重组载体的构建

在步骤1所得优化的hBMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：3)的5’端加上酶切位点和翻译起始核苷酸密码子GAATTCATG，在其3’端加上双重中止密码子和酶切位点TAGTAGGGATCC，用全基因合成方式合成该基因。通过EcoRI/BamHI双酶切后将其插入常规的市售载体pBV220中(获自上海金伟生物科技有限公司)。得到rhBMP-2表达质粒，标号为pRB-hBMP2-2，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

3.工程菌的构建、验证和保存：

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用步骤2所得的表达质粒进行转化常规的大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30℃的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15％的浓度，分装后在-80℃冰箱保存。

4.工程菌的培养：

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；氨苄青霉素含量为100μg/ml；在30℃的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为1∶10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH7.0±0.2，培养温度为30℃，搅拌速度180rpm，培养4小时。

然后，升温至42℃进行诱导，继续培养6小时，培养结束后，在7500rpm 4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在13KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g：10ml的比例混合，再按1g：1mg的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入1M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20ml Tris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

6.包涵体裂解、复性

以1g包涵体：10ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mMPBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速10000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg/ml，复性15天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mM NaH₂PO₄·2H ₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

7.蛋白纯化

采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。后在-30～7℃下冻干，得到重组人骨形态发生蛋白-2。

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为26KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率可达5.3mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

实施例2

人BMP-2成熟肽基因的进一步优化，工程菌构建及rhBMP-2的制备

1.hBMP-2基因的DNA序列优化

根据大肠杆菌密码子使用频率采用密码子优化软件初步优化hBMP-2cDNA序列(SEQ ID NO：3)，再根据经验值计算，进一步更换其中部分核苷酸编码，得到了优化的hBMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：4)。

2.重组载体的构建

在步骤1所得优化的hBMP-2基因DNA序列(SEQ ID NO：4)的5’端加上酶切位点和翻译起始核苷酸密码子GAATTCATG，在其3’端加上双重中止密码子和酶切位点TAGTAGGGATCC，用全基因合成方式合成该基因。通过EcoRI/BamHI双酶切后将其插入常规的市售载体pBV220中(获自上海金伟生物科技有限公司)。得到rhBMP-2的优化的表达质粒，标号为pRB-hBMP2-1(图1)，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

3.工程菌的构建、验证和保存

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用步骤2所得的表达质粒进行转化常规的大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30℃的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15％的浓度，分装后在-80℃冰箱保存。

4.工程菌的培养

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；氨苄青霉素含量为100μg/ml；在30℃的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为1∶10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH 7.0±0.2，培养温度为30℃，搅拌速度180rpm，培养4小时。

然后，升温至42℃进行诱导，继续培养6小时，培养结束后，在7500rpm4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在13KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g∶10ml的比例混合，再按1g∶1mg的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入1M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体。

6.包涵体裂解、复性：

以1g包涵体：10ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mM PBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速10000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg/ml，复性15天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mM NaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

7.蛋白纯化

采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。后在-30～7℃下冻干，得到重组人骨形态发生蛋白-2。

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为26KD(见图3)；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率可达7.62mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。这表明，SEQID NO：4的序列优于SEQ ID NO：3。

8.活性测试

将本实施例中制备的含0.25mg rhBMP-2的胶原植入到昆明种小白鼠的大腿肌肉内，并以不含rhBMP-2的胶原组作为空白对照。

结果表明，植入本发明方法制备的rhBMP-2后，异位形成新骨(见图4)，其骨形成量随rhBMP-2植入量和时间的增加而增加，具有剂量和时间呈正相关，而空白组并没有新骨生成。

实施例3(对比例)

人BMP-2成熟肽cDNA基因合成，工程菌构建及rhBMP-2的制备(无优化步骤)

1.人BMP-2基因序列：

人BMP-2基因序列如SEQ ID NO：1所示。

2.重组载体的构建

在步骤1中所列人BMP-2基因(SEQ ID NO：1)的5’端加上酶切位点和翻译起始核苷酸密码子GAATTCATG，在其3’端加上双重中止密码子和酶切位点TAGTAGGGATCC，用全基因合成方式合成该基因。通过酶切后将其插入载体pBV220。得到rhBMP-2的优化的表达质粒，标号为pRB-hBMP2-3，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

3.工程菌的构建、验证和保存：

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用2步所得的表达质粒进行转化大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30℃的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15％的浓度，分装后在-80℃冰箱保存。

4.工程菌的培养：

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；氨苄青霉素含量为100μg/ml；在30℃的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为1∶10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH 7.0±0.2，培养温度为30℃，搅拌速度180rpm，培养4小时。

然后，升温至42℃进行诱导，继续培养6小时。培养结束后，在7500rpm4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在13KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g∶10ml的比例混合，再按1g∶1mg的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入1M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20ml Tris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

6.包涵体的裂解、复性

以1g包涵体：10ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mMPBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速10000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg/ml，复性10天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mMNaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

7.蛋白纯化

采用离子交换层析柱、疏水层析柱、分子排阻的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。后在-30～7℃下冻干，得到rhBMP-2蛋白成品。

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为26KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率为4.95mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

实施例4

长链型人BMP-2基因的单独密码子优化软件优化，工程菌构建及rhBMP-2的制备

1.长链型人BMP-2基因的单独密码子优化软件优化

hBMP-2成熟肽基因的软件优化得到的DNA序列(SEQ ID NO：3)基础上，在其5’端加上天然hBMP-2前肽的16个氨基酸残基(SEQ ID NO：6中第1-16位)所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：5中第1-48位)，得到了长链型hBMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：8)：

2.重组载体的构建

在1所得优化的长链型人BMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：8)的5’端加上酶切位点和翻译起始核苷酸密码子GAATTCATG，在其3’端加上双重中止密码子和酶切位点TAGTAGGGATCC，用全基因合成方式合成该基因。通过酶切后将其插入载体pBV220中。得到rhBMP-2的优化的表达质粒，标号为pRB-hBMP2-L-2，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

3.工程菌的构建、验证和保存：

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用②步所得的表达质粒进行转化大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30℃的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15％的浓度，分装后在-80℃冰箱保存。

4.工程菌的培养：

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；氨苄青霉素含量为100μg/ml；在30℃的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为1∶10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH7.0±0.2，培养温度为30℃，搅拌速度180rpm，培养4小时。然后，升温至42℃进行诱导，继续培养6小时，培养结束后，在7500rpm4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在15KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g∶10ml的比例混合，再按1g∶1mg的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入1M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

6.包涵体的裂解、复性

以1g包涵体：10ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mMPBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速10000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg/ml，复性10天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mM NaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

7.蛋白纯化

采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。后在-30～7℃下冻干，得到重组人骨形态发生蛋白-2。

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为30KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率为7.02mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

实施例5

长链型人BMP-2基因优化，工程菌构建及rhBMP-2的制备

1.长链型人BMP-2基因的优化

在人BMP-2成熟肽基因的DNA序列(SEQ ID NO：4)优化基础上，在此成熟肽N端加上hBMP-2前肽的16个氨基酸残基(SEQ ID NO：6中第1-16位)Lys Arg HisAsp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：5中第1-48位)AAA CGT CAT GAT GGC AAA GGC CAT CCG CTG CATAAA CGC GAA AAA CGC，即为优化的长链型人BMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：8)。

2.重组载体的构建

在步骤1所得优化的长链型hBMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：8)的5’端加上酶切位点和翻译起始核苷酸密码子GAATTCATG，在其3’端加上双重中止密码子和酶切位点TAGTAGGGATCC，用全基因合成方式合成该基因。通过酶切后将其插入载体pBV220中。得到rhBMP-2的优化的表达质粒，标号为pRB-hBMP2-L-1，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

3.工程菌的构建、验证和保存：

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用②步所得的表达质粒进行转化大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30℃的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15％的浓度，分装后在-80℃冰箱保存。

4.工程菌的培养：

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；氨苄青霉素含量为100μg/ml；在30℃的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为1∶10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH7.0±0.2，培养温度为30℃，搅拌速度180rpm，培养4小时。

然后，升温至42℃进行诱导，继续培养6小时，培养结束后，在7500rpm4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在15KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g∶10ml的比例混合，再按1g∶1mg的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入1M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20ml Tris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

6.包涵体的裂解、复性

以1g包涵体：10ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mMPBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速10000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.1mg/ml，复性10天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mM NaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

7.蛋白纯化

采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。后在-30～7℃下冻干，得到重组人骨形态发生蛋白-2。

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为30KD(见图5)；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率可达10.05mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

这表明，SEQ ID NO：8的序列优于SEQ ID NO：7。

8.活性测试

将本实施例所制备的含0.25mg rhBMP-2的胶原植入到昆明种小白鼠的大腿肌肉内，并以不含rhBMP-2的胶原组作为空白对照。

结果表明，植入本发明方法制备的rhBMP-2后，异位形成新骨(见图6)，其骨形成量随rhBMP-2植入量和时间的增加而增加，具有剂量和时间呈正相关，而空白组并没有新骨生成。

实施例6(对比例)

含长链型人BMP-2基因工程菌构建及rhBMP-2的制备(无优化步骤)

1.长链型人BMP-2基因

在天然人BMP-2成熟肽cDNA(SEQ ID NO：1)的基础上，在其5’端加上BMP-2前肽的16个氨基酸残基(SEQ ID NO：6中第1-16位)Lys Arg His Asp Gly Lys GlyHis Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg所对应的核苷酸序列(SEQ ID NO：5中第1-48位)AAA CGT CAT GAT GGC AAA GGC CAT CCG CTG CAT AAA CGC GAA AAACGC，即为优化的长链型人BMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：5)。

2.重组载体的构建

在1所得长链型人BMP-2基因的DNA序列(SEQ ID NO：5)的5’端加上酶切位点和翻译起始核苷酸密码子GAATTCATG，在其3’端加上双重中止密码子和酶切位点TAGTAGGGATCC，用全基因合成方式合成该基因。通过酶切后将其插入载体pBV220中，得到rhBMP-2的优化的表达质粒，标号为pRB-hBMP2-L-3，经酶切和测序验证插入片段与设计一致。

3.工程菌的构建、验证和保存

采用分子克隆操作技术，以常规的氯化钙法制备感受态表达系统后，用步骤2中所得的表达质粒进行转化大肠杆菌JM109，在抗性平板中挑取单菌落，经培养后抽提质粒，进行酶切验证，最后测序，证实表达载体序列正确。挑取重组子，接种于装有含葡萄糖和抗生素的LB培养液的摇瓶中，在30℃的条件下以180rpm的转速在气浴振荡器中培养15小时，在冰浴条件下加入无菌甘油，使之达到15％的浓度，分装后在-80℃冰箱保存。

4.工程菌的培养

从转化后含有正确表达质粒的大肠杆菌抗性平板中挑取单菌落，接种于装有含氨苄青霉素的LB培养液的摇瓶中，LB培养基为10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母浸出粉，5g/l NaCl；氨苄青霉素含量为100μg/ml；在30℃的条件下以180rpm的转速在摇床中培养8小时，再按体积比为1∶10的比例将培养物接种到LB培养基中，pH7.0±0.2，培养温度为30℃，搅拌速度180rpm，培养4小时。

然后，升温至42℃进行诱导，继续培养6小时，培养结束后，在7500rpm4±2℃条件下，离心分离，收集菌体，菌体裂解后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，在15KD分子量处，与诱导前的重组菌及不含质粒的出发菌相比，有清晰条带增加，说明已经表达产生了目标蛋白质。

5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g∶10ml的比例混合，再按1g∶1mg的比例，与溶菌酶混合，采用高压均质法进行菌体破碎，然后在10000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入1M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20mlTris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体；

6.包涵体的裂解、复性

以1g包涵体：10ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为6M Gu-HCl、20mMPBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速10000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.1g/ml，复性10天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mMNaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

7.蛋白纯化

采用阴离子交换层析、阳离子交换层析、分子排阻层析的方法，按常规的洗脱方法从复性液中回收有活性的rhBMP-2二倍体。后在-30～7℃下冻干，得到重组人骨形态发生蛋白-2。

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为30KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值-致。

每批培养物的得率为6.3mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

实施例7

三种hBMP-2成熟肽重组菌生产rhBMP-2能力分析

三种rhBMP-2工程菌构建方法和rhBMP-2制备方法见实施例1-3。

分析其rhBMP-2表达能力的差异。结合软件优化(SEQ ID NO：3和7)和进一步人工优化(SEQ ID NO：4和8)的基因工程菌表达hBMP-2的能力与对照相比有约50％的提升，而单独用软件优化则无显著的提升。见表1

表1 rhBMP-2基因优化对表达能力的影响

  基因  (SEQ ID NO：)  批号  菌体浓度  OD_A600  包涵体总  蛋白  rhBMP-2产  量  出处  更优化的基因  SEQ ID NO：4  20080521  3.1  145.0mg  30.5mg  实施例2  优化基因  SEQ ID NO：3  20080601  2.9  113.1mg  21.2mg  实施例1  无优化  SEQ ID NO：1  20080612  3.1  108.5mg  19.8mg  实施例3

实施例8

长链型人BMP-2与hBMP-2成熟肽复性效率分析

人BMP-2成熟肽和长链型人BMP-2的制备方法见实施例2和5，分析其最终rhBMP-2得率。

与114肽的hBMP-2成熟肽相比，长链型人BMP-2的复性效率更高，与天然hBMP-2的成熟肽相比二倍体收率大约提高34％(见表2)。这表明，虽然优化的rhBMP-2编码序列SEQ ID NO：4和8都可用于高效生产，但从复性效率考虑，SEQID NO：8是更优选的。

表2 成熟肽rhBMP-2和长链型rhBMP-2复性得率分析

  批号  复性液总蛋  白  层析柱得  率  rhBMP-2总产量  成熟肽rhBMP-2  20080521  145.0mg  21％  30.5mg(实施例2)  长链型rhBMP-2  20080628  147.8mg  27.2％  40.2mg(实施例5)

实施例9

人BMP-2成熟肽基因优化，工程菌构建及rhBMP-2的变动条件制备

同实施例2，不同点仅在于步骤5和6有所不同。

步骤5.包涵体的提取和洗涤

将步骤4收集的菌体，与TE溶液，按1g∶15ml的比例混合，再按1g∶3mg的比例，与溶菌酶混合，采用超声细胞破碎技术进行菌体破碎，然后在8000rpm离心，收集沉淀，以1g沉淀物：20ml洗涤液的比例加入2M尿素水溶液洗涤，搅拌2h后，4±2℃离心收集沉淀物，再用0.5％曲拉通水溶液进行二次洗涤，之后，以1g沉淀物：20ml Tris的比例，加入10mM的Tris(pH7.5)，清洗，收集沉淀，得包涵体。

步骤6.包涵体的裂解、复性

以1g包涵体：17ml裂解液的比例加入裂解液，裂解液为8M尿素、20mMPBS、10mM DTT。在4±2℃下，搅拌裂解8小时，离心，离心转速9000rpm，离心温度为4±2℃，离心时间为30分钟，弃沉淀，取离心上清液加入复性液中，稀释至蛋白含量为0.7mg/ml，复性20天，复性液为20mM Na₂HPO₄·12H₂O、1.5mM NaH₂PO₄·2H₂O、140mM NaCl、5mM EDTA、1mM谷胱苷肽等。

结果：

经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为26KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物的得率为6.98mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

实施例10

基于SEQ ID NO：4的其他优化序列

重复实施例2，不同点在于，用以下序列替换SEQ ID NO：4：

本实施例的序列是在SEQ ID NO：4的基础上，将第23位氨基酸的密码子ttc改为ttt；第86位氨基酸的密码子aag改为aaa，所获得的核苷酸序列仍编码SEQID NO：2所示的rhBMP-2成熟肽。

结果表明，经非还原电泳SDS-PAGE检测产品纯度超过95％，分子量约为26KD；HPLC鉴定其纯度超过95％。经测定，N末端与C末端测定均与理论值一致。

每批培养物得率为6.04mg/L重组人骨形态发生蛋白-2。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献：

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[3]Kane JF.Effects of rare condon clusters on high-level expression ofheterotogus proteins in Ecoli.Curr Opin Biotechol，1995，6：494-500

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[8]许龙，李涛，周晓巍，黄培堂，原核表达中优化起始密码下游序列的软件设计与实现Design and Implementation of DB Sequence OptimizationSoftware[生物工程学报Chinese Journal of Biotechnology]

序列表

<110>上海瑞邦生物材料有限公司

 

<120>优化的基于大肠杆菌表达系统的重组人骨形态发生蛋白-2的DNA序列及重组人骨形态发生蛋白-2的制备

 

<130>087931

 

<160>8

 

<170>PatentIn version 3.4

 

<210>1

<211>342

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(342)

 

<400>1

caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga    48

Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg

1               5                   10                  15

cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att    96

His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile

            20                  25                  30

gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct   144

Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro

        35                  40                  45

ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt cag   192

Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln

    50                  55                  60

acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt gtc    240

Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val

65                  70                  75                  80

ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ctg tac ctt gac gag aat gaa    288

Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu

                85                  90                  95

aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt ggg    336

Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly

            100                 105                 110

tgt cgt                                                            342

Cys Arg

 

<210>2

<211>114

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

 

<400>2

Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg

1               5                   10                  15

His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile

            20                  25                  30

Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro

        35                  40                  45

Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln

    50                  55                  60

Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val

65                  70                  75                  80

Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu

                85                  90                  95

Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly

            100                 105                 110

Cys Arg

 

<210>3

<211>342

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>优化的rhBMP-2编码序列

<400>3

caggcgaaac ataaacagcg caaacgtctg aaaagcagct gcaaacgcca tccgctgtat    60

gtggatttca gcgatgtggg ctggaacgat tggattgtgg ttccgccggg ctatcatgcg   120

ttttattgcc atggcgaatg cccgtttccg ctggcggatc atctgaacag caccaaccat   180

gcgattgtgc agaccctggt gaacagcgtg aacagcaaaa ttccgaaggc gtgctgcgtg   240

ccgaccgaac tgagcgcgat tagcatgctg tatctggatg aaaacgaaaa agtggtgctg   300

aaaaactatc aggatatggt ggtggaaggt tgcggctgcc gc                      342

 

<210>4

<211>342

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>优化的rhBMP-2编码序列

 

<400>4

caggcgaaac ataaacagcg caaacgcctg aaaagcagct gcaaacgcca tccgctgtat    60

gtggatttta gcgatgtggg ctggaacgat tggattgtgg cgccgccggg ctatcatgcg   120

ttttattgcc atggcgaatg cccgtttccg ctggcggatc atctgaacag caccaaccat   180

gcgattgtgc agaccctggt gaacagcgtg aacagcaaaa ttccgaaagc gtgctgcgtg   240

ccgaccgaac tgagcgcgat tagcatgctg tatctggatg aaaacgaaaa agtggtgctg   300

aaaaactatc aggatatggt ggtggaaggc tgcggctgcc gc                      342

 

<210>5

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(390)

 

<400>5

aaa cgt cat gat ggc aaa ggc cat ccg ctg cat aaa cgc gaa aaa cgc    48

Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg

1               5                   10                  15

caa gcc aaa cac aaa cag cgg aaa cgc ctt aag tcc agc tgt aag aga    96

Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg

            20                  25                  30

cac cct ttg tac gtg gac ttc agt gac gtg ggg tgg aat gac tgg att   144

His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile

        35                  40                  45

gtg gct ccc ccg ggg tat cac gcc ttt tac tgc cac gga gaa tgc cct   192

Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro

    50                  55                  60

ttt cct ctg gct gat cat ctg aac tcc act aat cat gcc att gtt cag   240

Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln

65                  70                  75                  80

acg ttg gtc aac tct gtt aac tct aag att cct aag gca tgc tgt gtc   288

Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val

                85                  90                  95

ccg aca gaa ctc agt gct atc tcg atg ctg tac ctt gac gag aat gaa   336

Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu

            100                 105                 110

aag gtt gta tta aag aac tat cag gac atg gtt gtg gag ggt tgt ggg   384

Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly

        115                 120                 125

tgt cgt                                             390

Cys Arg

    130

 

<210>6

<211>130

<212>PRT

<213>人工序列

 

<400>6

Lys Arg His Asp Gly Lys Gly His Pro Leu His Lys Arg Glu Lys Arg

1               5                   10                  15

Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg

            20                  25                  30

His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile

        35                  40                  45

Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro

    50                  55                  60

Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln

65                  70                  75                  80

Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val

                85                  90                  95

Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu

            100                 105                 110

Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly

        115                 120                 125

Cys Arg

    130

 

<210>7

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>优化的长链rhBMP-2编码序列

 

<400>7

aaacgtcatg atggcaaagg ccatccgctg cataaacgcg aaaaacgcca ggcgaaacat    60

aaacagcgca aacgcctgaa aagcagctgc aaacgccatc cgctgtatgt ggattttagc   120

gatgtgggct ggaacgattg gattgtggcg ccgccgggct atcatgcgtt ttattgccat   180

ggcgaatgcc cgtttccgct ggcggatcat ctgaacagca ccaaccatgc gattgtgcag   240

accctggtga acagcgtgaa cagcaaaatt ccgaaagcgt gctgcgtgcc gaccgaactg   300

agcgcgatta gcatgctgta tctggatgaa aacgaaaaag tggtgctgaa aaactatcag    360

gatatggtgg tggaaggctg cggctgccgc                                     390

 

<210>8

<211>390

<212>DNA

<213>人工序列

 

<220>

<221>misc_feature

<223>优化的长链rhBMP-2编码序列

 

<400>8

aaacgtcatg atggcaaagg ccatccgctg cataaacgcg aaaaacgcca ggcgaaacat    60

aaacagcgca aacgtctgaa aagcagctgc aaacgccatc cgctgtatgt ggatttcagc   120

gatgtgggct ggaacgattg gattgtggtt ccgccgggct atcatgcgtt ttattgccat   180

ggcgaatgcc cgtttccgct ggcggatcat ctgaacagca ccaaccatgc gattgtgcag   240

accctggtga acagcgtgaa cagcaaaatt ccgaaggcgt gctgcgtgcc gaccgaactg   300

agcgcgatta gcatgctgta tctggatgaa aacgaaaaag tggtgctgaa aaactatcag   360

gatatggtgg tggaaggttg cggctgccgc                                    390