从枳椇中提取生物碱的方法及枳椇生物碱的纯化方法

摘要

本发明公开了一种从枳椇中提取生物碱的方法，包括以下步骤：(1)枳椇用酸乙醇溶液浸渍，过滤，得酸乙醇提取液；(2)回收乙醇溶剂，然后用稀酸溶解，静置，过滤；(3)调节滤液的pH值＝10～12；(4)用不溶于水的萃取剂萃取；(5)分相，浓缩水相。本发明还涉及纯化从枳椇中提取的粗生物碱的方法，用大孔吸附树脂柱进行洗脱、纯化。本发明解决了现有技术中无法将枳椇生物碱从枳椇中分离的难题，提供了一种从枳椇中提取生物碱的方法，该方法具有简单、易掌握、成本低、收率高的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从枳椇中提取生物碱的方法及枳椇生物碱的纯化方法。

背景技术

生物碱是一类存在于植物药中结构复杂且具有显著生物活性的碱性化合物，枳椇除果梗外叶、根、种子等均含生物碱，均可药用，特别是种子含生物碱量也很高。枳椇子主要含有环肽类生物碱和β-咔啉类生物碱，目前已从北枳椇的根皮中分离得到环肽类生物碱异欧鼠李碱(frangulanine)、去-N-甲基异欧鼠李碱(枳椇碱A、horenineA)和枳椇碱B(horenine B)，从北枳椇的种子中得到异欧鼠李碱和β-咔啉类生物碱黑麦草碱(perlolyrine)。研究表明，枳椇子总生物碱能明显拮抗乙醇所致肝损伤，其中所含的异欧鼠李碱对诱导线粒体浮胀肿瘤有离子选择性；黑麦草碱能明显地增加冠脉血流量和心肌营养性血流量，且有抗血栓、抗血小板凝聚作用[，而且对H₂O₂引起的人胎儿剂静脉内皮细胞损伤有保护作用。但是，国内外目前对于枳椇生物碱从枳椇中分离提纯的方法尚无报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种从枳椇中提取生物碱的方法及提取的粗生物碱的纯化方法。

本发明首先提供了一种从枳椇中提取生物碱的方法，该方法包括以下步骤：

(1)枳椇用酸乙醇溶液浸渍，过滤，得酸乙醇提取液；

(2)回收乙醇溶剂，然后用稀酸溶解，静置，过滤；

(3)调节滤液的pH值＝10～12；

(4)用不溶于水的萃取剂萃取；

(5)分相，浓缩水相。

作为优化，上述从枳椇中提取生物碱的方法，步骤(1)中，所述酸乙醇溶液为盐酸乙醇溶液、硫酸乙醇溶液、乙酸乙醇溶液、酒石酸乙醇溶液或草酸乙醇溶液；所述酸乙醇溶液为的浓度为1％～11％(V/V)。

作为优化，上述从枳椇中提取生物碱的方法，步骤(1)中，所述浸渍的温度20℃～80℃，时间2h～20h。

作为优化，上述从枳椇中提取生物碱的方法，步骤(1)中，枳椇与酸乙醇溶液的质量比为1∶5～35.

作为优化，上述从枳椇中提取生物碱的方法，步骤(2)中，所述稀酸为稀越酸、稀硫酸、稀乙酸、稀酒石酸或稀草酸；所述静置于4-30℃下静置，所述回收乙醇的方法为普通蒸馏或减压蒸馏。

作为优化，上述从枳椇中提取生物碱的方法，步骤(4)中，所述不溶于水的萃取剂为氯仿、乙醚或乙酸乙酯；萃取的次数为2～5次。

作为优化，上述从枳椇中提取生物碱的方法，步骤(5)中，所述浓缩水相的方法为减压蒸馏或旋转蒸发后再于40℃～60℃下烘干。

本发明还进一步提供了一种从枳椇中提取的粗生物碱的纯化方法，粗生物碱用大孔吸附树脂柱进行洗脱、纯化。

作为优化，上述从枳椇中提取的粗生物碱的纯化方法，所述大孔吸附树脂的型号为D101、XDA-10、LSA-300B、LX-38、LSA-21、H-30、LS-11或LSD-001，所述大孔吸附树脂柱的柱体积为7～7.5mL，柱留体积为2～2.5mL，所用的大孔吸附树脂的量为4～6g，柱留体积即柱体积最大保留溶剂。

作为优化，上述从枳椇中提取的粗生物碱的纯化方法，所述洗脱用的洗脱剂为10％～90％的乙醇水溶液；流速为1.5～2.5mL/min；大孔吸附树脂的上样量为4～5mg粗生物碱/克。

本发明解决了现有技术中无法将枳椇生物碱从枳椇中分离的难题，提供了一种从枳椇中提取生物碱的方法，该方法具有简单、易掌握、成本低、收率高的优点。

附图说明

图1是提取生物碱的工艺流程示意图；

图2是乙醇浓度对生物碱洗脱率的影响；

图3是pH值对生物碱吸附量的影响

图4是上样浓度对大孔树脂对生物碱吸附量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1  确定枳椇各部位的生物碱含量

1.1试验材料、试剂与仪器

1.1.1材料

北枳椇各部位(枝、叶、果柄、种子)均采自陕西太白山。将新鲜的叶子，枝干，果柄洗净、去杂处理，清水漂洗并沥干水分。取一部分果柄打浆，除去果汁，保留果渣。分离种子与种壳。将上述各部位(叶子、枝干、果柄、果渣、种子、种壳)分别在50℃干燥至恒重。粉碎，过40目筛，其中果渣过80目筛，备用。

1.1.2试剂

氯仿、乙醇、盐酸、氢氧化钠、硫酸、甲基红-溴甲酚绿指示剂均为分析纯。

氢氧化钠溶液的标定：用分析天平精密称取0.2g固体氢氧化钠置于100mL的烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转置250ml的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，用0.049mol/L的硫酸溶液标定，该氢氧化钠溶液浓度为0.019089mol/L。

硫酸溶液的标定：用1mL的移液管吸取9N的硫酸溶液0.55mL置250mL的容量瓶中，加蒸馏水置刻度，用0.02mol/L的氢氧化钠溶液标定，该硫酸的浓度为0.01061mol/L。1.1.3仪器

FW-177中草药万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；FA2004电子分析天平，上海精科天平；CS101-3型干燥箱，重庆银河试验仪器有限公司；R502B型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；HZQ-F160全温振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；冷凝管；水浴锅；圆底烧瓶。

1.2试验方法

1.2.1生物碱分布试验

1.2.1.1生物碱预试液的制备

分别取干燥样品粉末3g，加0.5％盐酸的乙醇溶液10mL，水浴回流30分钟，过滤，滤液蒸发乙醇至无醇味，加适量的蒸馏水溶解。

1.2.1.2生物碱沉淀和显色反应

分别取原料的酸性水提液各1mL置三支试管中，分别加入碘-碘化钾试剂、碘化汞钾试剂和鞣酸试剂各1-2滴：如碘-碘化钾试剂产生棕色或者褐色沉淀为阳性反应，碘化汞钾试剂产生白色沉淀为阳性反应，鞣酸试剂产生黄棕色沉淀为阳性反应。

根据反应现象按快慢和剧烈程度分为5个级别：剧烈阳性(用“+++”表示)、极阳性(用“++”表示)、阳性反应(用“+”表示)、不明显(用“±”表示)、阴性反应(用“-”表示)

1.2.2生物碱含量测定

1.2.2.1实验原理

生物碱在一般情况下显碱性，酸碱滴定法滴定时，加入的硫酸先和生物碱反应，生成生物碱盐类，剩余的硫酸用氢氧化钠滴定，根据公式：生物碱含量(mg/g)＝(V₁-V₂)·C·2.502/0.01/M₁，计算出1g原料中所含生物碱的量。公式中

V₁——加入的硫酸总体积，单位：mL；

V₂——中和氢氧化钠溶液消耗的硫酸体积，单位：mL；

C——滴定用硫酸的浓度，单位：mol/L；

2.502/0.01——每mL0.01mol/L的硫酸溶液相当于2.502mg的异欧鼠李碱；

M₁——测定中所用原料的重量单位：g。

1.2.2.2生物碱的提取

参考图1所示，精密称取各干燥后的原料粉末5g，置于圆底烧杯中，加入5％盐酸乙醇溶液，置60℃水浴上回流8小时，过滤，得酸乙醇提取液，利用旋转蒸发仪减压回收乙醇溶剂，用稀酸水溶解(5％盐酸水溶液)，冷置过夜，过滤，除去不溶解的非碱性脂溶性杂质(对于未除净的脂溶性杂质，可用乙醚或者氯仿萃取几次)，碱化滤液至pH＝11，移入1000mL的分液漏斗中用氯仿萃取四次，每次80mL，合并萃取液，回收氯仿中约40mL左右转入50mL容量瓶中，加氯仿至刻度制成样品液。备用。

1.2.2.3酸碱滴定法测定总生物碱的含量

精密吸取样品液5mL于烧杯中，精确加入0.01mol/L的硫酸溶液20mL，置于水浴锅上除去氯仿，加甲基红-溴甲酚绿指示剂(0.10％甲基红醇溶液与0.20％溴甲酚绿醇溶液以2∶3比例混合)2滴，用0.02mol/L氢氧化钠溶液滴定至黄色，保持30秒钟不退色为止。记录氢氧化钠消耗的毫升数。

1.2.2.4总生物碱的计算方法

总生物碱含量以异欧鼠李碱的含量计算，每mL 0.01mol/L的硫酸相当于2.502mg异欧鼠李碱，以异欧鼠李碱计算总生物碱的含量。

实施例2枳椇生物碱的提取工艺

果梗生物碱提取工艺

由上述试验得知：枳椇果梗中总生物碱含量最高，采用酸性乙醇为溶剂、加热回流提取法提取枳椇果梗中的总生物碱。

2.1果梗生物碱提取单因素试验

分别对酸性乙醇浓度、酸体积分数、提取温度、提取时间、料液比和提取次数进行了单因素试验，以确定各因子的影响效果和适宜的范围。以果梗总生物碱含量作为评价指标，3次重复。

①提取试剂的确定：取果梗原料5g，浸渍温度60℃，固液比1∶15，浸渍时间8h，分别用5％盐酸乙醇溶液、5％硫酸乙醇溶液、5％乙酸乙醇溶液、5％酒石酸乙醇溶液、5％草酸乙醇溶液提取生物碱，计算总生物碱含量。

②酸体积分数的确定：选定最佳的生物碱提取试剂，固定原料5g，浸渍温度60℃，固液比1∶15，浸渍时间8小时，分别用含有1％、3％、7％、9％和11％(记录其相对应的pH值)体积分数的酸水乙醇溶液提取，计算总生物碱的含量。

③提取温度的确定：酸体积分数为5％，其余条件同上，分别在以下温度进行提取，室温(测量记录温度)20℃、30℃、40℃、50℃、70℃、80℃，计算总生物碱含量。

④固液比的确定：其余条件同上，分别用以下固液比进行回流提取，1∶5、1∶10、1∶15、1∶25、1∶30和1∶35，计算总生物碱含量。

⑤时间的确定：其余条件同上，分别浸渍以下的时间2h、4h、6h、10h、12h、16h和20h，计算总生物碱含量。

2.2果梗生物碱提取正交试验

以单因素试验结果为参考，选用L9(3)⁴正交试验设计表，以溶剂(乙醇/水/盐酸)浓度(A)、提取温度(B)、料液比(C)、提取时间(D)为影响因素，以总生物碱含量为指标，优化提取工艺参数，从中筛选最优的工艺条件和技术参数。提取方法是称取5g果梗粉末，按试验设计条件，热回流提取后趁热过滤，提取液在45℃下真空干燥，备用。

实施例3枳椇生物碱的纯化工艺

3.1总生物碱粗提取液及上柱液的制备

枳椇总生物碱粗提物置于烧杯中，加蒸馏水置于水浴中蒸发掉提取时残留的氯仿，再适量蒸馏水充分拌匀，使其充分溶解，过滤，即得样品溶液，备用。

3.2大孔吸附树脂的预处理和再生

①大孔吸附树脂的预处理及装柱：新购大孔树脂用95％乙醇浸泡12h充分溶胀后，加热回流2h，除去乙醇后添加2倍量的50％乙醇回流三次，湿法装柱，用乙醇清洗至流出液加水不混浊为止，再用蒸馏水洗至澄清备用。

②大孔吸附树脂再生：一般用75％左右乙醇溶液洗脱。经反复使用后，吸附树脂颜色变深，吸附效果下降时，也可用1mol/L的氢氧化钠(或者HCl)洗涤或者浸泡适当时间，至树脂接近原颜色为宜，继而用水洗至中性即可再生。

3.3静态吸附试验

①大孔树脂吸附能力的测定：处理过的几种大孔树脂去除表面水后，各取0.5g分别置于具塞磨口三角瓶内，加入生物碱样品液20mL(含生物碱11.04mg)，常温下，摇床或者振摇器上振摇12h-24h，使树脂充分吸附后过滤，吸取滤液5mL用滴定法测定生物碱含量，计算浸泡液中生物碱总浓度，并按下式计算树脂的吸附能力。

树脂吸附能力＝[树脂吸附前起始生物碱浓度(mg/mL)-树脂吸附终止后剩余生物碱浓度(mg/mL)]×提取溶液体积(mL)/树脂质量(g)

②洗脱率的测定

将上述静态吸附后的大孔树脂滤出并吸干表面水分，分别置于具塞磨口三角瓶内，精密加入20ml体积分数为70％乙醇，振荡器振荡12h-24h。使枳椇生物碱充分解吸附，过滤，分别量取5mL滤液，滴定法测生物碱含量，计算滤液中总生物碱浓度，并按下式计算解吸率。

解吸率＝[解吸溶液体积(mL)×树脂解吸后滤液生物碱的浓度(mg/mL)]/[树脂质量(g)×树脂的吸附量(mg/g)]×100％

③洗脱剂浓度对洗脱率的影响

确定大孔树脂D101，精密称取上述静态吸附后的再经过滤出并吸干表面水分的大孔树脂10份，每份0.5g，分别置于具塞磨口三角瓶内，加入浓度为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％乙醇水溶液20mL后，振荡器振荡12h-24h，使枳椇生物碱充分解吸附，过滤，滤液量取5.0mL浸饱液滴定法测生物碱含量，计算解吸率。

④pH对大孔树脂吸附量的影响

精密称取已经处理好的干的大孔吸附树脂若干份，每份0.5g，分别置于具塞磨口三角瓶内，精密加入pH＝4、5、6、7、8、9、10和11的样品液各20mL后，常温下，摇床上振摇12h-24h，过滤，将滤液pH值调至11，萃取，然后分别测定总生物碱浓度，计算饱和吸附量。

3.4动态吸附-洗脱试验

①上柱液浓度对大孔树脂动态吸附枳椇总生物碱的影响：分别称取已经处理好的大孔树脂5g，湿法装柱，柱体积为7.2mL，柱留体积为2.3mL(柱留体积即柱体积最大保留溶剂)，加入不同浓度的生物碱样品液(总生物碱为22.08mg)，流速2mL/min，过柱完成后，分别收集各自的过柱液，测其中总生物碱的残留量。

②冲洗杂质用水量对大孔树脂动态吸附枳椇总生物碱的影响

分别称取已经处理好的大孔树脂5g，两份，湿法装柱，加入生物碱样品液，分别以流速2mL/min过柱，在以最适溶剂洗脱之前，第一份不用水洗，第二份用1BV、2BV和3BV(BV，BedVolume，单位为m³)的水冲洗，共冲洗三次，分别测定过柱水中总生物碱残留量，计算损失量及水冲洗对总生物碱纯度的影响。

③洗脱剂洗脱次数对大孔树脂动态吸附枳椇总生物碱收率的影响

分别称取已经处理好的大孔树脂5g，湿法装柱，加入生物碱样品液，以流速2/min过柱，测得柱中生物碱含量为15.3mg，过柱完后用90％酒精溶液洗脱，按照1BV洗脱，共洗脱5次，收集每次的洗脱剂，测定其中生物碱含量。

实施例4实验分析与结果

4.1实验分析

4.1.1枳椇中生物碱的分布

枳椇不同部位生物碱提取液定性分析结果见表1。

表1枳椇生物碱成分的试验

注：剧烈阳性(用“+++”表示)、极阳性(用“++”表示)、阳性反应(用“+”表示)、不明显(用“±”表示)、阴性反应(用“-”表示)。

由表1可以看出，枳椇各部位都含有生物碱类化学成分，但是各成分在枳椇不同部位中的含量不同：初步可以确定果柄和果渣中的生物碱含量最高。

4.1.2枳椇中不同部位总生物碱含量

枳椇不同部位总生物碱其含量测定结果，如表2所示，枳椇果梗中总生物碱含量最高，依次是种子、果渣、种壳、叶及枝木，定量分析结果与定性分析结果基本一致。但是，提取过程中发现果梗含脂溶性杂质较多，需要多次萃取。

表2枳椇各部位生物碱含量

4.1.3枳椇总生物碱酸提取试剂的确定

根据果梗生物碱酸提取试验得到的结果，如表3所示。

表3不同酸对生物碱提取率的影响

由表3可见，盐酸提取枳椇果柄中的总生物碱的提取率最高。

4.1.4枳椇中总生物碱浸渍提取过程中单因素的确定

根据果梗生物碱酸提取试验得到的研究结果，分别如表4、表5、表6和表7所示。

表4不同盐酸的百分数对生物碱提取率的影响

由表4可以看出，7％左右的酸乙醇提取液的提取率最高；提取液颜色随着酸度的增加而加深，至7％之后几乎不加深，而脂溶性杂质依次增多。

表5不同温度对生物碱提取率的影响

由表5可以发现，提取率随着温度升高而升高，70℃左右生物碱得率高，之后提取率反而下降。研究中发现，提取液的颜色随着提取温度的增加而加深，至80℃以上则沸腾。

表6不同固液比对生物碱提取率的影响

由表6发现，提取率随固液比增大而增大，当固液比达到1∶15后，再增加时生物碱提取量基本不变。

表7不同浸提时间对生物碱提取率的影响

由表7发现，提取率随浸提时间延长而增大，浸提时间10h左右生物碱的提取率较高，之后，随着浸提时间的加长，提取率反而下降。

4.1.5枳椇果梗总生物碱浸渍法提取工艺

提取总生物碱过程中受多个因素影响，如盐酸的体积分数、固液比、浸提温度和浸提时间等均对提取率有较大影响。在单因素对生物碱提取率试验的基础上，按L9(3)⁴正交设计方案，设计了正交试验，如表8所示，各试验处理结果及枳椇果柄中总生物碱类物质总量，如表9所示。

表8L9(3)⁴正交试验因素水平表

表9L9(3)⁴正交实验结果

从表9中极差分析可知，盐酸的体积分数、浸渍温度、固液比、浸渍时间因素对总生物碱提取量影响的主次顺序为：固液比＞浸渍温度＞盐酸的体积分数＞浸渍时间，最佳因素组合为A2B2C3D1，即最佳提取工艺条件为：浸渍温度75℃，盐酸体积分数：6％，时间：9小时，固液比1∶18。但由于固液比1∶15与1∶18时生物碱得率相差不大，为节省酒精，固液比可改为1∶15。

在最佳工艺条件下，进行平行实验，测得枳椇果柄总生物碱平均收率为13.8mg/g。

4.1.6大孔吸附树脂静态吸附试验结果

8种大孔吸附树脂的吸附能力、解析量和洗脱率结果见表10；不同乙醇浓度洗脱液的洗脱率见表11及图2；提取液pH值对总生物碱吸附的饱和吸附量见表11及图3。

表10不同大孔树脂吸附量、解析量和洗脱率

表11不同浓度洗脱液、不同pH提取液对生物碱纯化的影响

由表10可知，树脂型号不同，极性也不同，对生物碱吸附速率、吸附强弱和解析难易也不一样。8种树脂对枳椇总生物碱吸附率大小顺序为：D-101＞XDA-10＞LSA-300B＞LX-38＞LSA-21＞H-30＞LS-11＞LSD-001，其洗脱率大小顺序为：XDA-10＞D101＞H-30＞LX-38＞LSA-21＞LSA-300B＞LSD-001＞LS-11，综合考虑树脂的吸附-解析效果，选择D-101树脂进行枳椇总生物碱的分离纯化。

由表11和图2可以确定，乙醇浓度越高，洗脱率越高，综合考虑生产成本，选择90％乙醇洗脱较合适。

由表12和图3可以确定，当提取液pH＝8.0的弱碱性条件下，D-101树脂对总生物碱吸附率最大。

大孔吸附树脂静态吸附试验结果表明：8种树脂中最适合对枳椇总生物碱纯化的为D-101树脂，以pH＝8.0提取液上样，其吸附率较快，且总生物碱的饱和吸附量达6.32mg/g，最佳洗脱溶剂为90％乙醇。

4.1.7D-101大孔吸附树脂动态吸附-洗脱条件

上样浓度对大孔树脂动态吸附枳椇总生物碱的影响见图4；水洗体积对生物碱损失结果见表12，洗脱剂洗脱次数对大孔树脂动态吸附总生物碱收率影响见表13。表12和表13中，BV为Bed Volume，单位为m³。

表12水洗体积对动态吸附量的影响

表13洗脱次数对动态吸附总生物碱收率的影响

由图4可见上样液浓度越高，大孔树脂D101对枳椇总生物碱的动态吸附量越好，所以我们选择上样浓度为0.6mg/ml；由表12可见，水洗后生物碱损失量不大，可用2BV水洗，损失率为2.6％，可有效的去除水溶性杂质，提高总生物碱纯度。由表13可看出，总生物碱洗脱量主要集中在4BV内，占总生物碱洗脱量的80.38％。

4.2实验结果

4.2.1生物碱的定性分析

通过生物碱专属性沉淀和显色反应对生物碱进行定性分析，分析结果显示：枳椇的各个部位(包括叶子、枝干、果柄、果渣、种子、种壳)均含有生物碱。

4.2.2生物碱的定量分析

采用酸碱滴定法测定枳椇生物碱含量，结果表明：枳椇果柄中的总生物碱含量最高，为1.020％，其他部分含量依次为：种子0.924％；果渣0.759％；种壳0.374％；果叶0.339％；枝干0.269％。

4.2.3生物碱的提取工艺

在对枳椇生物碱定量的基础上，采用正交法对枳椇果柄中总生物碱的提取工艺进行了优化研究，确定了浸渍法提取枳椇总生物碱的最佳工艺为：浸渍温度75℃，盐酸体积分数：6％，时间：9小时，固液比1∶18。但由于固液比1∶15与1∶18时生物碱得率相差不大，为节省酒精，固液比可改为1∶15。枳椇果柄中总生物碱收率为13.8mg/g。

4.2.4生物碱的纯化工艺

比较了8种大孔吸附树脂，对枳椇总生物碱吸附率大小顺序为：D-101＞XDA-10＞LSA-300B＞LX-38＞LSA-21＞H-30＞LS-11＞LSD-001，洗脱率大小顺序为：XDA-10＞D101＞H-30＞LX-38＞LSA-21＞LSA-300B＞LSD-001＞LS-11，综合考虑树脂的吸附-解析效果，选择D-101树脂进行枳椇果柄总生物碱的分离纯化。当以pH＝8.0提取液上样，其吸附率较快，且总生物碱的饱和吸附量达6.32mg/g。洗脱液的乙醇浓度越高洗脱率越高，乙醇浓度90％以上时，洗脱率达到94％以上。当上样浓度为0.45mg/ml，2BV水洗去除水溶性杂质，洗脱量4BV，得率占总生物碱洗脱量的80.38％。未纯化前粗生物碱提取物中含生物碱8.2％，纯化后生物碱纯度为31.4％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。