溢油污染海岸线生物修复用菌剂及制备方法

摘要

本发明公开了溢油污染海岸线生物修复用菌剂及制备方法，溢油污染海岸线生物修复用菌剂是由混合发酵液和固定化载体为原料制成，混合发酵液包括短小芽孢杆菌CGMCCNo.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和/或门多萨假单胞菌CGMCCNo.3386发酵液和/或皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。本发明的菌剂利用不同菌株对不同种类石油烃降解的协同作用，加快石油烃污染物的降解速率，较彻底降解各类石油烃污染物，且多株菌组成的菌群结构更稳定，更好适应各类石油污染环境。菌剂在污染场地生长迅速，形成竞争优势，并显著增加污染场地烃类降解微生物的数量，从而提高原油的生物降解率。

说明书

技术领域

本发明属于石油及石油产品污染海岸线生物修复技术领域，具体地涉及一种溢油污染海岸线生物修复用菌剂及制备方法。

背景技术

随着世界对石油及其制品需求的日益增长，在海上开采、运输、装卸以及利用石油过程中的溢油事故也日渐增多。溢油不仅造成严重的环境污染，并且由于石油烃类污染物的潜在毒性和生物累积效应会导致近岸海域环境质量和生物种类多样性指数严重下降，破坏生态系统的功能，对水产业和旅游业也会造成巨大的经济损失。另外，石油烃中的多环芳烃类化合物具有强烈的致畸、致癌和致突变效应，可能通过食物链进入人体，对人体健康具有很大的潜在危害。安全、经济、环境友好的溢油污染处理方法，是目前环境污染治理领域的研究热点。

生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。具有投资小，操作简单，不易产生二次污染等优点，已成为现场去除石油烃类污染物的重要选择途径。20世纪80年代末美国在Exxon Vadez油轮石油泄露的生物修复项目中，短时间内清除了溢油污染，是生物修复成功应用的开端，同时也开创了生物修复在治理海洋污染中的应用先河。

在溢油污染生物修复过程中，石油烃降解菌既是石油降解的执行者，又是其中的核心动力。尽管土著微生物降解污染物的潜力巨大，但驯化时间长、生长速度慢、代谢活性低。生物强化即在污染场地投加高效的污染物降解菌剂，以显著提高污染场地的污染物降解菌种群和数量，从而提高污染物降解效率，已成为生物修复的重要技术手段之一。这些接种的微生物被称为先锋微生物，可以从土著微生物中富集，也可以从其它区域获得，或者使用基因工程菌。

石油中含有各种烷烃、芳烃以及多环芳烃等多种复杂成分。研究表明，不同种属的石油烃降解菌对原油中不同组分的适应及利用能力不同，一种微生物只能利用一种或几种石油烃类，因此单一微生物不可能完全完成石油的降解过程，必须通过多种不同功能的微生物共同作用才可能实现石油污染物的完全降解。构建高效的混合石油烃降解菌群，降低混合菌群中各菌株之间拮抗作用，增强菌株间协同作用，最大程度的发挥每株菌的功能，是提高溢油污染生物强化效率的关键。

鉴于石油烃污染物结构的复杂性和种类的多样性，选择多种微生物组成一个生物系统，让其中各细菌发挥其最佳生理功能，并利用其协同作用来高效率地降解污染物，符合实践的需要。李培军等人在2002年公开了一种采用多种真菌制备成的降解石油的菌剂的方法，并将其应用于石油污染土壤的生物修复，其中，混合菌是将筛选到的各单一真菌分别培养后等比例混合得到的(公开号：CN 1382758A)；王加宁等公开了一种降解石油污染物及石油产品的固体微生物及其制备方法(公开号：CN 101050435A)，可应用于石油污染土壤及石油产品泄漏等突发事故应急处理的生物修复技术中，其中，微生物菌剂是由枯草芽孢杆菌和多食鞘氨醇杆菌混合发酵制成。从国内外现有的研究结果看，虽然对于混合菌培养在生物降解中的作用已得到充分的肯定，部分成果已应用于实际，但混合菌培养协同作用的机制的研究尚不够深入。

发明内容

本发明的目的是提供一种溢油污染海岸线生物修复用菌。

本发明的第二个目的是提供一种溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

本发明的第三个目的是提供一种溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法。

本发明的技术方案概述如下：

溢油污染海岸线生物修复用菌，由下述菌组成：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保臧于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3384；威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3385和/或门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3386和/或皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)，保藏于中国微生物菌种保臧管理委员会普通微生物中心，保减号为CGMCC No.3387。

一种溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按1.0L～3.0L∶1kg的比例由混合发酵液和固定化载体为原料制成，所述混合发酵液包括短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和/或门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和/或皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

所述短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液的菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml、所述威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液的菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml、所述门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液的菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml、所述皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液的菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml，所述短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液的体积比为1～10∶1～10∶0～4∶0～4。

所述短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液的体积比为5～8∶2～8∶0.5～3∶0.5～3。

所述固定化载体为硅藻土、高岭土、草炭和甲壳质至少一种。

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将短小芽孢杆菌CGMCC No.3384、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385和/或门多萨假单胞菌CGMCC No.3386和/或皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387分别经斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养获得发酵液；

(2)将菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和/或菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和/或菌浓度为1×10⁶个/ml～1×10¹⁰个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液按体积比为1～10∶1～10∶0～4∶0～4混合均匀成混合发酵液；

(3)按1.0L～3.0L∶1千克的比例将所述混合发酵液和固定化载体混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

所述步骤(2)所述短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCCNo.3385发酵液、门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液、皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液的体积比为5～8∶2～8∶0.5～3∶0.5～3。

所述固定化载体为硅藻土、高岭土、草炭和甲壳质至少一种。

本发明的优点是：

(1)将对石油烃不同组分具有不同降解性能的几个菌株进行复配，利用不同菌株对不同种类石油烃降解的协同作用，加快石油烃污染物的降解速率，较为彻底降解各类石油烃污染物，且多株菌组成的菌群结构更稳定，能更好适应各类石油污染环境。

(2)在吸收和转化烷烃的过程中，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的菌株威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)可产生糖脂类生物表面活性剂，这种生物表面活性剂可以对污染场地的石油烃起到乳化增溶的作用，有利于石油烃降解菌对烃类的吸收利用。

(3)与污染场地的土著微生物相比，本发明的菌剂在污染场地生长迅速，可形成竞争优势，并显著增加污染场地烃类降解微生物的数量，从而提高原油的生物降解率。

附图说明

图1为添加单菌株与混合菌剂体系60天原油的降解率。

其中，TJ-1表示单独添加TJ-1菌的降解体系；TJ-2表示单独添加TJ-1菌的降解体系；DXH-1表示单独添加DXH-1菌的降解体系；DXH-2表示单独添加DXH-2菌的降解体系；BXHH-1、BXHH-2、BXHH-3、BXHH-4、BXHH-5和BXHH-6表示添加TJ-1、TJ-2、DXH-1和DXH-2混合菌的体系，各种菌的混合比例分别为4∶4∶1∶1，5∶2∶3∶3，8∶1∶0.5∶0.5，10∶8∶0∶4，1∶10∶4∶0和1∶1∶0∶0。

图2为添加TJ-1单菌株体系60天原油饱和石油烃组分的GC-MS图。

图3为添加TJ-2单菌株体系60天原油饱和石油烃组分的GC-MS图。

图4为添加DXH-1单菌株体系60天原油饱和石油烃组分的GC-MS图。

图5为添加DXH-1单菌株体系60天原油饱和石油烃组分的GC-MS图。

图6为添加混合菌BXHH-1菌体系60天原油饱和石油烃组分的GC-MS图。

图7为添加混合菌BXHH-2菌体系60天原油饱和石油烃组分的GC-MS图。

图8为单菌株基因组DNA-PCR结果。从左到右依次为DXH-1、DXH-2、TJ-1、TJ-2和mark，Mark从上到下分别为2000、1000、750、500、250、100bp。

图9为基于16SrDNA序列同源性的菌株TJ-1系统发育树。

图10为基于16SrDNA序列同源性的菌株TJ-2系统发育树。

图11为基于16SrDNA序列同源性的菌株DHX-1的系统发育树。

图12为基于16SrDNA序列同源性的菌株DHX-2的系统发育树

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

本发明涉及的溢油污染海岸线生物修复用菌的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)简称：TJ-1；威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)简称：TJ-2；门多萨假单胞菌(Pseudomonasmendocina)简称：DXH-1；皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)简称：DXH-2。四株菌都分离自天津港六号码头的沉积物中。四种菌的有效活菌数在10⁸个/g以上。

本发明涉及的四种菌株已于2009年11月3日保臧于中国微生物菌种保臧管理委员会普通微生物中心，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的保藏号为CGMCC No.3384；威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)的保藏号为CGMCC No.3385、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的保藏号为CGMCC No.3386、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstoniapickettii)的保藏号为CGMCC No.3387。并证明四种菌株均存活。

实施例1

溢油污染海岸线生物修复用菌，由下述菌组成：短小芽孢杆菌CGMCC No.3384、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385、门多萨假单胞菌CGMCC No.3386和皮氏罗尔斯顿菌CGMCCNo.3387。

实施例2

溢油污染海岸线生物修复用菌，由下述菌组成：短小芽孢杆菌CGMCC No.3384、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385和门多萨假单胞菌CGMCC No.3386。

实施例3

溢油污染海岸线生物修复用菌，由下述菌组成：短小芽孢杆菌CGMCC No.3384、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387。

实施例4

溢油污染海岸线生物修复用菌，由下述菌组成：短小芽孢杆菌CGMCC No.3384和威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385。

短小芽孢杆菌CGMCC No.3384、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385为烷烃降解菌，门多萨假单胞菌CGMCC No.3386和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387为芳烃降解菌。通过大量的试验证明，本发明的溢油污染海岸线生物修复用菌对石油烃的降解具有协同作用，可显著提高石油污染物的降解效率。

实施例5

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按2.0L∶1kg的比例由混合发酵液和硅藻土为原料制成，混合发酵液包括短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCCNo.3385发酵液、门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

实施例6

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按1.0L∶1kg的比例由混合发酵液和高岭土为原料制成，混合发酵液包括短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCCNo.3385发酵液和门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液。

实施例7

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按3.0L∶1kg的比例由混合发酵液和草炭为原料制成，混合发酵液包括短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

实施例8

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按2.0L∶1kg的比例由混合发酵液和质量比为1∶1草炭和甲壳质为原料制成，混合发酵液包括短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液和威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液。

实施例9

菌的发酵可以采用常规的发酵方法进行，下面公开的方法是其中一种，并不限制本发明。

1、斜面培养

将本发明涉及的四种菌短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏号为CGMCC No.3384，简称TJ-1；威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)，保藏号为CGMCC No.3385简称TJ-2、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)，保减号为CGMCC No.3386简称DXH-1、皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)，保藏号为CGMCC No.3387简称DXH-2分别接种到2216E固体培养基斜面上，25℃下培养72h后，备用。其中，2216E固体培养剂斜面制备方法如下：分别称取5.0g蛋白胨，1.0g酵母浸粉，0.01g磷酸高铁，依次搅拌溶解于1000mL陈化海水中，然后称取20g琼脂粉，煮沸溶解后，调pH 7.6～7.8，于121℃下灭菌20min后，在超净工作中，每一规格为180mm×18mm(长×直径)试管中倒入5mL左右所制备的2216E培养基，倾斜放置，冷却后得到2216E固体培养基斜面。

2、摇瓶种子培养

将上述斜面上的菌种，在超净工作台上无菌操作，分别接种到盛有200mL的2216E液体培养基的500mL锥形瓶中，25℃，200r/min培养72h，备用。上述的2216E液体培养基制备方法如下：分别称取5.0g蛋白胨，1.0g酵母浸粉，0.01g磷酸高铁，依次搅拌溶解于1000mL陈化海水中，分装到500mL三角锥形瓶中，每瓶装液量为200mL，于121℃下灭菌20min，每种菌细胞密度达到5×10⁷个/mL。

3、发酵罐培养

将上述种子培养液以5％的接种量分别接入5L发酵罐中，其中装有2.0L已灭菌的发酵培养基。发酵过程中，控制pH为7.2，培养温度为25℃，转速为600r/min，通气量为2.0L/min，培养60h，每种菌细胞密度达到2×10⁸个/mL。上述的发酵培养基制备方法如下：分别称取60.0g葡萄糖、140.0g液体石蜡、8.0gKH₂PO₄、12.0gK₂HPO₄、20.0g(NH₄)₂SO₄、40.0gNaCl，0.4g MgSO₄·7H₂O、0.02gCaCl₂、0.02g Na₂-EDTA，依次添加到1500mL的蒸馏水中，并搅拌溶解后，添加10mL微量元素溶液，用蒸馏水补充至2000mL，pH调至7.5，于121℃下灭菌20min。其中，微量元素溶液组成为(g/L)：ZnSO₄·7H₂O 0.29；MnSO₄·H₂O 0.24；CuSO₄·7H₂O0.25；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O，0.17。

实施例10

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按2.0L∶1kg的比例由混合发酵液和硅藻土为原料制成，混合发酵液包括体积比为4∶4∶1∶1的菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCCNo.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

实施例11

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按2.0L∶1kg的比例由混合发酵液和硅藻土为原料制成，混合发酵液包括体积比为5∶2∶3∶3的菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCCNo.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

实施例12

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按2.0L∶1kg的比例由混合发酵液和硅藻土为原料制成，混合发酵液包括体积比为8∶2∶0.5∶0.5的菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCCNo.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

实施例13

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按2.0L∶1kg的比例由混合发酵液和高岭土为原料制成，混合发酵液包括体积比为1∶10∶4的菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCCNo.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386。

实施例14

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按1.0L∶1kg的比例由混合发酵液和甲壳质为原料制成，混合发酵液包括体积比为10∶8∶4的菌浓度为1×10⁶个/ml的短小芽孢杆菌CGMCCNo.3384发酵液、菌浓度为1×10⁶个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液。

实施例15

溢油污染海岸线生物修复用菌剂，按3.0L∶1kg的比例由混合发酵液和草炭为原料制成，混合发酵液包括体积比为1∶1的菌浓度为1×10¹⁰个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液和菌浓度为1×10¹⁰个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液。

实施例16

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将短小芽孢杆菌CGMCC No.3384、威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385、门多萨假单胞菌CGMCC No.3386和皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387分别经斜面培养、摇瓶种子培养和发酵罐培养获得发酵液；

(2)将菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液按体积比为4∶4∶1∶1的比例混合均匀成混合发酵液；

(3)按2.0L∶1千克的比例将混合发酵液和硅藻土混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

实施例17

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)同实施例16；

(2)将菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液按体积比为5∶2∶3∶3的比例混合均匀成混合发酵液；

(3)按2.0L∶1千克的比例将混合发酵液和硅藻土混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

实施例18

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)同实施例16；

(2)将菌浓度为1×10⁸个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液、菌浓度为1×10⁸个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液和菌浓度为1×10⁸个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液按体积比为8∶2∶0.5∶0.5的比例混合均匀成混合发酵液；

(3)按2.0L∶1千克的比例将所述混合发酵液和硅藻土混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

实施例19

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)同实施例16；

(2)将菌浓度为1×10⁶个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、菌浓度为1×10⁶的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和菌浓度为1×10⁶个/ml的门多萨假单胞菌CGMCC No.3386发酵液按体积比为1∶10∶4的比例混合均匀成混合发酵液；

(3)按2.0L∶1千克的比例将混合发酵液和质量比为1∶1的高岭土和草炭混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

实施例20

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)同实施例16；

(2)将菌浓度为1×10⁶个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液、菌浓度为1×10⁶个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液和菌浓度为1×10⁶个/ml的皮氏罗尔斯顿菌CGMCC No.3387发酵液按体积比为10∶8∶4的比例混合均匀成混合发酵液；

(3)按1.0L∶1千克的比例将混合发酵液和质量比为1∶1的高岭土和草炭混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

实施例21

溢油污染海岸线生物修复用菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)同实施例16；

(2)将菌浓度为1×10¹⁰个/ml的短小芽孢杆菌CGMCC No.3384发酵液和菌浓度为1×10¹⁰个/ml的威尼斯不动杆菌CGMCC No.3385发酵液按体积比为1∶1：混合均匀成混合发酵液；

(3)按3.0L∶1千克的比例将混合发酵液和甲壳质混合均匀，冷冻干燥，即获得溢油污染海岸线生物修复用菌剂。

实施例22

将对石油烃不同组分具有不同降解性能的几个菌株进行复配，实验证明不同菌株对不同种类石油烃降解有协同作用可加快石油烃污染物的降解速率，较为彻底降解各类石油烃污染物，且多株菌组成的菌群结构更稳定，能更好适应各类石油污染环境。(见图1-图7)

实验证明，在吸收和转化烷烃的过程中，不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的菌株威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)可产生糖脂类生物表面活性剂，这种生物表面活性剂可以对污染场地的石油烃起到乳化增溶的作用，有利于石油烃降解菌对烃类的吸收利用。

与污染场地的土著微生物相比，本发明的菌剂在污染场地生长迅速，可形成竞争优势，并显著增加污染场地烃类降解微生物的数量，从而提高原油的生物降解率。

菌种鉴定

一、菌株菌落特征、个体特证和生理生化特征

1.鉴定方法：

依据《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，2001)和《伯杰细菌鉴定手册》(科学出版社，1984)所述方法，进行菌株的生理生化特征分析。

2.鉴定结果

依据四株菌的菌落形态、个体形态和生理生化特征见表1。可以初步鉴定TJ-1、TJ-2、DHX-1和DHX-2分属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)和罗尔斯顿菌属(Ralstonia sp.)。

表1  菌株的菌落形态、个体形态和生理生化特征

二、分子生物学鉴定

1.鉴定方法和操作：

所分离到的石油烃降解菌单菌株采用16SrDNA序列鉴定，其主要步骤如下：

(1)细菌单菌株DNA的提取

菌株染色体DNA的提取：挑选单菌落，接种到2216E斜面培养基28℃培养24h，采用酚-氯仿法提取染色体DNA。

(2)16SrDNA序列分析及系统发育树的构建

使用16SrDNA通用引物，由上海生物工程公司合成引物。其中，16sF为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16sR为5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。以所提取的染色体DNA为模板进行PCR扩增。

利用上海博亚生物公司DNA回收试剂盒对琼脂糖凝胶电泳中的PCR产物条带进行回收。将回收的DNA送上海博亚测序。测序结果在NCBI和Swiss-Prot网站上进行BLAST分析，利用Phylip软件包、MEGA 3.1软件，使用CLUATALW法和NJ法对核苷酸序列进行同源进化分析。

2鉴定结果

基于16SrDNA对所分离到的各菌株进行进一步的鉴定。一般认为，16SrDNA序列同源性高于97％，可以认为属于同一种。图8表示单菌株DNA的PCR扩增结果。

基于16SrDNA的各菌株的同源性分析和系统发育结果分别见图9-图12。可以看出，TJ-1、TJ-2、DHX-1和DHX-2的16SrDNA序列同源性分别与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、威尼斯不动杆菌(Acinetobacter venetianus)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)的同源性最高，接近100％。可以认为这四株菌分属于短小芽孢杆菌(B.pumilus)、威尼斯不动杆菌(A.venetianus)、门多萨假单胞菌(P.mendocina)和皮氏罗尔斯顿菌(R.pickettii)。