基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法

摘要

本发明为一种基于限制性内切酶抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法，包括中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用、限制性内切酶FokI二聚体形成条件及抑制位点选择、基于Taqman探针的实时荧光定量检测技术。它利用寡核苷酸DNA链中间修饰的小分子和其结合蛋白或抗体的特异性结合，基于小分子与蛋白或抗体相互作用对限制性内切酶FokI酶切的抑制作用，通过对被酶切的Taqman探针荧光实时定量分析来检测小分子与蛋白相互作用及小分子或其结合蛋白。该方法灵敏度高、操作简便、特异性强，可用于生物医学中信号转导与分子调控机理研究、食品与农产品安全检测、环境毒物检测、药物筛选等。

说明书

技术领域

发明属于一种检测有机小分子与结合蛋白相互作用的生物传感技术，其具体是指，限制性内切酶FokI二聚体形成条件以及抑制位点的选择，中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用，限制性内切酶FokI抑制分析，和基于Taqman探针的实时荧光定量检测方法。

背景技术

有机小分子与结合蛋白相互作用、药物与化学毒素等有机小分子以及小分子结合蛋白的快速筛查与检测对于临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药物筛选、环境监测等领域具有极其重要的意义。目前常用的有机小分子与结合蛋白相互作用的检测技术主要有表面等离子共振、酶互补片断免疫分析以及荧光各向异性分析等。这些检测技术灵敏度不高、可靠性差，且需要精密的仪器，不能满足准确快速检测的需求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出了一种基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法，此方法设计简单，仅需设计一对互补且包含有限制性内切酶FokI识别位点的寡核苷酸DNA链和Taqman探针即可，在其中间抑制位点进行小分子标记后即可实现检测，此方法可实现多目标同时检测，并且操作简便、快速、灵敏。

本发明的技术方案是，所述基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的生物传感方法为：利用包含有中间修饰有机小分子的寡核苷酸DNA双链与蛋白相互作用后对限制性内切酶FokI抑制，通过Taqman探针的荧光实时变化，定量分析检测小分子与蛋白的相互作用以及小分子或其结合蛋白。

以下对本发明作进一步说明

所述基于限制性内切酶FokI抑制分析检测小分子与结合蛋白相互作用的荧光生物传感方法包括：

(1)包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白的相互作用及限制性内切酶FokI抑制分析；

(2)形成限制性内切酶FokI二聚体，选择抑制位点；

(3)采用基于Taqman探针的实时荧光定量方法进行限制性内切酶FokI抑制分析的定量检测。

以下对本发明做出进一步说明。

所述包含中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA双链与蛋白相互作用的检测及限制性内切酶FokI抑制分析采用以下步骤实现：

对于小分子与其结合蛋白的相互作用，检测步骤是：取所述有机小分子修饰的含有限制性内切酶FokI的寡核苷酸DNA单链与其互补链的杂交液置于微量管中；再于微量管中加入包含小分子结合蛋白的样品溶液；然后加入限制性内切酶FokI反应，得抑制反应的产物；

对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是：取所述有机小分子修饰的含有限制性内切酶FokI的寡核苷酸DNA单链与其互补链的杂交液置于微量管中；再加入包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入小分子结合蛋白或单克隆抗体溶液；再加入限制性内切酶FokI反应，得抑制反应的产物。

限制性内切酶FokI二聚体抑制位点选择FokI识别位点上游5个碱基和下游3个碱基中的任意一个。

所述限制性内切酶抑制的定量检测可采用标准的Taqman探针荧光实时定量检测。

本发明中，所述寡核苷酸DNA单链的中间有机小分子的修饰通过现有的交联反应技术实现。例如，对于带有羧基的有机小分子，可以采用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺与琥珀酰亚胺交联反应技术与中间碱基NH₂标记的包含限制性内切酶FokI识别位点的寡核苷酸DNA单链进行交联；对于带氨基的有机小分子，可以采用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯的交联反应技术与中间标记有巯基的寡核苷酸DNA单链进行交联。交联反应产物可用透析纯化。

进一步地，本发明中，所述中间有机小分子修饰的寡核苷酸DNA链与蛋白的相互作用的检测及限制性内切酶FokI抑制分析采用以下步骤实现：

a.对于小分子与其结合蛋白的相互作用的检测的步骤是：取5μl上述小分子修饰寡核苷酸DNA链与其互补链的杂交液置于微量管中，加入3μl 10×限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mM DTT，pH 7.9@25℃)，然后加入8μl包含小分子结合蛋白的样品溶液，在37℃恒温反应0.5小时，再加入3μl限制性内切酶FokI和6μl Taqman探针，置于37℃反应2h后，升温至65℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。

b.对于有机小分子的检测，采用竞争反应检测的步骤是：取5μl上述小分子修饰寡核苷酸DNA链与其互补链的杂交液置于微量管中，3μl 10×限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mM DTT，pH 7.9@25℃)，然后加入5μl包含待测小分子的样品溶液，混合均匀后加入一定浓度的小分子的结合蛋白或(鼠源)单克隆抗体溶液3μl，单克隆抗体终浓度为加入的小分子修饰寡核苷酸DNA链浓度的5倍；在37℃恒温反应0.5小时，再加入3μl限制性内切酶FokI和6μl Taqman探针，置于37℃反应2h后，升温至65℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。

注意，以上反应条件为最优条件，所述溶液体积均可成倍变化不改变最优结果。改变比例或试剂加入顺序可使被酶切的Taqman探针效率在1％～100％内变化。

本发明中，所述限制性内切酶FokI抑制的定量检测可采用标准的Taqman探针，以下是用Taqman探针对限制性内切酶抑制定量检测步骤：

用1x限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mM DTT，pH 7.9@25℃)将反应最终产物稀释到120μl，转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号强度。

本发明提出了一种基于限制性内切酶FokI抑制分析的方法，此方法设计简单，仅需设计一对包含有限制性内切酶FokI识别位点的互补链和Taqman探针即可，在其中间抑制位点进行小分子标记，即可实现检测；它也可直接用于小分子结合蛋白的检测，还可通过样品溶液中小分子与小分子标记的寡核苷酸DNA链竞争与抗体结合间接检测有机小分子，其操作快速简便、灵敏特异，可望为临床诊断、药物研发、药毒物分析、环境监测等提供一个通用技术平台。

具体实施方式：

实施例1：基于限制性内切酶FokI抑制分析检测生物素

1)中间氨基标记的寡核苷酸DNA链和生物素(biotin)的交联

称取6.1mg的生物素溶于2.5mL磷酸缓冲溶液(0.1M NaH₂PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30min。取260μl活化后的生物素溶液加入到260μl浓度为10μM的中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链(GAACAACAACCAACATCCAAACTTCTATATATGGATGAAT(NH2)CAAC)的溶液中，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。

把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH₂PO4，pH 7.4)中在4℃透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-20℃的冰箱中备用。上述的-20℃保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4℃冰箱中作为次级储备液备用。

2)生物素的检测

取5μl上述生物素标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液和5μl互补链的储备液于微量管中，加入3μl的10×限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mM DTT，pH 7.9@25℃)混合均匀，升温至95℃反应5min，缓慢降温至37℃反应1h，再加入5μl待检测的生物素样品溶液，混合均匀后加入3μl浓度为640nM的链霉亲和素(streptavidin)，室温反应15min，反应后加入3μl限制性内切酶FokI(NEB公司产品)和6μl Taqman探针在37℃酶切2h后，升温至65℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。加入1x限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mMDTT，pH 7.9@25℃)将反应混合液稀释至120ul，转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号强度。

实施例2：基于限制性内切酶抑制分析检测叶酸结合蛋白

1)中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链和叶酸的交联

称取10mg的叶酸溶于2.5mL磷酸缓冲溶液(0.1M NaH₂PO4，pH 7.4)，再加入1mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺(EDC)，在室温下搅拌15min，再加入2.8mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，在室温反应30mm。取260μl活化后的叶酸溶液加入到260μl浓度为10μM的中间氨基标记的寡核苷酸DNA单链(GAACAACAACCAACATCCAAACTTCTATATATGGATGAAT(NH2)CAAC)的溶液中，在轻微搅拌下室温反应2h。反应后在混合液中加入3.6mg盐酸羟胺终止反应。

把交联反应产物移到1mL的透析管中，透析管的截留分子量为6000D。把透析管放入500ml磷酸盐缓冲溶液(0.1M NaH₂PO4，pH 7.4)中在4℃透析12h，每隔3h更换一次透析液，最后一次用超纯水透析。透析之后的寡核苷酸DNA单链分管保存于-20℃的冰箱中备用。上述的-20℃保存的寡核苷酸DNA单链用灭菌水稀释10倍并保存于4℃冰箱中作为次级储备液备用。以上所有的反应均在遮光的条件下进行。

2)叶酸结合蛋白的检测

取5μl 上述叶酸标记的寡核苷酸DNA单链次级储备液和5μl其互补链的储备液于微量管中，加入3μl的10×限制性内切酶FokI反应缓冲溶液混合均匀，(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mM DTT，pH 7.9@25℃)，升温至95℃反应5min，缓慢降温至37℃反应1h，再加入5μl待检测的叶酸结合蛋白样品溶液，室温反应15min，反应后加入3μl限制性内切酶FokI(NEB公司产品)和6μl Taqman探针在37℃酶切2h后，升温至65℃反应20min进行热灭活以终止酶反应。在此微量管中加入1x限制性内切酶FokI反应缓冲溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，1mM DTT，pH 7.9@25℃)稀释至120ul，混合均匀。转移到微量石英杯中，放入荧光光谱仪，以495nm为激发波长，518nm为发射波长，测其荧光信号强度。