一种生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶及其制备方法

摘要

本发明涉及一种生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶及其制备方法。所述水凝胶含有具有温度敏感特性的烷基丙烯酰胺M1、无机纳米粉体M2和具有良好生物相容性的聚羟基脂肪酸酯M3，三者用量的质量百分比为：94～60∶1～20∶5～39。本制备方法是在水溶液中将M1、M2和M3进行原位自由基聚合反应，浸泡除杂后得到具有生物相容性和温敏性的纳米复合水凝胶。该方法制备工艺简单、易于可控，可通过降低温度实现细胞的自动脱附，水凝胶的生物相容性和温度敏感性可通过改变交联剂密度、M3用量和组分来调节，可广泛用于组织工程等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及生物相容性和环境敏感性的高分子材料领域，具体涉及一种生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶及其制备方法。该纳米复合水凝胶可应用于组织工程等领域。

背景技术

水凝胶是一种介于液体和固体之间的能显著地溶胀于水并保持大量水分而又不能溶解于水的亲水性交联聚合物，可容纳高分子本身重量数倍乃至数百倍的水。环境敏感型水凝胶能感知外界环境(如温度、pH、光、电和压力等)的微小变化或刺激，并能产生相应的物理结构和化学性质变化。在外界环境变化中，由于温度的可控性和简易性，因此温敏性水凝胶的研究最为广泛。

由于水凝胶自身优良的“软”“湿”性，其结构类似于人体内的大分子组成物，较低的毒副作用和优异的生物惰性，及其对温度等外界条件所表现出的智能性，可用于细胞载体、药物控制释放、化工分离、形状记忆开关等领域，并可替代软组织的人造材料——肌肉和皮下组织，因而引起了科学工作者的广泛关注。

组织工程中常采用温敏性的聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)水凝胶作为细胞释放载体，这是因为当PNIPAM水凝胶高于32℃时，高分子链发生相转变而产生体积收缩，材料表面表现疏水性，可以使各种细胞在其上吸附、铺展和分化；而当温度低于32℃时，PNIPAM表现亲水性，这样可以使形成的细胞片层完整地从培养板表面自然脱附，避免酶解法对细胞造成的损伤，保持其原有的功能。得到的完整细胞片层可以直接移植到受损的主体组织进行修复，不必连同细胞载体物质或支架材料一起植入体内，这样就避免了支架材料对主体所产生的各种不利影响。

然而，目前水凝胶多为合成高分子，如聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、聚氨酯等，不能通过水解或酶解进行降解、不具有敏感性能、和生物组织的相容性较差。为改善水凝胶的生物相容性，中国专利CN101367947A、CN101328251A、CN1284811C、CN101177487C和CN100341484C中采用了具有生物相容性的壳聚糖、葡聚糖、明胶、聚磷酸酯、魔芋葡甘聚糖、聚酸酐和右旋糖酐-马来酸单酯等制备得到具有高亲水性、保湿性、通透性、生物相容性、可降解性和温敏性的水凝胶。但所得产物机械性能差、易碎，而且部分凝胶制备过程中采用了化学交联剂如N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)等，而造成交联点无序分布，交联密度不均，应力容易集中断链，使得体系在较低应力下断裂，导致凝胶柔韧性差、响应速率慢、透明度低，从而限制了其在组织工程等领域中的进一步应用。

为改善水凝胶的力学性能，Haraguchi等(Macromolecules，2002，35：10162；Macromol.Chem.Phys.，2005，206：1530)在凝胶的制备过程中，在不添加任何化学交联剂的情况下，用无机纳米粘土(clay)代替交联剂，异丙基丙烯酰胺(NIPAM)作为温敏性单体，通过在粘土水溶液中进行原位聚合得到一种具有快消溶胀速率和优异机械性能的聚异丙基丙烯酰胺纳米复合水凝胶(PNIPAM/clay).这种凝胶剥离粘土片层(以氢键、离子键或配位键与高分子链作用)扮演着交联剂的角色，断裂伸长率达1000％，弹性恢复率达98％，机械强度大幅度提高，拉伸模量和拉伸强度几乎和粘土含量成正比，随粘土含量增加，断裂伸长率稍有下降.同时，这种结构的水凝胶分子链段运动灵活，使得其还具有较快的温度响应速率.

中国专利CN 101215350A和CN 1908035A公开了一种以焦磷酸钠改性的锂皂石为物理交联剂，丙烯酰胺为主单体制备得到高回弹性的纳米复合水凝胶。中国专利CN101319019A和CN1931901A公开了一种以市售物理交联剂锂蒙土Laponite为交联剂，乙烯基吡咯烷酮或异丙基丙烯酰胺等为功能单体，制备得到具有良好透明性、吸水溶胀性和力学性能的温敏纳米复合水凝胶。Ma等(Journal of Polymer Science：Part B.2008，46：1546；European Polymer Journal，2007，43：2221)将羧甲基纤维素(CMC)和PNIPAM半互穿，在Laponite为交联剂，20℃下制备得到快速响应和高机械性能的温敏半互穿纳米复合水凝胶(CMC/PNIPAM)。

由上分析可以看出，目前所制备的生物相容性水凝胶，原料来源有限、温敏性不明显；而一般的温敏性水凝胶由于采用了化学交联剂MBA，机械综合性能较差；采用物理交联剂Clay制备得到高力学性能水凝胶，但其生物相容性又较差，因而难以满足组织工程等实际应用的需要。

就生物相容性而言，聚羟基脂肪酸酯(PHA)是原核微生物在碳、氮营养失衡的情况下，作为碳源和能源贮存而合成的一类热塑性聚酯，脂肪酸可以是丁酸，戊酸或己酸等，其分子量多为50,000到20,000,000道尔顿，可用作各种绿色包装材料与容器、污水处理用细菌床、及用于引导组织再生。在组织修复过程中，由于各种组织细胞向创口内生长速度不同，为使所需要的组织细胞长入某些区域，可通过放置生物膜，利用生物膜具有的保护、阻隔和引导作用，阻止结缔组织、上皮组织等长入，为所需要的组织细胞提供生长空间，从而达到完全的组织再生和重建。目前已经能进行商品化生产的PHA产品如聚羟基丁酸酯(PHB)、聚羟基戊酸酯(PHV)、聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)和聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)，均已经证明具有生物相容性。

发明内容

本发明拟解决的技术问题是：设计一种新型纳米复合水凝胶，该凝胶既具有良好的生物相容性和细胞亲和性，又具有优异的温敏性和力学性能。该凝胶可通过调节温度变化实现细胞的自然脱附，并用于组织工程、细胞培养等领域。

本发明所制备的一种生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶，由如式M1所示的N-烷基丙烯酰胺类单体、如式M2所示的无机纳米粘土(锂皂石Hectorite、硅酸镁锂Magnesium lithium silicate)和如式M3所示的天然聚酯类高分子溶于水聚合而成，所述的M1、M2、M3的质量百分比为M1：94-60％，M2：1-20％，M3：5-40％；

锂皂石，Hectorite：[Mg_5.34Li_0.66Si₈O₂₀(OH)₄]Na_0.66

硅酸镁锂：Magnesium lithium silicate，[Mg，Li]₃Si₄O₁₀(OH)₂]·4H₂O M2

其中，R1为氢原子，R2为异丙基，或R1为乙基，R2为乙基；

X和Y为10-50的正整数；

m为1、2或3，n为40-100的正整数，R为CH₃或CH₂CH₃或CH₂CH₂CH₃等直链脂肪链。^*代表手性碳原子。

如式M1所示的N-烷基丙烯酰胺类单体具有温度敏感性，为N-异丙基丙烯酰胺或N，N’-双乙基丙烯酰胺。

如式M2所示的无机纳米粉体，可作为物理交联剂，在水中形成透明溶液，用静态和动态光散射、小角中子散射、电镜测试表明水溶液中的为碟状片层结构，锂皂石厚度为1-2nm，直径为20-30nm，化学结构通式为[Mg_5.34Li_0.66Si₈O₂₀(OH)₄]Na_0.66，硅酸镁锂，厚度为1-3nm，直径为25-40nm，化学结构通式为[Mg，Li]₃Si₄O₁₀(OH)₂]·4H₂O；两者都是一种三八面体蒙脱石；

如式M3所示的天然聚酯类高分子具有生物相容性，为聚羟基丁酸酯(PHB)或聚(羟基丁酸-羟基戊酸酯)(PHBV)或聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)，均属于聚羟基脂肪酸酯家族，原料来源充分而且可以再生，生产过程无污染，能被自然界中微生物完全降解，最终生成二氧化碳和水，不污染环境，可实现在自然界中的循环。

本发明一种生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

1)将如式M1所示的N-烷基丙烯酰胺类单体、如式M2所示的无机纳米粉体、如式M3所示的天然聚羟基脂肪酸酯类高分子按照质量百分比为M1：94-60％，M2：1-20％，M3：5-39％依次加入去离子水中，配制成质量浓度为0.005-0.1％的水溶液，在20℃的密封容器中，通入氮气，超声分散30min，搅拌30-70min，直至完全分散形成均一溶液；

2)将上述混合溶液用冰块冷却至0-5℃，30min后加入质量占M1、M2、M3总质量的0.1-5％的引发剂，10min后注射占M1、M2、M3总质量0.5-3％的催化剂，氮气保护下，继续搅拌5-20min，直至混合溶液开始出现粘稠状；

3)将粘稠状的混合溶液立刻倒入厚度为2mm的玻璃模具中，于15-30℃下静置进行原位自由基聚合反应15-48h，然后将反应产物浸泡于去离子水中2周，得到所述的生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶。

所述的单体M1为异丙基丙烯酰胺或双乙基丙烯酰胺；

所述的无机纳米粉体M2为锂皂石或硅酸镁锂；

所述的生物大分子M3为聚羟基丁酸酯(PHB)或聚(羟基丁酸-羟基戊酸酯)(PHBV)或聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)中的一种；

所述的引发剂为过硫酸铵(APS)或过硫酸钾(KPS)；

所述的催化剂为N，N，N’N’-四甲基乙二胺或亚硫酸钠；

本发明的原理是：M1单体所得的聚合物(PNIPAM)对环境温度敏感，M2在水溶液中被剥离成纳米片层的无机纳米粉体可作为物理交联剂，加入引发剂后，分子链紧密吸附在无机纳米粉体片层表面，引发单体聚合反应，形成的PNIPAM分子链的一端锚固于无机纳米粉体片层表面，另一端的活性中心继续链增长，而经超声打碎的M3所形成的小分子链在聚合过程中可进入凝胶网络中，M3中的羰基(C＝O)也可水形成氢键，最终形成纳米复合凝胶网络.

本发明的有益效果：

(1)选择无毒性、生物相容性良好的聚羟基脂肪酸酯作为第二组分，无机纳米粉体作为物理交联剂，采用原位自由基聚合制备纳米复合水凝胶，同时具有优异的温度响应性、生物相容性和较高综合机械性能，可用于组织工程中各种基质材料的制备。

(2)制备方法简单、不需要特殊设备，常压常温下操作、易于可控，成本低廉，适于应用；

(3)所制备的纳米复合水凝胶可通过改变温度(如从37℃降低到20℃)实现细胞的自动脱附，避免胰蛋白酶消化法造成的细胞功能损伤；

(4)所制备的纳米复合水凝胶的生物相容性和力学性能可通过改变反应物组分和无机纳米粘土用量来调节。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细阐述。对实施例中得到的纳米复合水凝胶，采用Zhang等Colloid Poly Sci.2005，283：431-438文献公开方法进行温度敏感性检测，采用Wang等J.Mater.Sci.Mater.Med.2009，20：583文献公开方法进行生物相容性检测。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

将1.20g异丙基丙烯酰胺、0.25g锂皂石、0.05g聚羟基丁酸酯依次加入10mL去离子水中，在20℃的密封容器中，通入氮气，超声分散30min，搅拌45min，直至完全分散形成均一溶液；将上述混合溶液用冰块冷却至3℃，30min后加入0.01g过硫酸铵，10min后注射20μL N，N，N’N’-四甲基乙二胺，氮气保护下，继续搅拌10min，直至混合溶液开始出现粘稠状；将粘稠状的混合溶液立刻倒入厚度为2mm的玻璃模具中，于20℃下静置进行原位自由基聚合反应24h，然后将反应产物浸泡于去离子水中2周，即得到所述的生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶。

所得纳米复合水凝胶：体积相转变温度为33.2℃，在37℃下，10分钟内失水率为90％，35分钟就达到了失水平衡；肝肿瘤细胞(HepG2)在第4天时生殖速度最快，细胞数量最多，当温度从37℃降至20℃时，可实现自动脱附。

实施例2

将1.0g异丙基丙烯酰胺、0.2g硅酸镁锂、0.3g聚(羟基丁酸-羟基戊酸酯)依次加入10mL去离子水中，在20℃的密封容器中，通入氮气，超声分散30min，搅拌60min，直至完全分散形成均一溶液；将上述混合溶液用冰块冷却至2℃，30min后加入0.02g过硫酸铵，10min后注射40μL N，N，N’N’-四甲基乙二胺，氮气保护下，继续搅拌10min，直至混合溶液开始出现粘稠状；将粘稠状的混合溶液立刻倒入厚度为2mm的玻璃模具中，于25℃下静置进行原位自由基聚合反应20h，然后将反应产物浸泡于去离子水中2周，即得到所述的生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶.

所得纳米复合水凝胶：体积相转变温度为32.9℃，在37℃下，10分钟内失水率为83％，30分钟就达到了失水平衡；肝肿瘤细胞(HepG2)在第2天时生殖速度最快，细胞数量最多，当温度从37℃降至20℃时，可实现自动脱附。

实施例3

将1.3g双乙基丙烯酰胺、0.15g锂皂石、0.05g聚3-羟基丁酸-3-羟基己酸酯(PHBHHx)依次加入10mL去离子水中，在20℃的密封容器中，通入氮气，超声分散30min，搅拌30min，直至完全分散形成均一溶液；将上述混合溶液用冰块冷却至3℃，30min后加入0.015g过硫酸铵，10min后注射30μL N，N，N’N’-四甲基乙二胺，氮气保护下，继续搅拌10min，直至混合溶液开始出现粘稠状；将粘稠状的混合溶液立刻倒入厚度为2mm的玻璃模具中，于25℃下静置进行原位自由基聚合反应30h，然后将反应产物浸泡于去离子水中2周，即得到所述的生物相容性和温敏性纳米复合水凝胶。

所得纳米复合水凝胶：体积相转变温度为33.9℃，在37℃下，10分钟内失水率为92％，25分钟就达到了失水平衡；肝肿瘤细胞(HepG2)在第2天时生殖速度最快，细胞数量最多，当温度从37℃降至20℃时，可实现自动脱附。