一种利用微生物生物降解微囊藻毒素的方法

摘要

一种利用微生物生物降解微囊藻毒素的方法，属于生物技术领域。本发明筛选微生物菌种鞘氨醇单胞菌USTB－05，将培养的高细胞浓度鞘氨醇单胞菌USTB－05菌液或从细胞中提取制备的酶作为一种生物催化剂，通过投加的方式去除水体中的MCs，或者应用于有MCs存在的污水生物处理工艺中的降解去除MCs，具有安全、经济、高效的特点，在降解去除蓝藻水华所产生的MCs污染方面具有重要的应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及筛选微生物菌种(鞘氨醇单胞菌USTB-05，英文名称为Sphingomonas sp.USTB-05，菌种保藏编号：CGMCC No.3009，保藏日期2009年4月13日)及酶制剂降解去除微囊藻毒素(Microcystins，简称：MCs)的方法。

背景技术

近年来蓝藻水华频频暴发，特别是太湖、滇池、巢湖三大湖泊每年都会发生不同程度的蓝藻水华。蓝藻水华最大的危害之一是产生并向水体中释放各种藻毒素，其中MCs是产生量最大、分布最广泛和造成危害最严重的藻毒素种类。MCs是一类由7个氨基酸组成的单环七肽，由于在2个主要可变位置可以用不同氨基酸进行替换，因此已发现了70多种不同类型的MCs，其中在2个可变位置含有一个亮氨酸和一个精氨酸的MC-LR；在2个可变位置都含有精氨酸的MC-RR是世界和我国蓝藻水华的水体中最为常见的2种MCs类型。研究结果显示MCs的主要靶器是肝脏，主要表现为使肝脏充血肿大，严重时可导致肝出血和坏死。MCs致毒机理是通过抑制肝细胞中蛋白磷酸酶的活性，诱发细胞角蛋白高度磷酸化，导致哺乳动物肝细胞微丝分解、破裂和出血。另据调查发现，饮用水中痕量MCs的存在与人群中原发性肝癌和大肠癌的发病率有很大的相关性。

由于MCs是环状多肽，物理化学性质非常稳定，传统的水处理工艺不仅不能去除MCs还会使其含量增高。目前从水中去除MCs的方法主要有物理吸附、化学氧化、光降解以及生物降解等。物里和化学方法去除MCs普遍存在投入成本高，利用率低以及容易造成二次污染等缺点。与其他方法相比，微生物法降解去除MCs具有成本低、安全性强、利于生态修复等优点，是一种很有前途的去除MCs的方法，因此近几年国内外学者在这方面作了大量工作。我国学者采用序批式生物膜反应器对3种类型MCs进行降解的实验显示，混合菌对MCs有一定的降解能力，好氧条件对MCs的降解好于厌氧条件，但在3d内MCs的去除量都低于400μg/L。日本学者发现从天然水体中分离出的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)对MC-LR和MC-RR有降解能力，降解速率分别达到每天13.0和5.4mg/L，远远高于生物膜反应器去除MCs的水平，这也是目前世界上报道的最大MCs生物降解速率。澳大利亚学者研究了鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)对MC-LR的降解途径，发现至少有3种微囊藻毒素酶参与了MC-LR的催化降解反应，并将对应的基因进行了克隆和分子特点识别。此外，国内外也有关于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伯克霍尔氏菌(Burkholderia)、芽孢杆菌(Bacillus)等菌种对MCs有降解能力的报道。自2000年以来，我们经过多方面的研究探索，从云南滇池底泥中成功筛选出了一株高效降解MCs的微生物纯菌种，不仅具有非常重要的进一步研究的价值，而且在高效降解去除MCs方面具有重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效生物降解去除MCs的方法，采用筛选自滇池底泥的一株鞘氨醇单胞菌USTB-05经培养后制成的菌剂或制备的酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂，投加入受MCs污染的水体，使MCs得到高效降解去除，解决当前蓝藻水华污染水体中MCs难以去除的难题，

本发明筛选微生物菌种鞘氨醇单胞菌USTB-05，英文名称为Sphingomonassp.USTB-05，菌种保藏编号为：CGMCC No.3009，将培养的高细胞浓度鞘氨醇单胞菌USTB-05菌液或从细胞中提取制备的酶作为一种生物催化剂，通过投加的方式去除水体中的MCs，或者应用于有MCs存在的污水生物处理工艺中的降解去除MCs，具体方法为：

(1)配制鞘氨醇单胞菌USTB-05液体培养基，其组成为(每升)：MgSO4·7 H₂O1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 4.0g，NaCl 1.0g，CaCl₂ 20mg，FeSO₄ 5mg，ZnCl₂ 5mg，MnCl₂·4H₂O 5mg，CuCl₂ 0.5mg，在此基础上加入15.0g的葡萄糖和1.5g酵母浸粉作为液体培养基。培养基经高温121℃灭菌20分钟，然后在超净工作台紫外线下灭菌20分钟后使用。

(2)按1％的接种量将鞘氨醇单胞菌USTB-05菌液接种于液体培养基中，在温度30℃，摇床转速200转/分条件下批量培养3天后，采用离心后(12000转/分，10分钟)倒去上清液的方法收获鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞，最后将收获的鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞保存在0.5％的NaCl溶液中作为菌剂，冷冻保存备用。

(3)取鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞悬浊液置冰浴中超声破碎，破碎条件：超声功率400W，间隔2秒，超声破碎10秒，破碎时间15分钟(每次5分钟)。细胞破碎完毕后，将细胞破碎液进行18000转/分20分钟的离心，然后缓慢倒出上清液作为鞘氨醇单胞菌USTB-05的无细胞提取液(酶制剂)，冷冻保存备用。

(4)根据水体受MCs的污染程度或污水处理过程的不同，将培养制备的鞘氨醇单胞菌USTB-05菌剂及酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂投加入受污染水体，达到迅速高效降解去除MCs的目的。

本发明的优点在于：

(1)筛选的鞘氨醇单胞菌USTB-05对MCs有很强的降解能力，研究发现鞘氨醇单胞菌USTB-05在20小时内可以将初始浓度分别为36.1mg/L MC-RR和21.0mg/L MC-LR完全降解，远高于国外报道的日降解MC-RR和LR速率13.0和5.4mg/l的水平。

(2)鞘氨醇单胞菌USTB-05易于培养且对水生生物无毒害作用，采用其作为生物催化剂具有安全、经济、高效的特点，，在降解去除蓝藻水华所产生的MCs污染方面具有非常重要的意义。

附图说明

实验所用微生物菌种为鞘氨醇单胞菌USTB-05，菌种保藏编号：CGMCCNo.3009，保藏日期2009年4月13日。

图1是筛选鞘氨醇单胞菌USTB-05基于16S rDNA的分子进化树

图2是鞘氨醇单胞菌USTB-05降解MC-RR和MC-LR的动力学过程

图3是鞘氨醇单胞菌USTB-05酶催化降解MC-RR和MC-LR的动力学过程

图1显示我们筛选的鞘氨醇单胞菌USTB-05与其他的鞘氨醇单胞菌虽然有一定的亲缘关系，但相似度没有达到100％，因此我们筛选的鞘氨醇单胞菌USTB-05属于一株新的鞘氨醇单胞菌菌株。

图2表明鞘氨醇单胞菌USTB-05在20小时内可以将初始浓度分别为36.1和21.0mg/L的MC-RR和MC-LR完全降解，说明鞘氨醇单胞菌USTB-05对MCs具有很强的生物降解能力。

图3表明从鞘氨醇单胞菌USTB-05的无细胞提取液(酶制剂)能够以更快的速率催化降解MC-RR和MC-LR，在5小时可以将初始浓度分别为60mg/L和30mg/L的MC-RR和MC-LR全部降解。

具体实施方式

1.首先配制鞘氨醇单胞菌USTB-05的生长培养基，其组成为(每升)：MgSO4·7H₂O 1.0g，KH₂PO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 4.0g，NaCl 1.0g，CaCl₂ 20mg，FeSO₄5mg，ZnCl₂ 5mg，MnCl₂·4H₂O 5mg，CuCl₂ 0.5mg，在此基础上加入15.0g的葡萄糖和1.5g酵母浸粉作为鞘氨醇单胞菌USTB-05生长的碳源和氮源。用500毫升三角瓶加入配制好的液体培养基100毫升，在高温高压(121℃)下进行灭菌20分钟，然后在洁净工作台内紫外线照射下再灭菌20分钟。

2.在洁净工作台内无菌条件下，接种1毫升鞘氨醇单胞菌USTB-05菌液于三角瓶液体培养基中，在温度30℃，摇床转速200转/分条件下进行批量培养3天后，采用离心后(12000转/分，10分钟)倒去上清液的方法收获鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞，最后将收获的鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞保存在0.5％的NaCl溶液中作为菌剂，如果暂时不用可放在-80℃低温冰箱中长期保存。

取鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞悬浊液20ml加入到50ml玻璃管中，将此玻璃管插入冰水中后，用超声波细胞破碎仪对鞘氨醇单胞菌USTB-05细胞进行破碎，条件是：超声功率400W，间隔2秒，超声振荡10秒，破碎时间15分钟(每次5分钟)。细胞破碎完毕后，将细胞破碎液进行18000转/分20分钟的离心，然后缓慢倒出上清液作为鞘氨醇单胞菌USTB-05的无细胞提取液(酶制剂)，如果暂时不用也可放在-80℃低温冰箱中长期保存。

3.根据受蓝藻水华污染饮用水或其它水体中的MCs浓度，将培养制备的鞘氨醇单胞菌USTB-05菌及酶制剂作为一种快速、安全和高效的生物催化剂按一定比例进行投加，达到迅速高效降解去除MCs的目的。

4.对于发现有MCs存在的污水生物处理过程中，也可以按一定比例投加鞘氨醇单胞菌USTB-05菌及酶制剂，使污水处理场去除MCs的效率得到大幅度提高。