来自担子菌纲的肽酶

摘要

本发明涉及源自担子菌纲菌丝体的肽酶酶类，尤其涉及谷蛋白特异的肽酶酶类，涉及产生它们的方法和涉及它们在蛋白质水解中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及源自担子菌纲(Basidiomycetes)菌丝体的肽酶酶类，尤 其涉及谷蛋白特异的肽酶(gluten-specific peptidase)酶类，涉及产生它们 的方法和涉及它们在蛋白质水解中的用途。

发明背景

植物蛋白质的水解代表最古老的食品生物技术工艺之一。在亚洲国 家，经验传承了几个世纪，将大豆蛋白质水解以产生尤其是酱油，其中所 述酱油是一种大豆调味汁和常用调味品，其在西方世界几乎成为了中餐的 同义词。在这些冗长的、有时是常年的工艺中，所需的肽水解活性源自生 长在各自的植物底物中的曲霉属(Aspergilli)、乳酸细菌和酵母的连续发 酵。

西方国家用小麦、稻或者花生蛋白质来模拟该过程，并且利用酸水解 来代替酶水解，如使用盐酸，以有效地打开动力学上非常稳定的肽键。这 种通常称为经水解的植物蛋白质(HVP)的产品要么是液态调味品，要么 是经浓缩的，以获得膏状物、粉状物、预混合物用于汤或者调味料组合物 中，或者以获得浓缩固体汤料(stock cube)。尽管在工艺的任何阶段都不 涉及肉类，但所有产品都具有肉样气味和味道。

由于水解过程完成后需要中和酸，因此加入氢氧化钠。该中和反应过 程中形成的氯化钠支持了植物水解产物的味道增强特性，并且在最终产品 中常常是受欢迎的。

然而，酸水解也存在许多缺点。强酸和强碱是危险物质，且认为同安 全和食品等级操作不协调，尤其在100℃以上的温度。更大的问题是二氯 化合物不可避免的形成，如1，2-和1，3-二氯丙醇，这些物质在动物喂饲研 究中表现出致癌性。原材料的脂类部分与盐酸的接触也会产生氯化类固 醇，而化合物如5-(氯甲基)糠醛源自梅拉德途径。

为了避免危险或有毒化合物的形成，注意力重新回到酶促工艺，其中 这些化合物不是必需的也不会形成。因而，对改进酶促工艺呈现出了极大 的兴趣。

依据肽酶作用于蛋白质底物的机制(内肽酶或外肽酶；外肽酶可以是 氨肽酶或羧肽酶)或者四种催化机制中的一种来对肽酶分类。由胰凝乳蛋 白酶和枯草杆菌蛋白酶超家族代表丝氨酸内肽酶(Serin-endopeptidases)； 它们表现出广的底物特异性，并且含有所谓的催化三分体(catalytic triade)。四个超家族代表了半胱氨酸内肽酶，它们存在于微生物、植物 和动物源中；该名称指出在催化三分体中的半胱氨酸部分。天冬氨酸内肽 酶通过两个天冬氨酸部分的协调作用来剪切肽键。金属肽酶在进化上是古 老的，通常为具有外切和内切特异性的含锌酶。

常见肽酶，如碱性蛋白酶(alcalase)(来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的丝氨酸肽酶)、木瓜蛋白酶(来自番木瓜(Carica papaya) 的半胱氨酸肽酶)、来自重组的毛霉属(Mucor)菌株的凝乳酶(粗制凝 乳酶)和中性蛋白酶(neutrase)(来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 的金属肽酶)。US 3694316描述了用于从担子菌纲制备蛋白酶的方法。其 它商业化的肽酶，如链霉蛋白酶或者，是由细菌如灰色链 霉菌(Streptomyces griseus)或者子囊菌纲(ascomycete)真菌如米曲霉 (Aspergillus oryzae)产生的多种活性类型的混合物。

酶促工艺由于它的生物催化性质而能在温和的物理条件下进行，并且 因此比酸催化工艺更环保。然而，与酸水解相反，酶促工艺常常反应不完 全，并且可导致有苦味的部分水解产物；苦味的水平随着水解程度的增加 而增加，达到最大，然后随着水解的进行而下降。

已经公开了提高酶促工艺(Pedroche，J.等人，Electronic Journal of Environmental，Agricultural and Food chemistry，2003)和避免苦味肽形成 (Maehashi K.等人，Molecular Methods of plant Analysis，2002，47-68)的 许多尝试。植物蛋白质(Lamsal，B.P.等人，Journal of the American Oil Chemists’Society，83(8)，731-737，2006)或者动物来源的蛋白质(Je，J.等 人，European Food Research and Technology，221(1-2)，157-162，2005)， 或者像米糠这样的加工废弃物都已经作为底物(Jarunrattanasri，A.等人， ACS Symposium Series，83-97，2005)。如血红蛋白、酪蛋白和胰岛素这样 的底物也已经用于研究(Suzuki，N.等人，Phytochemistry，2005，66， 983-990)。

已建议了来自许多微生物源、甚至来自病原体物种的酶(Moreira，F.G. 等人，Brazilian Journal of Microbiology，36(1)，7-11，2005)。例如，发现 来自刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)的天冬氨酸肽酶对酪蛋白是有活性的 (Wang，H.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2001，289，750-755)。 来自叶状奇果菌(Grifola frondosa)和糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的 金属肽酶已经得到了表征和机制的评价(Nonaka，T.等人，J.Biol.Chem.， 1997，272，30032-30039；Hori，T.等人，Acta Crystallogr.D Biol. Chrystallogr.，2001，57，361-368)。EP1074632也涉及使用真菌培养物进行 蛋白质的酶促水解。

已经建议了组合水解活性以显示协同特性(Minones Conde，J.等人， Journal of Agricultural and Food Chemistry，53(20)，8038-8045，2005)。谷 氨酰胺酶活性的存在对获得具有浓郁和典型味道的水解产物至关重要 (Schlichtherle-Cerny，H.等人，Journal of Agricultural and Food Chemistry，50(6)，1515-1522，2002，和EP 1290951)。US3912822涉及用 于产生具有特别高的谷氨酸含量的蛋白质水解产物的工艺。

然而，只有极少数专利对水解产物的化学组分(US 6465209)或者对 优先切割的肽键类型(JP 01291795)作了详细描述。

植物酶特别适合于降解植物底物；使用同一种植物作为蛋白质和酶的 来源是令人感兴趣的想法(Tchorbanov，B.，Special Publication-Royal Society of Chemistry，491-494，2001)。

大豆(WO 2002/069733；WO 2004/056980)和小麦(WO2006/104022， Abe，M.等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.，2003，67，2018-2021)仍然是最 常用的酶促水解底物，而动物蛋白质的水解常常作为最小化食品加工旁支 (side streams)的尝试，如鱼骨或血液(JP 2005176620；RU2003-106447)。 在使用的微生物中有细菌的组合(WO2002/085131)、常见物种的混合物 (JP2006/075006)、重组曲霉属(JP2005/328738)、或担子菌纲 (JP2006/094757)。J.等人在J.Biotechnology，128期，297-307 页，2006年中报道了欧洲担子菌纲(European Basidiomycetes)的肽分解的 多样性。如果生物催化剂不是完整细胞，建议使用单一的肽酶如中性蛋白 酶(WO2006/103628)、或使用植物和微生物酶的组合(WO2002/078461； CN1397644)。

如果目的在于高程度的水解，那么水解活性的混合物也是可以利用的 (WO2001/076391；WO2003/061675；WO2002/001961)。在使用来自放 线菌属(Actinomycetes)的酶然后使用来自担子菌纲的血红栓菌(Trametes sanguinea)的酶的顺序工艺中产生了富含5’-核苷酸的酵母提取物 (JP2004/229540)。已要求保护了乳杆菌属(Lactobacillus)菌株，以提 供具有特定特性的谷氨酰胺酶，以提高谷氨酸的产量(EP1290951)。

使用碱性蛋白酶(alcalase)、胰酶制剂(pancreatin)或胃蛋白酶(Kong， X.等人，Food Chemistry，101，615-620，2007)、或木瓜蛋白酶(Wang，J. 等人，Food Chemistry，101，1658-1663，2007)实现了尤其是小麦谷蛋白的 肽水解。最后，也已知使用商业可得到的酶酶促地水解小麦谷蛋白。然而， 研发WGH-te(小麦谷蛋白水解产物-工艺酶(Wheat Gluten Hydrolysate--technical enzymes))工艺的关键点主要是这些酶的高成本、 自水解产物以高产率分离固体物和水解产物的微生物学保护的高成本，因 为它们是在无盐浓度或低盐浓度、在可允许某些腐败微生物的温度时进行 的。

发明目的

本发明的目的因此是提供肽酶酶类的备选来源，其至少克服了一些上 述的不便。

发明概述

因此，本发明的第一个方面提供了产生蛋白质和/或其部分(fractions) 的水解产物的方法，包括以下步骤：

a.提供获自担子菌纲菌丝体的肽酶的混合物，

b.将混合物添加到含有所述蛋白质和/或其部分的底物，和

c.进行所述蛋白质和/或其部分的水解以获得所述水解产物。

本发明的第二方面涉及获自担子菌纲菌丝体的肽酶的混合物的用途， 用于谷蛋白和/或其部分的水解。

根据权利要求1到7中任意一项所述的方法获得的水解产物在食物组 合物、化妆组合物和/或药物或医药组合物中的用途也是本发明的一部分。

本发明的其它方面涉及产生肽酶的混合物的方法，该方法包括：

a.在包含谷蛋白和/或其部分的生长培养基中培养担子菌纲菌丝体， 和

b.自培养物分离肽酶的混合物，

涉及根据权利要求11到16中任意一项所述的方法可获得的肽酶的混 合物。

最后，肽酶的混合物也构成本发明的一部分，其中所述混合物具有对 谷蛋白和/或其部分的底物特异性。

附图

本发明将通过引用在附图中显示的一些实施方案在下文中进行描述， 其中：

-图1显示在8天的培养期间由柱状田头菇(Agrocybe aegerita) 分泌的蛋白质(A)和肽酶(B)的银染色凝胶(A)和活性染色凝胶(B)。

-图2是在大于100kDa的谷蛋白部分(gluten fractions)上生长的刺 芹侧耳的肽酶的活性染色凝胶。

-图3是在纯的谷蛋白上生长的叶状奇果菌的肽酶的活性染色凝 胶。

-图4显示由六种担子菌纲物种分泌的肽酶混合物的最佳pH。

-图5显示由六种担子菌纲物种分泌的肽酶混合物的最佳温度。

-图6是紫孢侧耳(Pleurotus sapidus)(泳道2)、刺芹侧耳(泳 道3)、叶状奇果菌(泳道4)和香菇(Lentinula edodes)(泳道5)的分 泌蛋白质组(secretome)和肽酶的IEF(等电聚焦凝胶电泳)。

-图7显示使用在抑制剂存在时的活性染色来对紫孢侧耳的肽酶的 催化机制的评价。

-图8是显示由佛罗里达侧耳(Pleurotus floridanus)(pfl)和叶状 奇果菌(Gfr)的肽酶释放的游离蛋白质的图。

-图9是显示使用佛罗里达侧耳(pfl)和叶状奇果菌(Gfr)的粗 肽酶产生的水解产物的甲醛数的图。

发明详述

在本申请中，术语肽酶和蛋白酶可互换使用，并且将它们指定为能剪 切一个或多个肽键，并因此能不同程度地水解蛋白质的任意酶。

本发明涉及蛋白质和/或其部分的水解产物的产生。在第一步，提供了 获自担子菌纲菌丝体的肽酶的混合物。

担子菌(Basidiomycota)这一分支是真菌界的一支很大的分类群，其 包括产生称为担子(basidium)的棒形结构孢子的物种。担子菌分为三种 主要的类别，Hymenomycotina(层菌纲(Hymenomycetes)；蕈类 (mushrooms))、Ustilaginomycotina(黑粉菌纲(Ustilaginomycetes)； 真黑粉菌(true smut fungi))，和Teliomycotina(锈菌纲 (Urediniomycetes)；锈菌类(rusts))。

优选地，本发明方法中使用的担子菌纲菌选自层菌纲菌。更优选地， 它们选自侧耳属(Pleurotus)、香菇属(Lentinula)、田头菇属(Agrocybe) 或奇果菌属。甚至更优选地，担子菌纲菌选自紫孢侧耳的菌株、刺芹侧耳 的菌株、糙皮侧耳的菌株、香菇的菌株、柱状田头菇的菌株、佛罗里达侧 耳的菌株或叶状奇果菌的菌株。通过商业化的培养物保藏中心，如DSMZ (德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Braunschweig，德国)，此类菌株是商业可获得的。

这些蕈类的大多数一般生长在死的或者腐烂的木材上。因此，它们以 它们强大的纤维素酶(褐腐真菌(brown rot fungi))和木质素降解能力 (白腐真菌(white rot fungi))而闻名。白腐真菌的典型酶是木质素过氧 化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和产生H₂O₂的一些氧化酶类。由于落叶材 和针叶材并不含有显著量的蛋白质，因此在这个特定的天然生活生境生长 的蕈类中发现高的肽酶活性是令人吃惊的。

根据本发明，肽酶的混合物获自所述微生物的菌丝体。由于避免了大 量子实体，菌丝体的使用提供了容易产生和培养方面的优点。也作为大规 模地使用这些物种作为食物的结果，毒理学的危险可忽略。

这些真菌能在对培养基补充物具最低需求的浸没培养中生长。必须存 在碳源、氮源和磷源；优选地添加在微生物的所有营养培养基中推荐的微 量和痕量元素的常用混合物。生物质产生的这种方法在温和条件下进行， 并且该方法是环保的。

温度是中等的、一般在10-35℃，优选地在20-30℃的范围。培养基 pH大约4-8，优选的pH大约5-7，且低光条件是该方法典型的条件。

肽分解活性分泌到无菌丝体的培养上清液中，该培养上清液利于生物 过程的操作并利于使用本领域公知的技术分离和富集酶，如离心、超滤或 沉淀作用。这样就可以获得肽酶的无细胞浓缩培养上清液，并进一步用于 水解。尽管使用本领域公知的技术可以分离酶，但是没有必要这样做，并 且在本方法中也还可使用获得的粗混合物。

获自担子菌纲菌丝体的肽酶的混合物优选地包含至少一种肽酶，所述 肽酶具有如在序列表(1)、(2)、(3)或(4)中所示的部分序列。

(1)：DGNASPASLSTK

(2)：QLSGLPSGTLNDLAR

(3)：TVQTNAPWGLSR

(4)：APSALTVGASTLTDTR

在本发明方法的第二步，将肽酶的混合物添加到含有蛋白质和/或其部 分的底物中。该肽酶的混合物可以获自上述一种微生物菌株或者可以获自 上述一种以上的微生物菌株的肽酶的混合物。蛋白质可以选自任何动物源 或植物源，并且可以是谷蛋白、乳清、大豆等。所述蛋白质可以源自小麦、 小麦粉、大豆(或压榨饼(press cake))、羽扇豆、黄豆(yellow beans)、马 铃薯、谷物、大麦、扁豆、奶等。优选地，所述蛋白质源自植物源。更优 选地，所述蛋白质源自小麦属(Triticum L)(小麦)栽培品系。最优选 地，所述蛋白质是谷蛋白或其部分。

肽酶通常以总水平0.0005％-5％，优选地0.0001％-2％纯酶重量分散 应用于蛋白质底物，所占比例取决于比活度。能将酶作为单独的组分加入 (含有一种酶的丸剂、颗粒剂、稳定的液体等)或者作为两种或多种酶的 混合物(如共粒化物(cogranulates))加入。

在最后一步，进行所述蛋白质和/或其部分的水解以获得所述水解产 物。可以用于蛋白质的水解的条件是标准条件，并且该条件可以由本领域 技术人员容易地测定。例如，反应可包括支持催化活性的存在，其中所述 催化活性来自微生物或其它酶源。

图1A显示在培养柱状田头菇菌丝体后，蛋白质的混合物(如肽酶) 的存在和图1B显示所述肽酶的酶促活性。

通过本发明方法获得的水解产物可以是多种大小的肽，也可以是单个 氨基酸。它们能进一步加工为液体。具体而言，可以将溶液进行脱色和过 滤步骤。然后，精制的液体可以根据应用的需要形式浓缩到任何程度。所 有的这些HVP产物都具有令人愉快的可口的和肉的香味。

水解产物可以用于食物组合物、化妆组合物和/或药物或医药组合物。

因此，组合物可以是饮料、乳酪、糖果、餐后甜点、调味品、果汁饮 料、肉产品、快餐、营养补充物、饲料、宠物食品补充物、医学饮食、皮 肤或毛发产品、肥料、兽用制品、用于哺乳动物细胞体外培养的成分等。

此外，水解产物可以用作乳化剂、泡沫稳定剂、水结合剂等。在食物 中使用时，根据本发明获得的水解产物可以用作食品香料(food flavour) 或食品香料前体(food flavour precursor)。

因此，用于蛋白质且尤其是用于谷蛋白和/或其部分的水解的获自担子 菌纲菌丝体的肽酶的混合物的用途是本发明的一部分。

本发明的肽酶催化蛋白质水解，尤其是催化谷蛋白水解成较大和较小 的肽并最终水解成氨基酸。虽然完整蛋白质并不赋予食物味道或气味，根 据本发明方法可获得的游离氨基酸对作为用于汤类、酱类和许多种方便食 品的香料化合物和香料前体是非常有用的。此外，所述肽酶处理能与剪切 不同肽键的另一酶组合，以进一步改进食物产品的风味和/或香味。

水解程度能目视地评定或使用分析化学评定。谷蛋白底物是一种柔软 的、粘性的类似口香糖的物质。在含有肽酶的缓冲液中孵育后，该物质显 示典型的降解征象，即所述谷蛋白底物变成了具有一些较大的和许多细粒 子和极细粒子的混浊分散体。

水解也能通过在肽水解前和后确定溶液中的游离蛋白质来测量(图 8)、通过测量溶液中的游离氨基氮来判断(Kjeldahl或甲醛数(图9))、 通过使用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)跟踪蛋白质 降解来测量、或通过薄层层析接着通过水合茚三酮检测来测量。

通过甲醛数测定的本发明的肽酶的混合物的水解程度可以为3-20DH， 优选地为6-19DH；分散体中总可溶蛋白质可以至少为10％，优选地为 19％-80％。

本发明的另一个方面涉及肽酶的混合物的产生方法，该方法包括在包 含谷蛋白和/或其部分的生长培养基中培养担子菌纲菌丝体的步骤和自培 养物分离肽酶的混合物的步骤。

优选地，谷蛋白和/或其部分是生长培养基中主要的氮源。

将谷蛋白部分用于本方法时，该谷蛋白部分可以大于100kDa，在5kDa 到100kDa之间，或为经加工的谷蛋白水解产物。培养物可以包含任何这 些谷蛋白部分的混合物。所述谷蛋白部分可以商业获得或者通过技术人员 公知的方法产生。

优选地，本发明方法中使用的担子菌纲菌丝体选自层菌纲。更优选地， 它们选自侧耳属、香菇属、田头菇属或奇果菌属。甚至更优选地，担子菌 纲菌选自紫孢侧耳的菌株、刺芹侧耳的菌株、糙皮侧耳的菌株、香菇的菌 株、柱状田头菇的菌株、佛罗里达侧耳的菌株或叶状奇果菌的菌株。通过 商业化的培养物保藏中心，如DSMZ(德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)， Braunschweig，德国)，此类菌株是商业可获得的。

优选地，培养由浸没培养1-15天实施，优选地由浸没培养3-12天实 施。

培养后，自培养物分离产生的肽酶的混合物。所述肽酶的混合物能通 过沉淀和/或离心分离来进一步浓缩。

因此，通过本方法获得的肽酶的混合物也构成本发明的一部分。由所 述方法提供的优点是所得的肽酶的混合物在谷蛋白的水解中具有明显的 亲和力和提高的功效。根据本发明的肽酶的混合物对谷蛋白和/或其部分具 有底物特异性。

更令人吃惊的是这些酶关于转换谷蛋白成较小的肽和最终转换成单 个氨基酸的卓越性能。肽酶的粗混合物能非常有效地和温和地水解 5-100kDa的谷蛋白部分(图1)、水解大于100kDa的谷蛋白部分(图2)、 和水解天然的未经处理的谷蛋白(图3)。不需要除了水以外的添加剂或 辅被用物(co-substrate)。孵育培养基是简单的，且所述孵育培养基可含有 如0.5g/L MgSO₄、1.5g/L KH₂PO₄、0.4％吐温80和痕量元素溶液。

通过经典的偶氮酪蛋白测试法(azocasein assay)分析测定，新的肽 酶具有广的在40℃到60℃之间的最佳温度和同样广的在4.5到7之间的 最佳pH(图4和5)。使用IEF(等电聚焦凝胶电泳)和非变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳(PAGE)测定，等电点覆盖范围为4-10，多种同工酶的分子 量范围为低于30kDa-多于100kDa(图1、2、3和6)。特异的抑制研究 已经显示，大多数的同工酶是丝氨酸和天冬氨酸肽酶，但是还不能将一些 同工酶指定为典型种类中的一种(图7)。

通过ESI-MS分析测定了谷蛋白诱导的两种代表性的新的肽酶的特有 部分序列(表1)。最佳的同源性发现是二孢蘑菇(Agaricus bisporus)(食 用伞菌(Champignon))的丝氨酸肽酶。因此，将新酶分类为肽酶，证 实了是水解酶的一个亚类(EC 3.4.X.X)。

表1叶状奇果菌(Gfr)和佛罗里达侧耳(Pfl)的肽酶的部分序列

在此，本发明将通过以下非限制性实施例说明的方式进一步进行描 述。

实施例

以下的实施例中，使用以下的材料和方法。

材料和方法

培养上清液的浓缩

为了浓缩分泌的肽，将培养上清液用总浓度为80％的乙醇在-20℃沉 淀3小时。沉淀物在4℃，12,000xg离心20分钟，并将所述沉淀物保存于 -20℃。

生物化学的酶特性

肽酶的生物化学的特性包含最佳pH和最佳温度的测定、通过具活性 染色的IEF的等电点的测定(图6)和通过SDS-PAGE的分子量分析。

SDS-PAGE和非变性PAGE

SDS-PAGE分析在12％聚丙烯酰胺分离凝胶中进行。通过混合20μL 酶溶液和20μL上样缓冲液[0.1M Tris/HCl(pH 6.8)、0.2M DTT、4％SDS、 20％甘油、0.2％溴酚蓝]并将其煮沸15分钟来制备样品。每一凝胶20mA 电泳后，将凝胶银染色或考马斯(Coomassie)染色。对于分子量测定， 使用250-10kDa(BioRad，德国)的标记蛋白质。

非变性PAGE在非变性条件下进行。分离凝胶包含0.04％猪的明胶。 样品通过和上样缓冲液[0.05M Tris/HCl(pH 6.8)、2％SDS、10％甘油、 0.1％溴酚蓝]1∶1(v/v)混合来制备。在8℃和每一凝胶10mA电泳后， 凝胶在2.5％Triton X-100中洗涤2次。在30℃，0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH 6)中孵育14-18小时后，将凝胶考马斯染色。酶活性显现为 蓝色背景中的白色条带。

等电聚焦

IEF聚丙烯酰胺凝胶电泳在使用具有固定的pH梯度3-10(Serva，德 国)的Servalyt^TM Precotes^TM预制凝胶的Multiphor II系统(Pharmacia LKB，Schweden)上运行3500Vh(2000V，6mA，12W)。肽酶的等电点 使用pI 3.5-10.7的蛋白质试验混合物(Serva，德国)进行5次估计。将凝 胶进行考马斯染色、银染色或活性染色。对于活性染色，研发了一种猪的 明胶琼脂糖覆盖凝胶。琼脂糖(2％)溶解在沸腾的0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH6)中。将相同体积的含0.04％猪的明胶的0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH6)加入。聚焦后，IEF凝胶在30℃，在覆 盖物上孵育14-18小时，并将覆盖凝胶进行考马斯染色。酶活性显现为蓝 色背景中的白色条带。

活性试验

底物溶液由pH6，含0.5％偶氮酪蛋白的0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲 液组成。酶活性在37℃，包含100μL底物和300μL K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲 液(0.1M，pH6)的2mL总体积中测量。反应在添加100μL酶溶液时开 始。

取决于酶活性，反应在15-30分钟后使用1.5mL的三氯乙酸(3％) 终止。将样品保存于冰上10分钟，并11,600xg离心10分钟。上清液的吸 光度使用分光光度计在366nm测量。空白用热灭活的酶溶液制备。

根据以下方程式计算酶活性

$A\left(U{\mathrm{mL}}^{-1}\right)=\frac{\mathrm{\Delta E}60}{0.01V_{s}t}$

其中U是催化偶氮酪氨酸水解的酶活性，该酶活性表示为每小时吸光 度的差。ΔE是空白和样品之间吸光度的差，V_s是样品体积(mL)，和t 是孵育时间(分钟)。

最佳温度和最佳pH

分泌的肽酶的最佳温度和最佳pH的测定通过在最大活性的培养天时 收获的酶溶液来进行。首先，在pH6.0，用上述0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓 冲液进行最佳温度(图5)的测定。在50℃的最佳温度，pH变化为4.5-8.0 (图4)。

催化机制

为了测定催化机制，如上所述进行非变性PAGE分析，其中的改变是 样品制备技术。将酶溶液分别地与1mM PMSF(苯甲磺酰氟)、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mM抑蛋白酶肽和1mM抑胃酶肽A混合。然 后，在电泳前，将样品在4℃，孵育30分钟。

胰蛋白酶消化肽段的ESI-串联MS分析

将肽酶条带从SDS聚丙烯酰胺凝胶切下、干燥和用胰蛋白酶消化。所 得的肽根据标准方法提取和纯化。将装备有纳喷雾离子源和金包被的毛细 管的Qtof II质谱仪(Micromass，U.K)用于肽的电喷离子化(ESI)MS。对 于碰撞诱导解离实验，将多电荷的母离子有选择地从四极质量分析器传输 到碰撞室中(25-30eV)。最终的子离子通过直角时间飞行质量分析器分 离。将获自ESI-串联MS分析的肽质量指纹图谱用于公共蛋白质一级序列 数据库中的杂交物种蛋白质鉴定(表1)。

水解实验

将0.5g谷蛋白悬浮于20mL 0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液中 (pH6.0)。添加18.9kU的酶制备物后，将样品分别在40℃和50℃，110 转/分钟水浴孵育18小时，并将样品在4℃，3000xg离心15分钟。水解通 过在4℃保存上清液来终止。以下的分析方法用于估计水解的程度。

游离蛋白质

水解上清液中蛋白质浓度根据Lowry方法来估计，使用牛血清清蛋白 作为标准。

甲醛数(Formol number)

水解上清液中甲醛数的滴定通过Titroline easy(Schott，德国)来进 行。将3-10mL实验溶液用0.1M NaOH调节到pH8.1。然后，将10mL的 甲醛水溶液加入(pH8.1，35-37％)。1分钟后，将样品用pH8.1，0.1M NaOH 进行滴定。根据以下方程式计算甲醛数

其中，V_s是样品体积(mL)，和V_NaOH是0.1M NaOH的滴定体积(mL)。

Kjeldahl分析

水解上清液中氮的测定根据标准方法在Digestion Unit K-424和 Distillation Unit K-350(Büchi，瑞士)进行。1-5mL实验溶液的氨通过收集 瓶中过量的0.1M HCl来俘获。未消耗的酸溶液的体积的余液滴定通过 0.1M NaOH使用Titroline easy滴定仪来中和。根据以下方程式计算氮的 量

其中，V_s是样品体积(mL)，n_gluten是0.5g谷蛋白中氮的总量 (4.62mmol)。

氨基酸薄层层析法(AA-TLC)

对于TLC分离，将7μL的水解上清液点在包被硅胶的铝板上(20cm x20cm)。然后，将平板放置在有正丁醇/乙酸/水(70∶20∶30 v/v/v)的 小室中4小时。氨基酸的检测通过喷水合茚三酮试剂(0.4g/100mL丙酮) 接着通过在100℃孵育直到色斑出现来实施。产生的氨基酸通过与参照化 合物比较来鉴定。

实施例1-来自六种担子菌纲的肽酶

担子菌纲的培养

在工艺期间，所有培养基和设备在使用前都要用高压灭菌和使用标准 无菌技术。担子菌纲的预培养(表2)在150转/分钟和24℃，在标准营养 培养基(30g/L一水合葡萄糖、3g/L酵母提取物、4.5g/L天冬酰胺一水合 物、0.5g/L MgSO₄、1.5g/L KH₂PO₄、1mL痕量元素溶液、pH6.0[0.08g/L FeCl₃、0.09g/L ZnSO₄x7H₂O、0.005g/L CuSO₄x5H₂O、0.027g/L MnSO₄、 0.4g/L Titriplex III])中生长七天。

20mL菌丝体培养物通过离心分离(10分钟，3000xg，4℃)并用20mL 缺乏额外的碳源和氮源的无机盐培养基(MM)(0.5g/L MgSO₄、1.5g/L KH₂PO₄、1mL痕量元素溶液，pH6.0)洗涤2次。对于主培养物(main cultures)，用20mL预洗的菌丝体接种250mL新鲜的MM。

表2培养的用于酶筛选的担子菌纲

酶诱导

为了诱导酶分泌入生长培养基，分别将无菌的5-100kDa水解产物部 分、大于100kDa部分和加工水解产物添加至主培养物中。在谷蛋白诱导 的情形，制备具有4％谷蛋白的MM。3-12天后，菌丝体通过过滤分离， 并将含胞外酶的上清液用于酶促转换。

实施例2-使用叶状奇果菌的酶制备物

使用4％谷蛋白培养6天后，将Gfr培养物过滤并将含胞外酶的上清 液(200mL)用800mL乙醇(96％)沉淀，在-20℃保存3小时，然后12,000xg 离心20分钟。将一小份沉淀物重悬于0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液 (pH6.0)中30分钟，4℃，并测定上清液的活性。

大多数最初存在的水解的活性都恢复了，表明该方法产生了有用的酶 浓缩物。

实施例3-水解实验

将0.5g谷蛋白悬浮在20mL 0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH6.0) 中，加入18.9kU获自Pfl(佛罗里达侧耳)的肽酶沉淀物，并将样品于40℃， 110转/分钟，水浴孵育18小时。将所述样品4℃，3000xg离心15分钟。 用热灭活的酶制备物制备空白。将5mL上清液用于Kjeldahl分析，7μL 上清液用于AA-TLC。为了显现蛋白质水解，进行样品的SDS-PAGE。

该分析证据表明对困难的底物小麦谷蛋白的逐渐的酶促水解。

实施例4-使用谷蛋白的水解实验

将0.5g谷蛋白悬浮在20mL 0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH6.0) 中，加入18.9kU获自Gfr的肽酶沉淀物，并将样品40℃，110转/分钟， 水浴孵育18小时。将所述样品4℃，3000xg离心15分钟。用热灭活的酶 制备物来制备空白。将3mL上清液用于甲醛滴定法，20μL上清液用于蛋 白质测定。为了显现蛋白质水解，进行样品的SDS-PAGE。

通过备选的分析方法，这证实了谷蛋白的酶促水解。

实施例5-使用组合的酶制备物的水解实验

将0.5g谷蛋白悬浮在20mL 0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH6.0) 中，加入18.9kU获自Gfr和Pfl的肽酶沉淀物，并将样品40℃，110转/ 分钟，水浴孵育18小时。将所述样品4℃，3000xg离心15分钟。用热灭 活的酶制备物制备空白。将5mL上清液用于Kjeldahl分析，3mL上清液 用于甲醛滴定法，7μL上清液用于AA-TLC，20μL上清液用于蛋白质测 定。为了显现蛋白质水解，进行样品的SDS-PAGE。

因此，使用酶的混合物导致谷蛋白的快速水解。

实施例6-使用＞100kDa部分的水解实验

将250μL＞100kDa蛋白质部分悬浮在2mL 0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓 冲液(pH6.0)中，添加1.9kU本发明的肽酶沉淀物，并将样品50℃，110 转/分钟，水浴孵育18小时。将所述样品4℃，3000xg离心15分钟。用热 灭活的酶制备物制备空白。将2mL上清液用于甲醛滴定法，7μL上清液用 于AA-TLC，20μL上清液用于蛋白质测定。为了显现蛋白质水解，进行 样品的SDS-PAGE。

这证实了所述新的酶对于降解(水解)即使是不可溶的蛋白质是有用 的。

实施例7-使用天然的加工水解产物(process hydrolysate)的水解实验

将250μL天然的加工水解产物悬浮在2mL 0.1M K₂HPO₄/KH₂PO₄缓 冲液(pH6.0)中，添加1.9kU本发明的肽酶沉淀物，并将样品50℃，110 转/分钟，水浴孵育18小时。将所述样品4℃，3000xg离心15分钟。用热 灭活的酶制备物来制备空白。将2mL上清液用于甲醛滴定法，7μL上清液 用于AA-TLC，20μL上清液用于蛋白质测定。为了显现蛋白质水解，进 行样品的SDS-PAGE。

这证实了所述新的酶对于降解(水解)在生产过程中出现的天然水解 产物是有用的。

实施例8-香味提取和GC分析

谷蛋白的任何一部分或纯的谷蛋白的水解后，将样品4℃，3000xg离 心15分钟，并将上清液用等体积的戊烷/醚提取3次。将收集的有机部分 干燥和浓缩。将1μL展示出味美的味道的预准备样品注射到GC中，并且 使用火焰离子化检测器证实挥发性香味的存在。

因此，所述方法产生了具有香味的产物。

序列表

<110>雀巢产品技术援助有限公司

<120>来自担子菌纲的肽酶

<130>NO 8301/WO

<150>EP07008458.7

<151>2007-04-25

<160>6

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>叶状奇果菌(Grifola frondosa)

<400>1

Asp Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Leu Ser Thr Lys

1               5                   10

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>叶状奇果菌

<400>2

Gln Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Thr Leu Asn Asp Leu Ala Arg

1               5                   10                  15

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>佛罗里达侧耳(Pleurotus floridanus)

<400>3

Thr Val Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ser Arg

1               5                   10

<210>4

<211>16

<212>PRT

<213>佛罗里达侧耳

<400>4

Ala Pro Ser Ala Leu Thr Val Gly Ala Ser Thr Leu Thr Asp Thr Arg

1               5                   10                  15

<210>5

<211>1161

<212>DNA

<213>糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)

<400>5

atgcgtctct tctctgctgt tcttgcatcc ctcgccatct tggctcctgc ctttgccgct  60

cctgctttga agacggtcga gagcttcgcc ggacagcgca acgatggcag tttcatcgtc  120

aagctcaagt ctggcgcatc ccgaagtggg ctcctcaaga ccctgggcgt caacgcaacc  180

cacgagtggg acgcagccct caacggcttt gctggtaaat tctcggagaa ggcgttgaat  240

gctctgcgcg cctcccctga tgtcgagtcc atctcagagg atggtatcat gcacacattc  300

gtcacccaga ccaacgctcc ttggggactg tctcggttga cttccgcgac ccgcctcacc  360

aacacgaacg ttgccgcatt gactttcaca tacacctacg acgcctccgc tggcagtggt  420

gttgatgtct tcgtcgtcga caccggtatc ttcaccagcc actctcagtt cggtggccgt  480

gcccgctggg gtgctacatt tggaccttac gccgatgctg acggcaatgg tcacggtact  540

cattgcgctg gtaccatcgg tggtagccaa tttggtgtcg ccaagagcgt caacctcatc  600

gccgtgaaag ttctcagcga cggtggatct ggctcggttg ctgatatcgt ctctggcctt  660

aacttcgtcc tgtcctctgc tcgctcttct ggccgccctt ccatcgtctc gatgagtctc  720

ggtggtggtg cttccactgc cttggacaac gccgttgctt ctctcacggc gggtggagtc  780

catgtcgtag ttgccgcggg taactctaac gttgatgctg gcaccacctc ccctgctcgt  840

gccccctctg ccatcactgt cggagcatct accatcactg acactcgagc ctctttctct  900

aacttcggct ccgtcgttga tgtcttcgct cctggtcaag atgtcatcag ctcctggatc  960

ggcagcacca ccgcaaccaa cagaatctct ggaacttcca tggctacccc ccatgttgct  1020

ggcttggccg cctacctcat cgccctcaac ggtaactcat cccctgccgc cctatcgacc  1080

accatcaaga gtttgtcctt gaagggtgtc ctgagcggta ttccttcggg cactctcaac  1140

gacttggctc accacgctta a                                            1161

<210>6

<211>386

<212>PRT

<213>糙皮侧耳

<400>6

Met Arg Leu Phe Ser Ala Val Leu Ala Ser Leu Ala Ile Leu Ala Pro

1               5                   10                  15

Ala Phe Ala Ala Pro Ala Leu Lys Thr Val Glu Ser Phe Ala Gly Gln

            20                  25                  30

Arg Asn Asp Gly Ser Phe Ile Val Lys Leu Lys Ser Gly Ala Ser Arg

        35                  40                  45

Ser Gly Leu Leu Lys Thr Leu Gly Val Asn Ala Thr His Glu Trp Asp

    50                  55                  60

Ala Ala Leu Asn Gly Phe Ala Gly Lys Phe Ser Glu Lys Ala Leu Asn

65                  70                  75                  80

Ala Leu Arg Ala Ser Pro Asp Val Glu Ser Ile Ser Glu Asp Gly Ile

                85                  90                  95

Met His Thr Phe Val Thr Gln Thr Asn Ala Pro Trp Gly Leu Ser Arg

            100                 105                 110

Leu Thr Ser Ala Thr Arg Leu Thr Asn Thr Asn Val Ala Ala Leu Thr

        115                 120                 125

Phe Thr Tyr Thr Tyr Asp Ala Ser Ala Gly Ser Gly Val Asp Val Phe

    130                 135                 140

Val Val Asp Thr Gly Ile Phe Thr Ser His Ser Gln Phe Gly Gly Arg

145                 150                 155                 160

Ala Arg Trp Gly Ala Thr Phe Gly Pro Tyr Ala Asp Ala Asp Gly Asn

                165                 170                 175

Gly His Gly Thr His Cys Ala Gly Thr Ile Gly Gly Ser Gln Phe Gly

            180                 185                 190

Val Ala Lys Ser Val Asn Leu Ile Ala Val Lys Val Leu Ser Asp Gly

        195                 200                 205

Gly Ser Gly Ser Val Ala Asp Ile Val Ser Gly Leu Asn Phe Val Leu

    210                 215                 220

Ser Ser Ala Arg Ser Ser Gly Arg Pro Ser Ile Val Ser Met Ser Leu

225                 230                 235                 240

Gly Gly Gly Ala Ser Thr Ala Leu Asp Asn Ala Val Ala Ser Leu Thr

                245                 250                 255

Ala Gly Gly Val His Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Asn Val Asp

            260                 265                 270

Ala Gly Thr Thr Ser Pro Ala Arg Ala Pro Ser Ala Ile Thr Val Gly

        275                 280                 285

Ala Ser Thr Ile Thr Asp Thr Arg Ala Ser Phe Ser Asn Phe Gly Ser

    290                 295                 300

Val Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Gln Asp Val Ile Ser Ser Trp Ile

305                 310                 315                 320

Gly Ser Thr Thr Ala Thr Asn Arg Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr

                325                 330                 335

Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ala Tyr Leu Ile Ala Leu Asn Gly Asn

            340                 345                 350

Ser Ser Pro Ala Ala Leu Ser Thr Thr Ile Lys Ser Leu Ser Leu Lys

        355                 360                 365

Gly Val Leu Ser Gly Ile Pro Ser Gly Thr Leu Asn Asp Leu Ala His

    370                 375                 380

His Ala

385