泥炭作为添加介质用于石油烃污染地下水的原位修复方法

摘要

本发明涉及一种泥炭作为添加介质用于石油烃污染地下水的原位修复方法。菌种驯化，菌种分离，预处理泥炭，功能菌扩大培养，将扩大培养的功能菌固化在经热处理后的湿状泥炭上，负载功能菌的泥炭和粗砂按照一定的体积比均匀混合制备成反应墙体支撑介质，然后将反应墙体支撑介质装入可渗透性反应墙中。用泥炭做生物反应墙添加介质，有效固定功能菌，实验测得固定化率达87％，不易随地下水流动而流失，有效吸附地下水中的石油烃、苯、甲苯、乙苯、二甲苯、萘系物，尤其对多环芳烃类的吸附效果尤为明显。有效的向反应墙体内功能菌供给营养，使反应墙体内各点在运行期内保持较高的生物量。所用泥炭的价格便宜，来源广泛容易获得，且生态安全。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种地下水污染场地的修复技术，尤其石油烃污染地下水原位修复的支撑介质和可渗透反应墙。

背景技术：

鉴于石油烃污染地下水的严重性，各国学者已广泛开展了石油烃污染地下水的控制及恢复技术研究。其中可渗透反应墙修复技术(Permeable Reactive Barrier，PRB)是目前欧美等许多发达国家新兴起来的用于原位去除地下水中污染组分的方法。

美国环保署(USEPA)将PRB定义为：在地下安置活性材料墙体以便拦截污染羽状体，使污染羽状体通过反应介质后，其污染物能转化为环境接受的另一种形式，从而实现污染物浓度达到环境标准的目标。反应介质可以通过吸附、沉淀、化学降解和生物降解作用去除地下水中污染物。在石油烃污染地下水修复方面，主要有吸附反应墙和生物反应墙。

吸附反应墙主要是PRB墙体内投加活性炭等介质利用其物理吸附性去除地下水中的石油烃污染质，但吸附介质常常价格昂贵，且需要定期更换，这极大的增加了系统的运行成本。

生物反应墙是在PRB墙体内添加含释氧化合物(OCR)和共代谢物质的混凝土颗粒；OCR为固态的过氧化物(如CaO₂、MgO₂等)，为微生物提供氧源和电子受体，使土著菌对石油烃产生好氧生物降解，共代谢物质可为石油烃的共代谢提供基质。但在实际修复过程中由于地下水环境中低温、寡营养及菌株间可能存在的相互竞争使得PRB生物修复效率可能较低，同时石油烃土著降解菌与支撑介质的亲和力较弱使其易随着地下水的流动而流失，另外生物修复效率还易受外界环境影响。

因此，如何选择一种墙体支撑介质，使其具有相对便宜、容易获得、环境友好、适宜石油烃污染物吸附，还可用做微生物的固定化载体和提供适当的营养源，是解决反应墙技术应用于石油烃污染地下水修复瓶颈的关键问题。

按照以上的标准，我们做了大量的试验和测试，最终选择泥炭作为石油烃污染地下水原位反应墙修复的添加介质。

泥炭是含有不同有机物分解度的复合土壤材料，是一种具有95％左右孔隙率和200m²/g比表面积的多孔性物质，且具有价格便宜、应用方便、生态安全、除污力强等特点。泥炭中含有许多生物高分子，例如：木质素类、纤维素类及一定质量的腐殖质，这些物质含有许多活性中心和极性功能团，被认为对非离子型有机化合物具有高的亲和力和吸附容量，部分组分的水解产物还可为碳氢化合物的生物降解提供复合型营养源，研究显示泥炭中含有的胡敏酸物质对石油烃具有很大的吸附容量，而且它具有低纤维含量和高木质素热分解物质和灰分，使得泥炭能有效吸附地下水中超饱和态和溶解态石油烃，去除率可达63-97％。此外，经本实验证明微生物在泥炭介质上不仅具有较高的固定化率，而且能长久保持高的生物活性。国外已有泥炭应用到地下水原位修复的实例和经验：而且，泥炭在地下修复系统安装时可通过传统挖掘和回填工程技术来实现。

发明内容：

本发明的目的就是针对上述现有技术的不足，提供一种非常适合用做石油烃污染地下水修复的以泥炭作为添加介质用于石油烃污染地下水的原位修复方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先菌种驯化，菌种分离，预处理泥炭，其次是功能菌扩大培养，将扩大培养的功能菌固化在经热处理后的湿状泥炭上，再将负载功能菌的泥炭和粗砂按照一定的体积比均匀混合制备成反应墙体支撑介质，然后将反应墙体支撑介质装入可渗透性反应墙中；

包括以下顺序和步骤：

a、将污染场地土壤样品用无菌水悬浮，磁力高速搅拌30min，然后用八层纱布过滤杂物、碎石，静止1h，取50mL悬浊液接至200mL富集培养基中，10℃低温，120rpm培养15天，然后取适量菌悬液重新接至新鲜富集培养基中，10℃低温适应；而后连续传代5次，每次9天，每次传代时逐渐减少辅助碳源用量，直至石油烃为唯一碳源；

b、将上述土著菌悬液接至柴油为唯一碳源的无机盐培养基中，继续10℃低温适应、富集，此阶段定时监测菌体增值及柴油组分降解情况，依据监测结果，逐步缩短世代时间，加快传代速度，直至土著菌群降解功能稳定、不能继续有效缩短降解时间为止；

c、菌种的分离：将选育到的土著混合菌群悬液，稀释不同梯度涂布于无机盐固体平板上，在10℃下培养15天，将长出的单菌落接种至普通固体平板中进行划线分离至纯菌株，接种斜面保藏培养基保藏；菌种经鉴定为：耶氏酵母菌(Yarrowia sp)、红球菌(Rhodococcus sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp)、假单胞菌(Pseudomonas sp)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)；

d、预处理泥炭，将泥炭经阴干、破碎、过筛后经140℃热处理3h，筛选粒径为0.25-1mm后用超纯水浸泡24小时，制备成湿状泥炭；

e、取预修复地的含水层砂土，晾干、过筛，取粒径0.5-2mm粗砂备用；

f、将步骤c分离出的五种功能菌扩大培养，将已活化后的种子液以10％接种量接种至含有400mg/L柴油的300mL无机盐培养基中，共接四个平行，10℃，120rpm震荡培养，培养60小时至对数生长期，菌数约为10¹¹个/mL，然后将菌悬液8000rpm离心15min，用20mL磷酸盐缓冲液冲洗菌体，再将菌悬液8000rpm离心15min，重复三次，收集菌体制备成菌悬液(菌数约为10¹⁰个/mL)待用；

g、功能菌在泥炭上固定化，取湿状泥炭，装入玻璃容器中，加入步骤f制备的菌悬液，于10-12℃培养48小时，将扩大培养的五种功能菌固定化在泥炭上；

h、反应墙体支撑介质制备，将固定化功能菌的泥炭与粗砂按照体积比为1：4进行均匀混合，制备成反应墙体支撑介质；

i、可渗透反应墙的制作，将制备成反应墙体支撑介质分层装入30-35cm宽的沟槽中，每填装一层都要铺平，均匀夯实，即为可渗透反应墙。

有益效果：泥炭对微生物具有较高的固定化率，实验中测得固定化率约为87％；泥炭用做吸附反应墙添加介质时，可有效吸附地下水中的石油烃，如苯、甲苯、乙苯、二甲苯、萘系物、菲系物，其中对多环芳烃类的吸附效果尤为明显；泥炭用做生物反应墙添加介质时，可有效固定功能菌，使其不易随地下水流动而流食，并且可有效的向反应墙体内功能菌供给营养，使反应墙体内各点能够在运行期内保持较高的生物量；本发明所用添加介质泥炭的价格便宜，来源广泛容易获得且生态安全。

菌种分类命名：

分类命名：耶氏酵母菌

拉丁文名：Yarrowia sp

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区大屯路

保藏日期：2009年10月12日

保藏编号：3318

分类命名：红球菌

拉丁文名：Rhodococcus sp

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区大屯路

保藏日期：2009年10月12日

保藏编号：3322

分类命名：不动杆菌

拉丁文名：Acinetobacter sp

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区大屯路

保藏日期：2009年10月12日

保藏编号：3323

分类命名：假单胞菌

拉丁文名：Pseudomonas sp

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区大屯路

保藏日期：2009年10月12日

保藏编号：3324

分类命名：新鞘氨醇杆菌

拉丁文名：Novosphingobium sp.

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

地址：北京市朝阳区大屯路

保藏日期：2009年10月12日

保藏编号：3326

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：

包括以下顺序和步骤：菌种驯化，菌种分离，泥炭预处理，功能菌扩大培养，将扩大培养的功能菌固化在经热处理后的湿状泥炭上，再将负载功能菌的泥炭和粗砂按照一定的体积比均匀混合制备成反应墙体支撑介质，然后将反应墙体支撑介质装入可渗透性反应墙中。

实施例1

a、将污染场地土壤样品用无菌水悬浮，磁力高速搅拌30min，然后用八层纱布过滤杂物、碎石，静止1h，取50mL悬浊液接至200mL富集培养基中，10℃低温，120rpm培养15天，然后取适量菌悬液重新接至新鲜富集培养基中，10℃低温适应；而后连续传代5次，每次9天，每次传代时逐渐减少辅助碳源用量，直至石油烃为唯一碳源；

b、将上述土著菌悬液接至柴油为唯一碳源的无机盐培养基中，继续10℃低温适应、富集，此阶段定时监测菌体增值及柴油组分降解情况，依据监测结果，逐步缩短世代时间，加快传代速度，直至土著菌群降解功能稳定、不能继续有效缩短降解时间为止；

c、菌种的分离：将选育到的土著混合菌群悬液，稀释不同梯度涂布于无机盐固体平板上，在10℃下培养15天，将长出的单菌落接种至普通固体平板中进行划线分离至纯菌株，接种斜面保藏培养基保藏；菌种经鉴定为：耶氏酵母菌(Yarrowia sp)、红球菌(Rhodococcus sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp)、假单胞菌(Pseudomonas sp)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)；

d、预处理泥炭，将泥炭经阴干、破碎、过筛后经140℃热处理3h，筛选粒径为0.25-1mm后用超纯水浸泡24小时，制备成湿状泥炭；

e、取预修复地的含水层砂土，晾干、过筛，取粒径0.5mm粗砂；

f、将步骤c分离出的五种功能菌扩大培养，将已活化后的种子液以10％接种量接种至含有400mg/L柴油的300mL无机盐培养基中，共接四个平行，10℃，120rpm震荡培养，培养60小时至对数生长期，菌数约为10¹¹个/mL，然后将菌悬液8000rpm离心15min，用20mL磷酸盐缓冲液冲洗菌体，再将菌悬液8000rpm离心15min，重复三次，收集菌体制备成菌悬液(菌数约为10¹⁰个/mL)；

g、功能菌在泥炭上固定化，取湿状泥炭浆，装入玻璃容器中，加入步骤f制备的菌悬液，于10℃培养48小时，将扩大培养的五种功能菌固定化在泥炭上；

h、反应墙体支撑介质制备，将固定化功能菌的泥炭与粗砂按照体积比为1∶4进行均匀混合，制备成反应墙体支撑介质；

i、可渗透反应墙的制作，将制备成反应墙体支撑介质分层装入30cm宽的沟槽中，每填装一层都要铺平，均匀夯实，即为可渗透反应墙。

实施例2

a、将污染场地土壤样品用无菌水悬浮，磁力高速搅拌30min，然后用八层纱布过滤杂物、碎石，静止1h，取50mL悬浊液接至200mL富集培养基中，10℃低温，120rpm培养15天，然后取适量菌悬液重新接至新鲜富集培养基中，10℃低温适应；而后连续传代5次，每次9天，每次传代时逐渐减少辅助碳源用量，直至石油烃为唯一碳源；

b、将上述土著菌悬液接至柴油为唯一碳源的无机盐培养基中，继续10℃低温适应、富集，此阶段定时监测菌体增值及柴油组分降解情况，依据监测结果，逐步缩短世代时间，加快传代速度，直至土著菌群降解功能稳定、不能继续有效缩短降解时间为止；

c、菌种的分离：将选育到的土著混合菌群悬液，稀释不同梯度涂布于无机盐固体平板上，在10℃下培养15天，将长出的单菌落接种至普通固体平板中进行划线分离至纯菌株，接种斜面保藏培养基保藏；菌种经鉴定为：耶氏酵母菌(Yarrowia sp)、红球菌(Rhodococcus sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp)、假单胞菌(Pseudomonas sp)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)；

d、预处理泥炭，将泥炭经阴干、破碎、过筛后经140℃热处理3h，筛选粒径为0.25-1mm后用超纯水浸泡24小时，制备成湿状泥炭；

e、取预修复地的含水层砂土，晾干、过筛，取粒径1mm粗砂备用；

f、将步骤c分离出的五种功能菌扩大培养，将已活化后的种子液以10％接种量接种至含有400mg/L柴油的300mL无机盐培养基中，共接四个平行，10℃，120rpm震荡培养，培养60小时至对数生长期，菌数约为10¹¹个/mL，然后将菌悬液8000rpm离心15min，用20mL磷酸盐缓冲液冲洗菌体，再将菌悬液8000rpm离心15min，重复三次，收集菌体制备成菌悬液(菌数约为10¹⁰个/mL)待用；

g、功能菌在泥炭上固定化，取湿状泥炭，装入玻璃容器中，加入步骤f制备的菌悬液，于11℃培养48小时，将扩大培养的五种功能菌固定化在泥炭上；

h、反应墙体支撑介质制备，将固定化功能菌的泥炭与粗砂按照体积比为1∶4进行均匀混合，制备成反应墙体支撑介质；

i、可渗透反应墙的制作，将制备成反应墙体支撑介质分层装入33cm宽的沟槽中，每填装一层都要铺平，均匀夯实，即为可渗透反应墙。

实施例3

a、将污染场地土壤样品用无菌水悬浮，磁力高速搅拌30min，然后用八层纱布过滤杂物、碎石，静止1h，取50mL悬浊液接至200mL富集培养基中，10℃低温，120rpm培养15天，然后取适量菌悬液重新接至新鲜富集培养基中，10℃低温适应；而后连续传代5次，每次9天，每次传代时逐渐减少辅助碳源用量，直至石油烃为唯一碳源；

b、将上述土著菌悬液接至柴油为唯一碳源的无机盐培养基中，继续10℃低温适应、富集，此阶段定时监测菌体增值及柴油组分降解情况，依据监测结果，逐步缩短世代时间，加快传代速度，直至土著菌群降解功能稳定、不能继续有效缩短降解时间为止；

c、菌种的分离：将选育到的土著混合菌群悬液，稀释不同梯度涂布于无机盐固体平板上，在10℃下培养15天，将长出的单菌落接种至普通固体平板中进行划线分离至纯菌株，接种斜面保藏培养基保藏；菌种经鉴定为：耶氏酵母菌(Yarrowia sp)、红球菌(Rhodococcus sp.)、不动杆菌(Acinetobacter sp)、假单胞菌(Pseudomonas sp)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)；

d、预处理泥炭，将泥炭经阴干、破碎、过筛后经140℃热处理3h，筛选粒径为0.25-1mm后用超纯水浸泡24小时，制备成湿状泥炭；

e、取预修复地的含水层砂土，晾干、过筛，取粒径2mm粗砂备用；

f、将步骤c分离出的五种功能菌扩大培养，将已活化后的种子液以10％接种量接种至含有400mg/L柴油的300mL无机盐培养基中，共接四个平行，10℃，120rpm震荡培养，培养60小时至对数生长期，菌数约为10¹¹个/mL，然后将菌悬液8000rpm离心15min，用20mL磷酸盐缓冲液冲洗菌体，再将菌悬液8000rpm离心15min，重复三次，收集菌体制备成菌悬液(菌数约为10¹⁰个/mL)待用；

g、功能菌在泥炭上固定化，取湿状泥炭，装入玻璃容器中，加入步骤f制备的菌悬液，于12℃培养48小时，将扩大培养的五种功能菌固定化在泥炭上；

h、反应墙体支撑介质制备，将固定化功能菌的泥炭与粗砂按照体积比为1∶4进行均匀混合，制备成反应墙体支撑介质；

i、可渗透反应墙的制作，将制备成反应墙体支撑介质分层装入35cm宽的沟槽中，每填装一层都要铺平，均匀夯实，即为可渗透反应墙。