一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

摘要

本发明提供一种快速鉴别水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法，属植物保护领域。根据水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒核苷酸序列设计三条引物，[A]RB1_S9_F，[B]RB2_S9_F，[C]RB_S9_R，其中A/C组合检测水稻黑条矮缩病毒，B/C组合检测南方水稻黑条矮缩病毒。样品提取总RNA后，只需一次RT-PCR，即可检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒两种病毒，实现了两种病毒的鉴别。相对于传统的一次RT-PCR检测一种病毒的方法，大大减少了成本，节约了时间，是一种特异、灵敏、经济而又方便的检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒快速鉴别的方法，属植物保护领域。

背景技术

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，是水稻上一种危害严重的病毒病，隶属于植物呼肠孤病毒科斐济病毒属(Fijivirus)，病毒粒体球状，主要由灰飞虱传播，田间症状前期主要表现为植矮缩，叶片浓绿，后期在叶片、叶鞘及茎杆上出现蜡滴状突起，而后形成黑条，对水稻的产量影响很大，重病田甚至可导致无产量。该病毒除侵染水稻外，还可侵染玉米(玉米粗缩病)、小麦(小麦绿矮)及多种禾本科杂草。1963和1966年在中国江苏、上海、浙江一带流行，90年代在我国许多玉米和水稻产区爆发流行，造成了严重损失。近年来该病在江浙地区蔓延发生，且呈日渐严重的趋势，2008年仅江苏省发病面积就达400万亩，致使当地的水稻生产损失严重。

近年来在广东省和海南省又发现一种新的水稻病毒病，田间症状与水稻黑条矮缩病毒极其相似，对其基因组序列进行测定后发现其与水稻黑条矮缩病毒还存在较大差异(两者的S9和S10片段的同源性仅仅为75％和80％)，故暂定名为南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)，该病毒也属于植物呼肠孤病毒科斐济病毒属(Fijivirus)，病毒粒体球状，基因组由10条双链RNA组成，传播介体主要为白背飞虱，灰飞虱也可传播，田间症状表现为植株矮缩、叶色深绿、叶背及茎秆出现条状乳白色或深褐色小突起，寄主除水稻外还包括玉米及多种杂草。

由于两种病毒在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似，由此也给其诊断及鉴定造成了困难。

目前在植物病毒鉴定识别上常采用的方法有：生物学接种实验，血清学检测，电镜观察及分子生物学检测。由于这两种病毒的在很多方面都具有非常接近的特性，因此传统的植物病毒的检测方法，如电镜观察(病毒粒子大小形状相近)、传统的生物学接种鉴定(症状、介体、寄主范围相近)、血清学检测(序列仍有较高的同源性)等方法都很难区分。目前在RBSDV的检测上用的比较多的还是分子生物学检测法，其中RT-PCR是较常用到的方法，以前也有报道使用RT-PCR的方法检测RBSDV，但是尚未见到能同时检测RBSDV和SRBSDV，并区分的方法，本方法只需一次RT-PCR即可实现两种的病毒鉴别，在保证灵敏性和特异性的前提下，简化了操作，节省了成本。

发明内容

本发明填补了水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒鉴别技术上的空白，提供了一种快速、简便、灵敏、特异的鉴别方法。

1、引物设计：

(1)根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)上已报道的水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列(AB011403，AF459812，AY050486，AY050487，AJ291706，AJ297429，AJ297430，NC_003731，AF536564，AF540976，AY039705)及南方水稻黑体矮缩病毒(EU523359，EU784843)S9核苷酸序列设计简并引物，引物序列如下：

RB1_S9_F：5`-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3

RB2_S9_F：5`-TTACAYCAAGCACTTTGCGAGG-3

RB_S9_R：5`-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3

(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：

引物组合    RT引物    检测病毒名称    目的片段大小

RB1_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R    水稻黑条矮缩病毒        1119bp

RB2_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R    南方水稻黑条矮缩病毒    569bp

2、总RNA提取：

取植物样品组织0.1g，加入1mL Trizol reagent充分研磨，研磨液移入一1.5ml离心管，室温放置5min；加入氯仿200μL，混匀后静置3min；12,000g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；12,000g，4℃，离心10min，弃去上清；加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀；干燥RNA沉淀，而后加40μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。

3、RT-PCR扩增：

(1)反转录(RT)：

取一Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 3μL，引物RB_S9_R 1μL，DEPC处理水8.5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：

5×M-MuLV反转录酶缓冲液        4μL

dNTPs(10mM/dNTP)               2μL

RNase inhibitor(20U/μL)       0.5μL

M-MuLV反转录酶(200U/μL)       1μL

42℃水浴1h，70℃处理5min，-20℃保存备用。

(2)聚合酶链式反应(PCR)：

以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：

反转录产物                      2μL

10×PCR缓冲液                   2.5μL

dNTP(10mM/dNTP)                 0.5μL

RB1_S9_F(10μmol/L)             1.5μL

RB2_S9_F(10mol/L)               1.5μL

RB_S9_R(10μmol/L)              1.5μL

TaqDNA聚合酶(5U/L)              0.5μL

DEPC处理水                      15μL

总体积                          25μL

反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、50-55℃退火50sec、72℃延伸2min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

4、电泳检测：

取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察，在仅感染水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条1119bp的核酸条带，在仅感染南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条569bp的核酸条带，在同时感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到569bp和1119bp两条核酸条带。

附图说明

附图是水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的电泳检测结果(M：标准分子量；1：水稻黑条矮缩病毒样品；2：南方水稻黑条矮缩病毒样品；3：水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的复合样品)

具体实施方式

实例一：

以已知的感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的水稻混合样品和分别感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的水稻样品为检测对象，以健康水稻样品为阴性对照。

1、引物设计：

(1)根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)上已报道的水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列(AB011403，AF459812，AY050486，AY050487，AJ291706，AJ297429，AJ297430，NC_003731，AF536564，AF540976，AY039705)及南方水稻黑体矮缩病毒(EU523359，EU784843)S9核苷酸序列设计简并引物，引物序列如下：

RB1_S9_F：5`-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3`

RB2_S9_F：5`-TTACAYCAAGCACTTTGCGAGG-3`

RB_S9_R：5`-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3`

(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：

引物组合          RT引物     检测病毒名称            目的片段大小

RB1_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R    水稻黑条矮缩病毒        1119bp

RB2_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R    南方水稻黑条矮缩病毒    569bp

2、总RNA提取：

取植物样品组织0.1g，加入1mL Trizol reagent充分研磨，研磨液移入一1.5ml离心管，室温放置5min；加入氯仿200μL，混匀后静置3min；12,000g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；12,000g，4℃，离心10min，弃去上清；加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀；干燥RNA沉淀，而后加40μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。

3、RT-PCR扩增：

(1)反转录(RT)：

取一Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 3μL，引物RB_S9_R 1μL，DEPC处理水8.5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：

5×M-MuLV反转录酶缓冲液     4μL

dNTPs(10mM/dNTP)            2μL

RNase inhibitor(20U/μL)    0.5μL

M-MuLV反转录酶(200U/μL)    1μL

42℃水浴1h，70℃处理5min，-20℃保存备用。

(2)聚合酶链式反应(PCR)：

以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：

反转录产物                  2μL

10×PCR缓冲液               2.5μL

dNTP(10mM/dNTP)             0.5μL

RB1_S9_F(10μmol/L)         1.5μL

RB2_S9_F(10μmol/L)         1.5μL

RB_S9_R(10μmol/L)          1.5μL

TaqDNA聚合酶(5U/L)          0.5μL

DEPC处理水                  15μL

总体积                      25μL

反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、50-55℃退火50sec、72℃延伸2min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

4、电泳检测：

取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察。

5、结果分析：

在仅感染水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条1119bp的核酸条带，在仅感染南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条569bp的核酸条带，在同时感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到569bp和1119bp两条核酸条带。

实例二：

以已知的感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的水稻混合样品和分别感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的水稻样品为检测对象，以健康水稻样品为阴性对照。

1、引物设计：

(1)根据NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝nucleotide)上已报道的水稻黑条矮缩病毒S9核苷酸序列(AB011403，AF459812，AY050486，AY050487，AJ291706，AJ297429，AJ297430，NC_003731，AF536564，AF540976，AY039705)及南方水稻黑体矮缩病毒(EU523359，EU784843)S9核苷酸序列设计简并引物，引物序列如下：

RB1_S9_F：5`-GRTAGACAGGCAAAYMTAAGCGT-3`

RB2_S9_F：5`-TTACAYCAAGCACTTTGCGAGG-3`

RB_S9_R：5`-GGATTACAACAHACACAMCGAAA-3`

(2)引物配对及扩增目的核酸条带的大小如下：

引物组合          RT引物     检测病毒名称            目的片段大小

RB1_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R    水稻黑条矮缩病毒        1119bp

RB2_S9_F/RB_S9_R  RB_S9_R    南方水稻黑条矮缩病毒    569bp

2、总RNA提取：

取植物样品组织0.1g，加入1mL Trizol reagent充分研磨，研磨液移入一1.5ml离心管，室温放置5min；加入氯仿200μL，混匀后静置3min；12,000g，4℃离心15min；取上层水相移入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置5min；12,000g，4℃，离心10min，弃去上清；加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀；干燥RNA沉淀，而后加40μL DEPC处理水溶解沉淀，-20℃保存。

3、RT-PCR扩增：

(1)反转录(RT)：

取一Eppendorf管，加入样品：提取的总RNA 3μL，引物RB_S9_R 1μL，DEPC处理水8.5μL，置于65℃下变性5min，立即取出置于冰上放置1min。再依次加入下列试剂：

5×M-MuLV反转录酶缓冲液            4μL

dNTPs(10mM/dNTP)                   2μL

RNase inhibitor(20U/μL)           0.5μL

M-MuLV反转录酶(200U/μL)           1μL

42℃水浴1h，70℃处理5min，-20℃保存备用。

(2)聚合酶链式反应(PCR)：

以RT合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，反应体系包括：

反转录产物                         2μL

10×PCR缓冲液            2.5μL

dNTP(10mM/dNTP)          0.5μL

RB1_S9_F(10μmol/L)      1.5μL

RB2_S9_F(10μmol/L)      1.5μL

RB_S9_R(10μmol/L)       1.5μL

TaqDNA聚合酶(5U/L)       0.5μL

DEPC处理水               15μL

总体积                    25μL

反应条件为94℃预变性5min；94℃变性50sec、50-55℃退火50sec、72℃延伸2min，30-40次循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。

4、电泳检测：

取10μL PCR产物经1％琼脂糖凝胶在0.5×TBE缓冲液和120V电压条件下电泳40min，在0.5μg/mL的溴化乙锭(EB)中染色10min，染色后于凝胶成像系统中观察。

5、结果分析：

在仅感染水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条1119bp的核酸条带，在仅感染南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到一条569bp的核酸条带，在同时感染水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的样品中可以观察到569bp和1119bp两条核酸条带。