磁性γ-Fe2O3纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法

摘要

磁性γ－Fe2O3纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法涉及磁性γ－Fe2O3纳米粒子模拟酶，并提供了其应用于生物检测的方法，利用磁性γ－Fe2O3纳米粒子模拟酶替代辣根过氧化物酶HRP应用于生物检测，检测的步骤包括：将磁性γ－Fe2O3纳米粒子表面上的羧基与特异性分子探针进行偶联，构建特异性纳米探针；纳米探针与相应待测靶标分子特异性结合；用包含过氧化物和供氢底物的显色液进行显色，并测定吸光度值或进行显微观察，从而实现对靶标分子的定性和定量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子模拟酶，并提供了其应用于生物检测的方法，属于纳米材料及生物医学纳米技术领域。

背景技术

磁性氧化铁纳米粒子(Fe₃O₄、γ-Fe₂O₃)因其丰富的磁学特性和良好的生物相容性，在磁共振成像对比剂、磁靶向药物载体、细胞与生物分子分离、生物传感与检测以及磁感应肿瘤热疗等生物医学领域有广泛的应用。另外，在工业废水处理方面，磁性氧化铁纳米粒子因具有较高的有机物羟基化的活性而用于苯酚等有毒物质的清除(苯酚等有机物羟基化后毒性降低)。近年来，中国科学院的研究者们还发现了四氧化三铁(Fe₃O₄)磁性纳米粒子具有内在的模拟酶活性，可用于替代过氧化物酶进行免疫检测，这在医学、生物技术及环境化学等领域有着深远的应用价值。

针对模拟酶方面，早在19世纪，法国科学家Fenton就采用Fe²⁺活化H₂O₂氧化酒石酸，被认为是最先对过氧化物酶催化中心金属离子的化学催化模拟，其基本反应式为：

Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+·OH+OH^-，k₁＝76(mol/L)^-1s^-1(a)

Fe³⁺+H₂O₂→Fe²⁺+·OOH+H⁺，k₂＝0.002(mol/L)^-1s^-1(b)

由k₁和k₂来看，Fe³⁺/Fe²⁺的催化反应式(b)是催化反应循环的瓶颈，限制了Fenton试剂在酶模拟作用中的研究应用。其它物质如金属卟啉、金属酞菁、卟啉、联吡啶、血红素、血红蛋白、细胞色素C、细胞色素P450、漆酶、叶绿素、氯化血红素(hemin)、高铁血红素(hematin)等等在模拟酶方面也都有所研究。

过氧化物酶是广泛存在于生物体内的一类氧化还原酶，通过其内部的变价铁元素以及外部结构能催化H₂O₂氧化氢供体底物。在生命活动过程中，过氧化物酶主要是催化生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其它毒素。目前广泛应用于生物检测的过氧化物酶是从天然植物中提取的辣根过氧化物酶(horseradi shperoxidase，HRP)。但是HRP价格昂贵，且保存及实验条件苛刻，容易失活，在酶联免疫分析上因分子较大而不利于抗原抗体结合，并且标记过程复杂。因此，寻找能够替代HRP的模拟酶是酶催化反应的热点。

在众多酶模拟物中，Fe₃O₄磁性纳米粒子已经被发现不仅能像Fenton试剂一样表现出一定的酶活性，而且比酶稳定、制备方法简单、成本低，易于大规模制备，它还兼具有磁性等其他多功能特性，因此更具研究意义和广泛的应用价值。除了Fe₃O₄磁性纳米粒子外，γ-Fe₂O₃是另外一种磁性较强的氧化铁纳米粒子，其可由Fe₃O₄纳米粒子直接氧化而来，易于批量制备和保存，由于γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子中只含有三价铁，因此相对于Fe₃O₄纳米粒子来说不易被氧化，具有稳定的磁学和化学稳定性。但由于γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子中缺乏二价铁，其本身类酶活性大大降低，从而严重限制了其作为模拟酶的应用。本发明的最大创新即是提供了一种通过表面修饰提高γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子类酶活性并将其应用于生物检测的方法。表面修饰的磁性γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子同时具有优良的稳定性和类酶活性，另外表面修饰还提供了进行生物分子偶联所必须的功能基团，其应用于生物检测具有低成本、稳定和使用方便的特点，同时可结合磁特性进行功能化设计。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子模拟酶应用于生物检测的方法，通过表面修饰提高γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子类酶活性并将其应用于生物检测。

技术方案：Fe₃O₄磁性纳米粒子具有很好的类过氧化物酶活性，但是由于固有的化学不稳定性(其中亚铁离子易被氧化)，其作为模拟酶的活性会随着保存时间而发生变化，从而导致生物检测的不稳定性。磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子具有很好的化学稳定性，但是类酶活性较低。为了提高磁性γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子的类酶活性，本发明提出了通过用富含羧基的分子对其进行表面修饰，增加纳米粒子模拟酶与底物的亲和力，从而增强其催化能力。同时，本发明还提供了应用磁性γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子模拟酶进行生物检测的具体方法和步骤。

利用磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子模拟酶替代辣根过氧化物酶HRP应用于生物检测，检测的步骤包括：将磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子表面上的羧基与特异性分子探针进行偶联，构建特异性纳米探针；纳米探针与相应待测靶标分子特异性结合；用包含过氧化物和供氢底物的显色液进行显色，并测定吸光度值或进行显微观察，从而实现对靶标分子的定性和定量检测。

其中所述的磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子模拟酶尺寸介于1-100nm，表面被多元羧酸或富含羧基的高分子所修饰，在pH 4-10范围内均带负电荷。

所述磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子模拟酶能催化过氧化物和供氢底物进行显色反应；所述供氢底物包括四甲基联苯胺TMB、四甲基联苯胺硫酸盐TMBS、邻苯二胺OPD、二氨基联苯胺DAB、二氨基联苯胺四盐酸DAB-4HCl、5-氨基水杨酸5-AS、邻联甲苯胺OT或连氮二铵盐ABTS；所述过氧化物包括过氧化氢或过氧化脲。

所述多元羧酸包括二巯基丁二酸、柠檬酸、苹果酸或酒石酸；所述富含羧基的高分子包括聚丙烯酸、海藻酸、多聚谷氨酸或羧基化葡聚糖。

所述特异性分子探针包括蛋白、抗体、核酸或多肽；所述待测靶标分子存在于溶液或体液中，被固定或捕获在固体基质上，或分布在组织或细胞的表面。

有益效果：

1)本发明最大创新点是提供了一种将磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子作为模拟酶来替代辣根过氧化物酶应用于生物检测的方法。与辣根过氧化物酶比较，磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子作为模拟酶稳定、制备方法简单、成本低，易于大规模制备，它还兼具有磁性等其他多功能特性，因此更具研究意义和广泛的应用价值。例如，可利用外磁场促进磁性纳米探针向下扩散与待测靶标分子结合，不仅可以提高检测效率，还可以降低纳米探针的使用量。

2)利用表面分子修饰来改变磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子作为模拟酶的活性，提供了一种裁剪和优化模拟酶活性和功能的方法，不仅能改善酶活性、进一步增加纳米粒子稳定性和生物相容性，还提供了表面进一步偶联生物分子的功能基团，有利于标记蛋白、核酸等生物分子，从而方便用于生物检测。

附图说明

图1.不同有机分子修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子，催化H₂O₂氧化TMB反应过程的对比图。纵坐标所示650nm处吸光度数值的增加表示酶催化反应产物的浓度随时间逐渐增加。(■)γ-Fe₂O₃，(●)γ-Fe₂O₃/二巯基丁二酸，(▲)γ-Fe₂O₃/柠檬酸，γ-Fe₂O₃/酒石酸，(◆)γ-Fe₂O₃/γ-氨丙基三乙氧基硅烷，没有纳米粒子催化，单独H₂O₂与TMB反应(TMB指底物3，3，5，5-四甲基联苯胺)。

图2.二巯基丁二酸修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子(γ-Fe₂O₃/DMSA)、Fe₃O₄磁性纳米粒子及HRP催化底物TMB与H₂O₂的表观酶促动力学曲线图。其中，HRP指辣根过氧化酶，TMB指底物3，3，5，5-四甲基联苯胺。其中，图2a与2b指Fe₃O₄磁性纳米粒子，图2c与2d指γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子，图2e与2f指HRP。

图3.使用γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子-羊抗人IgG(Fe₂O₃-GAHIgG)纳米探针检测人IgG的ELISA过程示意图。待检测人IgG首先被包被在基底上，空余位点用牛血清白蛋白(BSA)封闭，Fe₂O₃-GAHIgG纳米探针与基底上IgG特异性结合，用H₂O₂与TMB底物显色液进行显色，最后用酶标仪进行检测。

图4.用γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子标记的羊抗人IgG(Fe₂O₃-GAHIgG)检测人IgG的结果。

具体实施方式

磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子模拟酶替代辣根过氧化物酶(HRP)应用于生物检测的方法。

其中所用磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子尺寸介于1-100nm，表面被多元羧酸或富含羧基的高分子所修饰，在pH 4-10范围内均带负电荷。其中所述多元羧酸包括二巯基丁二酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸；所述富含羧基的高分子包括聚丙烯酸、海藻酸、多聚谷氨酸、羧基化葡聚糖。

其中磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子能模拟辣根过氧化物酶，来催化过氧化物和供氢底物发生显色反应，从而可替代传统的辣根过氧化物酶用于生物检测领域。其中所述供氢底物包括四甲基联苯胺(TMB)、四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)、邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)、二氨基联苯胺四盐酸(DAB-4HCl)、5-氨基水杨酸(5-AS)、邻联甲苯胺(OT)、连氮二铵盐(ABTS)；所述过氧化物包括过氧化氢和过氧化脲。

其中所述磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子用于生物检测的步骤包括：将磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子表面上的羧基与特异性分子探针进行偶联，构建特异性纳米探针；纳米探针与相应待测靶标分子特异性结合；用包含过氧化物和供氢底物的显色液进行显色，并测定吸光度值或进行显微观察，从而实现对靶标分子的定性和定量检测。如果利用吸光度进行测定，可以选择TMB、TMBS、OPD、5-AS、OT、ABTS等底物进行显色，生成的可溶性有色产物有利于吸光度测定；如果利用光镜、电镜等显微方法进行染色定位观察，则可以选择DAB或DAB-4HCl进行显色，生成的不溶性有色产物沉积于纳米粒子模拟酶附近，有利于显微成像。

其中所述特异性分子探针包括蛋白、抗体、核酸及多肽；所述待检靶标分子可以存在于溶液或体液中(如血液、尿液中的成分)，但是需要被固定或捕获在固体基质(如96孔板)上，也可以分布在组织或细胞的表面(如特定抗原、受体等)。

实施例：磁性γ-Fe₂O₃/DMSA纳米粒子模拟酶用于酶联免疫生物检测(ELISA)的方法及效果

材料试剂：表面修饰二巯基丁二酸的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子(γ-Fe₂O₃/DMSA)，由实验室根据文献方法合成。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)、3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)购自Sigma-Aldrich Inc(USA)。羊抗人IgG(GAHIgG)、人IgG、牛血清白蛋白(BSA)，购自南京凯基生物科技发展有限公司。pH＝6.0的MES(2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液，pH＝7.4的PBS缓冲液(0.01M)，pH＝9.6的碳酸盐缓冲液(0.05M)，PBS/T(含0.1％吐温-20的PBS缓冲液)，pH＝4.5的0.2M醋酸盐缓冲液。30％H₂O₂、二甲基亚砜(DMSO)、MES、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、冰醋酸、吐温-20，均购自国药集团化学试剂有限公司。使用Costar进口聚苯乙烯96孔板。

实验仪器：紫外灯(UV-CJ 8F 15W)，DNP-9052型电热恒温培养箱，THZ-312型台式恒温振荡器，bio-rad 680酶标仪。

实施方法：

1)γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子表面标记抗体。0.2mg γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子，溶解在1ml的MES中，超声15min，加入10mg/ml EDC 24μl，10mg/ml NHS 35μl，振荡反应15min；之后磁分离，MES洗涤3次后用MES定溶至1mL，并加入羊抗人IgG20μg，室温下振荡反应2h；然后用含1％BSA的PBS磁分离洗涤2次，再加入含1％BSA的PBS 1mL进行封闭2小时；最后用PBS磁分离洗涤2次后定溶至0.2mL，保存于4℃冰箱，样品记为Fe₂O₃-GAHIgG。

2)ELISA检测。聚苯乙烯96孔板在超净工作台上用紫外灯(UV-CJ 8F 15W)辐照80分钟后(距离10cm)，置于室温存贮备用。将人IgG稀释10，5，2.5μg/ml的浓度，包被液为pH＝9.6的碳酸盐缓冲液溶液(0.05mol/L)。在96空板中每孔分别加入100μl IgG溶液：a.10μg/ml组8孔；b.5ug/ml组8孔；c.2.5ug/ml组8孔；d.空白(包被液)组8孔；在培养箱中37℃孵育2小时。用PBS/T洗涤3次后用封闭液(含10％小牛血清用的PBS溶液)处理，封闭液的一般用量是每孔150ul，37摄氏度封闭2h。用PBS/T溶液洗涤3次。加入Fe₂O₃-GAHIgG的PBS(pH＝7.4，0.01M)溶液，每孔100μL，37摄氏度孵育1h。用PBS/T溶液洗涤3次。加底物显色液200μl(配方为每mL醋酸盐缓冲液中含：10mg/mL TMB二甲基亚砜溶液25μl，30％H₂O₂80μl)，37度孵育30min，用酶标仪检测650nm处的吸光度值。

ELISA检测过程如图3所示。

结果：将孵育30min后酶标仪测定的650nm处的吸光度值对IgG用量做柱状图，如图4所示。结果表明，随着IgG用量的减小，吸光度梯度减小，磁性纳米粒子-抗体偶联物可以用于相应蛋白分子的检测。

表1.γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子、Fe₃O₄磁性纳米粒子及HRP的表观米氏常数比较。

表1

磁性γ-Fe₂O₃纳米粒子作为模拟酶的特性检测：

1)通过多元羧酸表面修饰对γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子类酶活性的提高

对不同有机分子修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子，研究其在催化底物双氧水氧化TMB的模拟酶反应中催化能力的差异，以期发现改善γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子类酶活性的方法。

试剂：γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子以及不同有机分子修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子由实验室根据文献报道方法合成。γ-氨丙基三乙氧基硅烷(3-(Triethoxysilyl)propylamine，APTS)，3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich Inc(USA)。30％H₂O₂，醋酸钠，冰醋酸，购自国药集团化学试剂有限公司。二巯基丁二酸(DMSA)，柠檬酸，酒石酸，购自上海凌峰化学试剂有限公司。

方法：在各个反应体系中，分别取6.77μg不同有机分子修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子，溶于200μl醋酸钠缓冲溶液(pH4.6)中，加入10μl TMB溶液(10mg/ml，溶于DMSO)和32μl的30％H₂O₂。在bio-rad 680酶标仪检测650nm下的吸光度值，时间扫描1200s，反应温度25℃。

结果：对不同有机分子修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子的酶模拟反应，将催化产物在650nm下吸光度值随时间变化作图，如图1所示。结果表明，不同有机分子修饰Fe₂O₃磁性纳米粒子表现出不同的催化能力，其中二巯基丁二酸和柠檬酸等富含羧基的有机分子修饰的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子催化能力较强。

2)表面修饰二巯基丁二酸的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子(Fe₂O₃/DMSA)对底物TMB和H₂O₂的表观酶促动力学测量以及与Fe₃O₄磁性纳米粒子和辣根过氧化酶(HRP)的比较。

试剂：Fe₃O₄磁性纳米粒子，表面修饰二巯基丁二酸的γ-Fe₂O₃磁性纳米粒子(Fe₂O₃/DMSA)，由实验室根据文献方法合成。辣根过氧化酶(HorseradishPeroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，购自Sigma-Aldrich Inc(USA)。3，3，5，5-四甲基联苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，购自Sigma-Aldrich Inc(USA)。30％H₂O₂，醋酸钠，冰醋酸，购自国药集团化学试剂有限公司。

方法：

a)在各个反应体系中，取6.77μg γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子，溶于200μl醋酸钠缓冲溶液(pH4.6)中，加入13μl的30％H₂O₂，分别加入不同量(0.2，0.4，0.8，1.6，2.4，3.2，4μl)的TMB溶液(10mg/ml，溶于DMSO)，bio-rad 680酶标仪检测650nm下的光吸收值，时间扫描120s，反应温度25℃。

b)在各个反应体系中，取6.77μg γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子，溶于200μl醋酸钠缓冲溶液(pH4.6)中，加入4μl TMB溶液(10mg/ml，溶于DMSO)，分别加入不同量(0.7，1.3，2.6，5.2，7.8，10.4，13μl)30％H₂O₂，在bio-rad 680酶标仪检测650nm下的光吸收值随时间变化，时间扫描120s，反应温度25℃。

c)Fe₃O₄磁性纳米粒子和辣根过氧化酶也在类似条件下检测。

结果：以反应最初20s内650nm光吸收值随时间的变化作图，计算其斜率，即可得到反应初速度v，然后分别以TMB和H₂O₂摩尔浓度为横坐标，以v为纵坐标作图，经origin软件处理得到酶促反应动力学曲线(图2)。根据米式方程：v＝V_max×[S]/(K_m+[S])，分析发现，γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子表观酶促催化动力学曲线与HRP及Fe₃O₄磁性纳米粒子的酶促动力学类似。计算得到的表观米氏常数Km列在表1中。Km越小，表明该酶与底物结合能力越强，有利于催化。比较发现，γ-Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子、Fe₃O₄磁性纳米粒子及HRP三种样品对底物TMB的表观米氏常数在同一量级，但是，Fe₂O₃/DMSA磁性纳米粒子与Fe₃O₄磁性纳米粒子对H₂O₂的表观米氏常数远大于HRP，说明纳米粒子模拟酶在催化底物显色时需要较高的双氧水浓度。