组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法

摘要

本发明公开了一种组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法，选取与正常关节软骨细胞外基质主要成分相同的原料作为制备组织工程用仿生软骨细胞外基质的仿生原材料，再将选取的仿生原材料通过有机酸充分溶解后依次通过制孔处理、固化处理和强化处理，使最终得到的组织工程用仿生软骨细胞外基质的材料结构具备适合软骨种子细胞接种、存活及增殖等生物学行为要求的物理结构特征，同时具有良好生物相容性、适宜的降解速率和生物力学强度；本制备方法材料来源广泛，成本低廉，工艺简单易行，重现性好，制得的产品可广泛应用于修复大面积的关节软骨缺损并且临床并发症少。

说明书

技术领域

本发明涉及软骨仿生细胞外基质，特别涉及一种组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法。

背景技术

由创伤或骨病所致关节部位软骨缺损临床常见，严重影响患者生活质量，已成为目前肢体残障的主要原因之一。美国发病率为1.5‰～3‰，我国约为美国的5～6倍，且呈逐年上升趋势。关节软骨属于透明软骨，缺乏神经血管营养，损伤后自身难以修复。临床现有治疗措施均存在明显缺陷，其保守治疗和关节清理术只能暂时缓解疼痛，不能阻止病程的发展；自体骨软骨移植术可造成供区损伤，且来源有限，难以修复较大面积的缺损；异体骨软骨移植术存在免疫排斥反应及传播疾病的可能；人工关节置换术则费用昂贵、并发症较多、翻修率较高，特别是对年轻患者的身心影响大、经济负担重。

组织工程学的诞生及其快速发展为关节软骨的再生修复提供了新技术。20世纪80年代随着细胞生物学与工程材料学等基础学科的深入发展，组织工程学的研究经历了两个阶段：前10年主要是证实利用细胞和生物材料构建组织的可行性；后10多年则在研究内容、手段、技术改进和临床试用等方面不断深入，为提高疗效和拓展组织工程产品作准备。1987年瑞典学者报道移植体外扩增软骨细胞来临床治疗自体关节软骨缺损。1997年美国食品药品管理局FDA批准Genzyme公司的组织工程产品进入临床，到目前已超过4000名患者受益于该产品。2004年中国武警总医院将德国Verigen公司构建的组织工程软骨应用于临床，但我国目前还缺乏具有自主知识产权的组织工程软骨基质材料应用于临床。

组织工程支架材料为构建组织的细胞提供的三维支架，有利于细胞的黏附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境。在组织工程中，支架材料起到细胞外基质的作用，是对细胞外基质的结构和功能的仿生。它不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，从而引导受损组织的再生和控制再生组织的结构。

研究表明，正常关节软骨由软骨细胞和细胞外基质组成，两者协调配合，保证了关节软骨的正常生理功能。软骨细胞占整个组织体积的5％，主要功能为分泌胞外基质，保持基质的更新。细胞外基质70％由水构成，其余由胶原和蛋白多糖组成，主要负责承载软骨细胞，调节细胞的增殖和分化，缓冲关节应力。胶原占软骨干重的60％-80％，其中95％为II型胶原。蛋白多糖聚合物占透明软骨干重的20％-40％，主要包括硫酸软骨素和透明质酸，两者结合形成蛋白多糖聚合物。聚合物中的氨基葡聚糖残基带有负电荷，分子间相互排斥，具有强烈的亲水性，这是软骨基质保持大量水分的重要原因。硫酸软骨素和胶原纤维之间的键连接，避免了基质过度水化，进而防止软骨软化。现有技术制备的组织工程软骨支架材料与正常的软骨基质无论在成分上还是结构上，都存在显著的差异。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法，能够制得与正常软骨结构和成分类似的，仿生度高的组织工程用仿生软骨细胞外基质，并且该组织工程用仿生软骨细胞外基质具有良好的生物相容性、可降解吸收性以及机械特性，同时成本低廉，成为修复软骨缺损的理想生物材料并满足临床大量应用的需要。

本发明的组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法：包括以下步骤：

a.选取制备组织工程用仿生软骨细胞外基质的仿生原材料，所述仿生原材料按质量百分比(wt％)包含如下成分：60～80的II型胶原蛋白、15～30的硫酸软骨素和5～10的透明质酸；

b.将步骤a中选用的仿生原材料用浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的有机酸或浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的盐酸充分溶解后得到酸性溶液；

c.将步骤b中得到的酸性溶液依次通过制孔处理、固化处理和强化处理并得到所需的适合软骨种子细胞生物学行为要求的组织工程用仿生软骨细胞外基质。

进一步，步骤c中得到的组织工程用仿生软骨细胞外基质具备如下物理结构参数：孔径100-150μm，孔隙率60-90％，孔通率100％；

进一步，步骤b中所述的有机酸为醋酸或丙二酸；

进一步，步骤c所述的制孔处理为：在20-25℃的条件下，将制孔剂添加到步骤b得到的酸性溶液中，充分搅拌使其混合均匀后得到仿生原材料总质量浓度为5％～30％的组织工程用仿生软骨细胞外基质溶液，再将所述的组织工程用仿生软骨细胞外基质溶液注入预先制备好的用于制作组织工程用仿生软骨细胞外基质的模具中，对模具加压、密封并在-10℃～-30℃的环境中放置2-4h即可，其中，制孔剂为粒径在100-150μm的水溶性制孔剂；

进一步，步骤c所述的固化处理为冷冻冻干，步骤c中所述的强化处理为化学交联；

进一步，所述固化处理为：将步骤c中经制孔处理的酸性溶液置于-70℃～-90℃的环境中放置6-12h后，进行冻干并得到冻干的复合材料；

进一步，所述强化处理包括如下步骤：①将所述冻干的复合材料取出并浸泡于浓度为5-10％的交联剂溶液中，每2-4h更换交联剂溶液，24h后对含有复合材料的交联剂溶液进行低温冻干并得到复合基质材料，②将复合基质材料经去离子水反复漂洗至复合基质材料为中性，得到多孔的复合基质材料，③将多孔的复合基质材料进行冻干，再通过X-射线消毒，即可得到所需的组织工程用仿生软骨细胞外基质产品，其中交联剂为醛类交联剂、碳化二亚氨类交联剂、京尼平或1，4-二(3，4-羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(NDGA)。

本发明还提供以下制备组织工程用仿生软骨细胞外基质的优选实施方法，包括如下步骤：

1)选取制备组织工程用仿生软骨细胞外基质的仿生原材料，按质量百分比(wt％)包括如下成分：

60-80的II型胶原蛋白、15-30的硫酸软骨素、5-10的透明质酸；

2)将步骤1)所述量的II型胶原蛋白、硫酸软骨素和透明质酸溶于浓度均为0.01mol/L～0.1mol/L的醋酸、丙二酸溶剂或盐酸中并充分搅拌使其完全溶解得到酸性溶液；

3)在20-25℃条件下，将粒径为100-150μm的水溶性制孔剂按照孔隙率设计要求取量并加入酸性溶液后，充分搅拌使其混合均匀得到仿生原材料总质量浓度为5％～30％的组织工程用仿生软骨细胞外基质溶液，其中，制孔剂优选为NaCl或KCl晶体；

4)将步骤3)所得的组织工程用仿生软骨细胞外基质溶液注入预先制备好的用于制作组织工程用仿生软骨细胞外基质的模具中并加压、密封；

5)将步骤4)中所述的注入酸性溶液的模具置于-10℃～-30℃环境中放置2-4h后再置于-70℃～-90℃的环境中放置6-12h，最后再进行冻干；

6)依据胶原蛋白交联技术要求，将步骤5)中冻干的复合材料取出，浸泡于浓度为5-10％的交联剂溶液中，每2-4h对交联剂溶液进行更换，交联24h后对复合材料进行低温冻干得到复合基质材料，其中交联剂优选为戊二醛、京尼平(Genipin)或1，4-二(3，4-羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(NDGA)；

7)将步骤6)中冻干的复合基质材料用去离子水反复漂洗至复合基质材料为中性，得到多孔的复合基质材料；

8)将所述多孔的复合基质材料进行低温冻干，再经X-射线消毒后即可得到组织工程用仿生软骨细胞外基质产品，所述组织工程用仿生软骨细胞外基质产品具备如下物理结构参数：孔径：100～150μm，孔隙率60～90％，孔通率100％。

本发明的有益效果在于：本发明的组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法，选取与人体正常关节软骨细胞外基质主要成分相同的材料作为制备组织工程用仿生软骨细胞外基质的仿生原材料，在制备过程中，将选取的仿生原材料通过有机酸充分溶解后依次通过制孔处理、固化处理和强化处理，使最终得到的组织工程用仿生软骨细胞外基质具备适合软骨种子细胞接种、存活及增殖等生物学行为要求的物理结构特征，同时具备良好生物相容性、适宜的降解速率和良好的生物力学强度，并且，所用仿生原材料来源广泛，成本低廉，工艺简单易行，重现性好，制得的组织工程用仿生软骨细胞外基质可广泛应用于修复大面积的关节软骨缺损并且临床并发症少。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例的组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：

将II型胶原蛋白、硫酸软骨素和透明质酸按照质量百分比6∶3∶1溶于0.05mol/L丙二酸溶液中，充分搅拌使其完全分散，配制成仿生原材料总质量浓度为15％的酸性胶原蛋白混合液；依据组织工程学原理，选用粒度为125-150μm的NaCl晶体作为制孔剂；取100ml酸性胶原蛋白混合液，在20℃的条件下，加入粒径为125-150μm的NaCl晶体100g，充分搅拌使其混合均匀；取10ml含有NaCl的酸性胶原蛋白混合液注入用于制作组织工程用仿生软骨细胞外基质的直径为3cm圆柱形模具中，对模具进行加压、密封并置于-10℃冰箱中放置4h；然后再将模具置于-70℃冰箱中放置6h。最后置于低温冷冻干燥机中冻干；再将冻干的胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸复合材料从模具中取出，浸泡在浓度为5％的京尼平溶液中，每4h更换一次交联剂溶液，交联24h后低温冻干；最后将冻干的复合基质材料用去离子水漂洗5次(每次20mins)后，将所得的中性多孔复合基质材料再次低温冻干，最后经X-射线消毒得到所需的组织工程软骨仿生细胞外基质产品，将产品密封低温储存即可。

本实施例中，制孔工艺为现有技术，制孔剂为具备特定粒度和一定水溶性的晶体，优选为NaCl晶体，当然，也可优选为KCl晶体，使产品的孔隙率高，分布均匀度好；固化处理采用在-70℃的条件下冷冻冻干，保障材料不会变性或失活，强化处理采用化学交联，在本实施例中，交联剂为浓度为5％的京尼平，经强化处理得到的复合基质材料，其生物力学强度高，临床耐用性好。

经本发明的研究人员大量实验证实，交联剂浓度为5-10％、种类为醛类交联剂、碳化二亚氨类交联剂或1，4-二(3，4-羟基苯)-2，3-二甲基丁烷(NDGA)均可以实现本发明的目的，并且，经本发明研究人员的大量实验证实，本方法中，用于仿生原材料溶解的溶剂为其他种类的浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的有机酸同样可以实现本发明的目的，而有机酸采用浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的醋酸或丙二酸，可使制备过程中，带入溶液的杂质离子种类少，便于后续工艺中杂质离子的分离和去除，当然，本实施例中，用于仿生原材料溶解的溶剂为浓度为0.01mol/L～0.1mol/L的盐酸同样可以实现本发明的目的。

用本发明方法制备的组织工程软骨仿生细胞外基质产品，可广泛用于软骨的体外构建或体内再生，用于修复大面积的关节软骨缺损临床效果好，并发症少，同时成本低廉，制作容易。

依据ISO10993系列标准，采用扫描电镜观察、力学实验、降解性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验等方法对组织工程软骨仿生细胞外基质产品的形态结构、力学性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能进行检测。经扫描电镜观察，可见孔径为125-150μm；孔隙率为90％；孔通率为100％。检测结果证明本发明的组织工程软骨仿生细胞外基质产品具有设计要求的内部空间结构和组成比例，具有良好的组织相容性和生物安全性，利于细胞粘附、增生，具有良好的机械强度，能够满足植入部位的力学要求，具有可控降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配。

采用该组织工程软骨仿生细胞外基质产品结合种子细胞制备技术、双相凝胶接种技术及组织块体外培养技术构建工程化软骨组织；大动物(猪)体内植入修复实验结果表明采用本发明的组织工程软骨仿生细胞外基质产品构建的工程化软骨组织植入体内后与周围正常组织完全整合，降解时间与周围新生组织生长速度匹配；软骨修复组织具有类似天然关节软骨的生物学特性。

实施例2

本实施例的组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：

将II型胶原蛋白、硫酸软骨素和透明质酸按照质量百分比7∶2.5∶0.5的质量百分比溶于0.05mol/L丙二酸溶液中，充分搅拌使其完全分散，配制成仿生原材料总质量浓度为5％的酸性胶原蛋白混合液；再依据组织工程学原理，选用粒度为100-125μm的KCl晶体作为制孔剂；再100ml酸性胶原蛋白混合液，在25℃的条件下，加入粒径为100-125μm的KCl晶体颗粒120g，充分搅拌使其混合均匀；取10ml含有KCl的酸性胶原蛋白混合液注入直径为3cm圆柱形模具中，对模具进行加压、密封并置于-20℃的冰箱中放置2h；然后再将模具置于-80℃的冰箱中放置9h，最后置于低温冷冻干燥机中冻干；再将冻干的胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸复合材料从模具中取出，浸泡在浓度为10％的NDGA溶液中，每2h更换一次交联剂溶液，交联24h后低温冻干；最后将冻干的复合基质材料用去离子水漂洗5次(每次20mins)，再将所得的中性多孔复合基质材料再次低温冻干，最后经X-射线消毒得到所需的组织工程软骨仿生细胞外基质产品，将产品密封低温储存即可。

依据ISO10993系列标准，采用扫描电镜观察、力学实验、降解性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验等方法对组织工程软骨仿生细胞外基质产品的形态结构、力学性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能进行检测。经扫描电镜观察，可见孔径为100-125μm；孔隙率为80％；孔通率为100％。检测结果证明本发明的组织工程软骨仿生细胞外基质产品具有设计要求的内部空间结构和组成比例；具有良好的组织相容性和生物安全性，利于细胞粘附、增生；具有良好的机械强度，能够满足植入部位的力学要求；具有可控降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配。

采用该组织工程软骨仿生细胞外基质产品结合种子细胞制备技术、双相凝胶接种技术及组织块体外培养技术构建工程化软骨组织；大动物(猪)体内植入修复实验结果表明采用本发明的组织工程软骨仿生细胞外基质产品构建的工程化软骨组织植入体内后与周围正常组织完全整合，降解时间与周围新生组织生长速度匹配；软骨修复组织具有类似天然关节软骨的生物学特性。

实施例3

本实施例的组织工程用仿生软骨细胞外基质的制备方法，包括以下步骤：

将II型胶原蛋白、硫酸软骨素和透明质酸按照质量百分比8∶1.5∶0.5的质量百分比溶于0.1mol/L醋酸溶液中，充分搅拌使其完全分散，配制成仿生原材料总质量浓度为30％的酸性胶原蛋白混合液；再按照组织工程用仿生软骨细胞外基质的孔径设计要求，选用粒度为120-140μm的NaCl晶体作为制孔剂；取100ml酸性胶原蛋白混合液，在22℃的条件下，加入粒径为120-140μm的NaCl晶体颗粒90g，充分搅拌使其混合均匀；取10ml含有NaCl的酸性胶原蛋白混合液注入直径为3cm圆柱形模具中，对模具进行加压、密封并置于-30℃冰箱中放置3h；然后再将模具置于-90℃冰箱中放置12h，最后置于低温冷冻干燥机中冻干；再将冻干的胶原蛋白、硫酸软骨素、透明质酸复合材料从模具中取出，浸泡在浓度为8％的戊二醛溶液中，每3h更换一次交联剂溶液，交联24h后低温冻干；最后将冻干的复合基质材料用去离子水漂洗5次(每次20mins)，再将所得的中性多孔复合基质材料再次低温冻干，最后经X-射线消毒得到所需的组织工程软骨仿生细胞外基质产品，将产品密封低温储存即可。

依据ISO10993系列标准，采用扫描电镜观察、力学实验、降解性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验等方法对组织工程软骨仿生细胞外基质产品的形态结构、力学性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能进行检测。经扫描电镜观察，可见孔径为120-140μm；孔隙率为60％；孔通率为100％。检测结果证明本发明的组织工程软骨仿生细胞外基质产品具有设计要求的内部空间结构和组成比例；具有良好的组织相容性和生物安全性，利于细胞粘附、增生；具有良好的机械强度，能够满足植入部位的力学要求；具有可控降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配。

采用该组织工程软骨仿生细胞外基质产品结合种子细胞制备技术、双相凝胶接种技术及组织块体外培养技术构建工程化软骨组织；大动物(猪)体内植入修复实验结果表明采用本发明的组织工程软骨仿生细胞外基质产品构建的工程化软骨组织植入体内后与周围正常组织完全整合，降解时间与周围新生组织生长速度匹配；软骨修复组织具有类似天然关节软骨的生物学特性。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。