一种用于治疗恶性肿瘤的白花蛇舌草多糖及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于治疗恶性肿瘤的白花蛇舌草多糖，属中药领域。该白花蛇舌草多糖以白花蛇舌草为原料，经水提、醇沉、加鞣质去蛋白、活性炭脱色，超滤、柱层析分离等工艺加工而制成。该白花蛇舌草多糖具有较好的抗肿瘤活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种白花蛇舌草多糖制备方法，特别涉及一种用于治疗恶性肿瘤的白花蛇舌草多糖制备方法及其应用，属中药领域。

背景技术

恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病之一，根据世界卫生组织最新的统计结果显示，全球癌症每年新发病1000万人，死亡700万人，我国每年死于癌症的病人在200万人以上，是仅次于心脑血管病的人类第二号杀手。目前，医学界对于恶性肿瘤尚无良好的方法。目前临床常规应用的手术、放疗、化疗及近年来兴起的靶向治疗均未能有效的控制肿瘤及防止其复发转移，且均具有较严重毒副作用，严重影响患者生活质量；同时价格昂贵，加重国家及患者家庭经济负担。

白花蛇舌草Oldenlandia diffusa(Willd.)Roxb.又名蛇舌草、蛇舌癀、蛇针草、蛇总管、龙吐珠、珠仔草等，性寒，味甘微苦，归心、肝、脾经，始载于《神农本草经》，具清热、利湿、解毒、抗癌等功效，善治肺热咳嗽、各种癌症，是临床广泛应用的抗肿瘤药物。大量药效学实验及临床应用实验表明，白花蛇舌草对肿瘤有良好的治疗效果，且其能显著增强机体的免疫力，有极大的开发利用价值。文献对白花蛇舌草抗肿瘤活性的研究基本上集中在多糖。但对于白花蛇舌草多糖的研究多是粗多糖，并没有对白花蛇舌草粗多糖进一步的精制纯化研究。为从根本上消除恶性肿瘤病因，改善症状，将避免目前治疗手段中的诸多副作用，减轻患者痛苦，很有必要对白花蛇舌草中的多糖进一步的分离纯化所得到的纯度更高、抗肿瘤活性更强的白花蛇舌草多糖(POD)。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种治疗恶性肿瘤的白花蛇舌草多糖；

本发明的另一个目的在于提供上述白花蛇舌草多糖的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：

取白花蛇舌草药材，加入4～20倍量水，提取1～4次，每次0.5～3h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达40～90％，冷藏至沉淀析出完全，过滤，沉淀加水溶解，加入0.01～3％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.01～3％活性炭，脱色1～4次，每次0.5～2h，滤过，滤液流经截流相对分子质量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，干燥，干燥物加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱，用水洗脱，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，干燥，即得。

优化工艺为：取白花蛇舌草药材，加入8～15倍量水，提取1～3次，每次1～2h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达50～80％，冷藏至沉淀析出完全，沉淀加水溶解，加入0.1～1％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.2～1％活性炭，脱色1～3次，每次0.5～1h，滤过，滤液流经截流相对分子质量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，干燥，干燥物加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱，用水洗脱，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，干燥，即得。

进一步优化工艺为：取白花蛇舌草药材，加入12倍量75～85℃热水，保温提取3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达80％，冷藏至沉淀析出完全，沉淀加水溶解，加入0.5％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.5％活性炭，脱色3次，每次1h，滤过，滤液流经截流分子量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，冷冻干燥，加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱，用水洗脱，流速0.5ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，冻干，即得。

为了确证上述工艺所得的白花蛇舌草多糖的纯度，保证其起生理活性的物质基础，发明人对上述工艺所得的白花蛇舌草多糖进行了分子量测定、及其他纯度测定。

(1)相对分子质量测定：采用凝胶渗透色谱法对白花蛇舌草精制多糖HPS的分子量进行了测定。选用6个已知分子量的多糖标准品(Dextran T5、T10、T40、T70、T500、T2000，分子量分别为0.5万、1万、4万、7万、50万、200万)，分别用蒸馏水制成5mg/ml的标准溶液，分别取100μl注入AKTA柱层析系统，用0.15mol/L的氯化钠溶液洗脱，流速为0.5ml/min，于210nm处检测多糖，分别求得洗脱体积Ve。以T2000作为柱外水体积V₀，以Ve/V₀为横坐标，lgM为纵坐标，得到分子量测定标准曲线。

测定方法：取待测多糖5mg，溶于1ml水，进样量为100μl，洗脱条件同Dextran标准品系列，求得相应的洗脱体积，计算Ve/V₀值，根据所得标准分子量标准曲线，求得其分子量。采用凝胶渗透色谱法(GPC)对POD的分子量进行测定，得到不同分子量标准多糖及POD的洗脱体积，试验结果见表1。根据表中标准多糖的测定结果，按照lgM-Ve/V₀关系作图，得到分子量—洗脱体积标准曲线图，得回归标准曲线方程为：Y＝-1.5340X+7.8137 R²＝0.9996，根据白花蛇舌草多糖的洗脱体积求得其相对分子质量约为6310。

表1分子量标准多糖与白花蛇舌草多糖的洗脱体积与分子量

(2)单糖组成分析

采用HPLC-ELSD法对白花蛇舌草多糖组分完全酸水解之后的单糖进行了分析。色谱条件为色谱柱：Zorbax Carbohydrate Analysis Column(4.6×250mm，5μm)；流动相：乙腈∶水＝75∶25；流速：1ml/min；Alltech ELSD2000工作条件：漂移管温度：81.3℃，载气流速：2.1L/min，柱温：40℃。

对照品溶液：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖标准品均为100μg/ml，溶剂为50％乙腈；混合标准单糖：D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖混合标准单糖的浓度梯度为：15.63μg/ml、31.25μg/ml、62.5μg/ml、125μg/ml、200μg/ml、250μg/ml，溶剂为50％乙腈；

供试品溶液：取白花蛇舌草多糖10mg，置10ml具塞试管中，加入2mol/L三氟乙酸溶液5ml，封管，100℃水解8h。水解液真空干燥后，再加入5ml 2mol/L的三氟乙酸重复水解一次，冷却，加蒸馏水重复真空干燥至三氟乙酸挥发干净，最后用0.5ml 50％乙腈溶解。

测定方法：首先D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖7种标准单糖分别进样，确定各单糖保留时间，然后应用混合标准单糖进样，依据各单糖峰面积和标准单糖浓度分别制作标准曲线。根据供试品溶液的峰面积计算各单糖间的比例。试验结果表明：白花蛇舌草多糖主要含有鼠李糖、木糖、半乳糖和葡萄糖。将HPS中各单糖的峰面积代入表中相应的标准曲线，计算得到白花蛇舌草多糖中各单糖的质量比为：鼠李糖∶木糖∶半乳糖∶葡萄糖＝36.77∶17.28∶64.00∶122.26，转换为摩尔比为：鼠李糖∶木糖∶半乳糖∶葡萄糖＝1.75∶1∶3.09∶5.90。具体实验结果见表2、3。

表2单糖峰面积和标准单糖浓度关系

表3各标准单糖的标准曲线

(3)纯度鉴定

采用凝胶柱层析法进行所得多糖的纯度鉴定。

测定方法：称取白花蛇舌草多糖6mg，溶于0.75ml蒸馏水中，上样量为0.5ml，凝胶柱为Superdex 30柱，采用0.15mol/L氯化钠进行洗脱，流速为0.5ml/min，于210nm处进行在线紫外检测。经过反复上样测定，洗脱峰都为单一对称峰，说明所得多糖的纯度较高。有益效果

本发明白花蛇舌草多糖，具有很强的抗肿瘤活性。

为进一步验证本发明的药理作用，用本发明白花蛇舌草多糖进行了动物对比药效学实验。

实验例1：本发明对S180荷瘤小鼠的影响

1试剂、样品和动物

1.1试剂

注射用环磷酰胺，200mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：08051354

1.2供试样品：

加入12倍量80℃热水，保温提取3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达80％，冷藏至沉淀析出完全，沉淀加水溶解，加入0.5％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.5％活性炭，脱色3次，每次1h，滤过，滤液流经截流分子量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，冷冻干燥，加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱(径高比为1∶15)，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱(径高比为1∶20)，用水洗脱，流速0.5ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，冻干，用前用蒸馏水配制成所需浓度。

1.3实验动物

昆明种雄性小鼠，SPF级，体重20±2g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物许可证号为：SCXK(鲁)20050015。S180腹水小鼠购自山东省医学科学院。

2实验方法

无菌抽取传代8d的S180腹水小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整浓度至4X10⁹/L，于每只小鼠右腋下注射0.2ml，接种60只。接种24h后，将小鼠随机分为5组，每组10只，分为模型组、本发明高、中、低剂量组与对照组。模型组灌胃生理盐水10mL·Kg^-1，连续10d；白花蛇舌草多糖高、中、低剂量组分别灌胃20、10、5mg·Kg^-1药液，连续10d；对照组腹腔注射环磷酰胺，剂量30mg·Kg^-1，连续2d；给药量均为10mL·Kg^-1。末次给药24h后，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称重，计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数，计算公式如下：

抑瘤率％＝(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值)/空白组瘤重均值×100％

胸腺(脾脏)指数＝重量(mg)/体重(g)

3实验结果

本发明3个剂量组的抑瘤率分别为34.4％、26.2％、17.1％。与模型组比较，环磷酰胺组与白花蛇舌草多糖高、中剂量组抑瘤率均有显著性差异(P＜0.05)，低剂量组虽然有一定的抑瘤效果，但与模型组比较无显著性差异(见表4)。本发明各剂量组的脾脏、胸腺指数与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，环磷酰胺组与模型组比较有极显著差异(P＜0.01)(见表5)。

表4本发明对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤作用(n＝10)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

表5本发明对S180荷瘤小鼠的体内抑瘤作用(n＝10)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

实验例2：本发明对H22荷瘤小鼠的影响

1试剂、样品和动物

1.1试剂

氟尿嘧啶注射液(5-Fu)，上海旭东海普药业有限公司，批号：080302

1.2供试样品(同实验例1)

1.3实验动物

昆明种雄性小鼠，SPF级，体重20±2g，购自山东中医药大学实验动物中心，动物许可证号为：SCXK(鲁)20050015。H22肝癌小鼠购自山东省医学科学院。

2实验方法

无菌抽取传代8d的H22肝癌小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整浓度至4X10⁹/L，于每只小鼠右腋下注射0.2ml，接种60只。接种24h后，将小鼠随机分为5组，每组10只，分为模型组、本发明高、中、低剂量组与对照组。模型组灌胃生理盐水10mL·Kg^-1，连续10d；白花蛇舌草多糖高、中、低剂量组分别灌胃20、10、5mg·Kg^-1药液，连续10d；对照组腹腔注射5-Fu，剂量25mg·Kg^-1，连续2d；给药量均为10mL·Kg^-1。末次给药24h后，颈椎脱臼处死，剥离肿瘤、胸腺、脾脏，称重，计算抑瘤率、胸腺与脾脏指数，计算公式如下：

抑瘤率％＝(空白组瘤重均值-样品组瘤重均值)/空白组瘤重均值×100％

胸腺(脾脏)指数＝重量(mg)/体重(g)

3实验结果

本发明3个剂量组的抑瘤率分别为43.3％、33.5％、23.6％。与模型组比较，5-Fu组与白花蛇舌草多糖各剂量组抑瘤率均有显著性差异(P＜0.05)(表6)。本发明各剂量组的脾脏指数与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，本发明中、低剂量组的胸腺指数与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)，但高剂量组的胸腺指数与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，5-Fu组的脾脏、胸腺指数与模型组比较均有极显著差异(P＜0.01)(表7)。

表6本发明对H22荷瘤小鼠的体内抑瘤作用(n＝10)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

表7本发明对H22荷瘤小鼠的体内抑瘤作用(n＝10)

注：与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

实验例3：本发明对人宫颈癌Hela细胞和人肝癌Bel-7402细胞生长的影响

1试剂、样品

1.1试剂

人肝癌Bel-7402细胞株、人宫颈癌Hela细胞株(美国Sciencell公司)，购自北京北方伟业发展有限公司；白花蛇舌草多糖，自制；5-氟尿嘧啶(5-Fu)，购自合肥霍氏医药科技有限公司；RPMI-1640培养液(美国GIBCO公司)，购自上海卓康生物科技有限公司；胎牛血清，购自北京拜尔迪生物技术有限公司；胰蛋白酶、核糖核酸酶(RNase)和碘化丙啶(PI)，购自国药集团化学试剂有限公司；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)，购自Sigma公司。

1.2供试样品(同实验例1)

2实验方法

2.1细胞培养

取人肝癌Bel-7402细胞株、人宫颈癌Hela细胞株肿瘤细胞以适量浓度接种于培养瓶中，加入含10⁶U/L庆大霉素、0.1g/L链霉素和10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置于含5％CO₂、37℃恒温及饱和湿度的培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3天传代一次，倾倒原来的培养基，加入胰酶溶液消化，待细胞从瓶壁上脱落混悬于液体中后，加入少量胎牛血清终止消化，将原瓶中含有细胞的愚浮液移至离心管中，以1000rpm离心5min后弃去液体，加入新鲜培养基吹打均匀，按所需细胞量移入新培养瓶中，添加完全培养液至适量。实验期间不断冻存细胞，全部实验均用指数生长期细胞，各组细胞均培养72h。

2.2试验分组

随机分为5组，空白对照组：于含10⁶U/L庆大霉素、0.1g/L链霉素和10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中常规培养；供试药物组：取本发明供试液适量，加入适当RPMI1640培养液稀释，终浓度分别为10g/L、50g/L和100g/L(以生药材计)；阳性对照组：5-氟尿嘧啶经0.22μm微孔滤膜滤过除菌，加入RPMI1640培养液稀释，终浓度为0.1g/L。

2.3采用倒置显微镜直接观察培养过程中细胞的形态变化，详细记录观察现象。

2.4MTT法测定细胞生长抑制率

将各肿瘤细胞接种于96孔培养板，每孔细胞数10⁴个(分组同上，空白对照组加等量完全培养基)；细胞同步化后，更换新鲜培养基，分别加入个对应药物溶液，培养72h。移液枪小心吸去所有上清液，每孔加160μl无血清培养基及40μlMTT(MTT终浓度为1g/L)；铝箔包好培养板，继续培养4h；终止培养时吸去孔内所有上清液，每孔加200μlDMSO，于室温下微孔板振荡器上振荡10min，采用酶标仪于570nm波长处测定对应的光密度(D值)。

2.5流式细胞仪测定细胞凋亡率

分别收集上述经处理后的Bel-7402和Hela细胞，用PBS调细胞浓度为10⁹/L，取1ml单细胞悬液，离心、漂洗，用70％乙醇1ml固定细胞，然后用PBS漂洗。在单细胞样本中加入RNase，再加入终浓度为50mg/L的PI染色，过滤后立即采用流式细胞仪测定细胞凋亡(以正常人的外周血淋巴细胞为正常二倍体标准，用CELLQUEST分析软件分析Bel-7402和Hela细胞的凋亡率)。

3实验结果

3.1细胞形态变化

通过倒置显微镜可观察到，本发明组的Bel-7402细胞生长明显受到抑制，细胞由贴壁而逐渐脱落，并浮悬于培养液中，细胞透明度和粘附力下降，细胞变圆，且体积逐渐缩小；空白对照组细胞生长较正常，呈梭形，贴壁生长，核质比正常，核膜完整；阳性对照组与大剂量供试药物组更相似。

本发明组的Hela细胞随时间的延长，细胞体积增大，大量悬浮细胞逐渐出现，分裂期细胞少见，且不同剂量对Hela细胞的影响不明显；空白对照组的Hela细胞生长较活跃，接种24h后即完全贴壁、可见分裂期细胞，悬浮细胞少。

3.2对Hela和Bel-7402细胞生长的抑制作用

本发明对Hela和Bel-7402细胞的增殖生长均有一定的抑制作用，随着浓度的增大，抑制率有明显升高，试验结果见表8。

表8本发明对Hela和Bel-7402细胞增殖生长的影响(n＝5)

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

3.3对Hela和Bel-7402细胞凋亡的影响

研究发现，随着本发明剂量增大和作用时间延长，Hela和Bel-7402细胞的凋亡率明显升高，本发明大剂量组好于阳性对照组，表现出了较好的抗肿瘤活性，试验结果见表9。

表9本发明对Hela和Bel-7402细胞凋亡的影响(n＝5)

注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

上述实验表明本发明具有较好的抗肿瘤活性。

以下以具体实施方式来进一步阐述本发明的技术方案，但本发明申请所要保护的内容并不仅于这些制备方法。实际生产中原料药的用量也不仅于实施例用量，可以以吨、公斤、克等为单位。

具体实施方式

实施例1：

取白花蛇舌草药材1kg，加入20倍量100℃热水，煮沸提取4次，每次3h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达90％，冷藏至沉淀析出完全，过滤，沉淀加水溶解，加入3％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加3％活性炭，脱色4次，每次2h，滤过，滤液流经截流相对分子质量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，干燥，干燥物加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱(径高比为1∶15)，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱(径高比为1∶20)，用水洗脱，流速0.5ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，干燥，得多糖1.2g。

实施例2：

取白花蛇舌草药材2kg，加入4倍量60℃热水，保温提取0.5h，滤过，滤液浓缩，加乙醇使含醇量达40％，冷藏至沉淀析出完全，过滤，沉淀加水溶解，加入0.01％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.01％活性炭，脱色0.5h，滤过，滤液流经截流相对分子质量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，干燥，干燥物加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱(径高比为1∶12)，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速2ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱(径高比为1∶15)，用水洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，减压干燥，得多糖1.8g。

实施例3：

取白花蛇舌草药材1.5kg，加入8倍量70℃热水，保温提取1h，滤过，滤液浓缩，加乙醇使含醇量达50％，冷藏至沉淀析出完全，沉淀加水溶解，加入0.1％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.2％活性炭，脱色0.5h，滤过，滤液流经截流相对分子质量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，干燥，干燥物加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱(径高比为1∶15)，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速2ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱(径高比为1∶20)，用水洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，冻干，得多糖1.5g。

实施例4：

取白花蛇舌草药材1kg，加入15倍量90℃热水，保温提取3次，每次2h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达80％，冷藏至沉淀析出完全，沉淀加水溶解，加入1％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加1％活性炭，脱色3次，每次1h，滤过，滤液流经截流相对分子质量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，干燥，干燥物加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱(径高比为1∶20)，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱(径高比为1∶15)，用水洗脱，流速0.5ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，冻干，得多糖1.1g。

实施例5：

取白花蛇舌草药材2kg，加入12倍量80℃热水，保温提取3次，每次1h，滤过，合并滤液，浓缩，加乙醇使含醇量达80％，冷藏至沉淀析出完全，沉淀加水溶解，加入0.5％体积份的20％鞣酸乙醇溶液，冷藏至沉淀析出完全，滤过，滤液加0.5％活性炭，脱色3次，每次1h，滤过，滤液流经截流分子量为10k的超滤膜，收集相对分子质量小于10k部分，冷冻干燥，加水溶解，通过DEAE-Sephrose离子交换柱(径高比为1∶15)，用0.5mol/L氯化钠溶液洗脱，流速1ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，透析法除盐后，通过Superdex 30凝胶柱(径高比为1∶20)，用水洗脱，流速0.5ml/min，紫外检测器210nm检测，收集第四个检测峰的洗脱液，冷冻干燥，得多糖2g。