一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，由PCR引物I、II、III、IV、杂交膜、预杂交液、杂交液、抗体、洗脱液I、II、III、IV、缓冲液I、II、III、显色液和终止液等成分组成。本发明针对靶基因的突变部位设定多个探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行观察结果。本发明简便实用，特异性高，灵敏度强，适于基层单位及现场快速检测。

说明书

技术领域

本发明涉及生物试剂，具体涉及一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，特别是涉及检测乙型肝炎病毒突变(PreS、T1653、V1753、T1762、A1764)的试剂盒。

背景技术

全世界有约超过30亿人感染乙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒突变是乙型肝炎病毒阳性肝病(包括乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌)的重要危险因素之一，随着感染的持续，肝脏疾病在从乙型病毒性肝炎向肝硬化和肝癌的发展过程中，病毒的突变率逐渐增加，特别在乙型肝炎病毒特定的区域，如基本核心区的某些特定位点的突变与肝细胞癌的发生具有重要联系。高达70％的肝癌患者发生T1762/A1764双突变，48.2％肝癌患者发生PreS突变，37％发生T1653突变，39％发生V1753突变，检测这些特定突变对肝细胞癌的早期发现、早期诊断和早期治疗具有重要意义。

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)属嗜肝病毒科(hepadnaviridae)中正类嗜肝病毒属(orthohepadnavirus)，HBV DNA有不完全的环状双链DNA组成，长的为负链，短的为正链，负链约含3200碱基(bp)，正链的长度可变，相当于负链的50％～80％，HBV基因组中包含4个开放读码框(open reading frame，ORF)，均位于负链，分别是S区、C区、P区和X区，其中S区又分为前S1、前S2和S三个编码区，分别编码preS1、preS2和HBsAg蛋白，C区又可分为前C区(precore)和基本核心启动区(basic core promoter，BCP)，分别编码HBeAg和HBcAg。根据基因差异率超过8％，可将乙型肝炎病毒分为A-H八个基因型。感染乙型肝炎病毒可引起急慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。中国是乙肝流行的高发区之一，中国第三次乙型肝炎血清流行病学调查显示中国平均感染率为8.7％，每年有超过30万人罹患肝癌死亡。研究快速检测乙型肝炎病毒突变的方法对肝脏疾病的早期诊断、预防和控制具有重要意义。

目前常用的突变检测方法为基因直接测序，但该方法费时、费力，敏感性低，达不到早期快速诊断的目的。因而，需要一种快速检测的方法用于流行病学现场调查和实验室快速检测。

反向杂交线性探针(reverse hybridization line probe assay)技术具有特异性强、灵敏度高、快速且成本低等优点，其特点是针对靶基因的突变部位设定多个可能的探针，利用探针与模板的特异性结合，然后通过显色进行结果观察，简便实用，特异性高，灵敏度强。反应在杂交炉内可完成，不仅节约仪器成本，而且操作方法更简单，适于基层单位及现场快速检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述不足之处，研究设计快速联合检测5种乙型肝炎病毒突变(PreS、T1653、V1753、T1762、A1764)的方法。

本发明提供了一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒，试剂盒的组成包括：

1.PCR引物I、II、III、IV各1ml；

2.杂交膜20张；

3.预杂交液200ml；

4.杂交液200ml；

5.抗体100ul(碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体)；

6.洗脱液I、II、III、IV各100ml；

7.缓冲液I、II、III各200ml(NaCl，Tris，牛血清白蛋白)；

8.混合显色液(NBT/BCIP)100ml；

9.0.2mmol/L EDTA终止液20ml。

本发明的另一目的是提供了一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤：

1.PCR引物I、II、III、IV的制备：

人工合成引物P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8，详细的序列见表1，注意P3和P75’端使用生物素标记。

合成后的引物稀释成5μM，

将P1和P2等量混合组成引物I，为BCP区巢式PCR第一轮引物；

P3和P4等量混合组成引物II，为BCP区巢式PCR第二轮引物；

P5和P6等量混合组成引物III，为PreS区巢式PCR第一轮引物；

P7和P8等量混合组成引物IV，为PreS区巢式PCR第二轮引物。

表1引物序列

人工合成引物是常规技术，由合成引物公司按本发明要求合成的。

2.杂交膜的制备：

(1)针对突变位点设计多种特异探针，然后人工合成探针，具体探针序列见表2。

表2探针序列

(2)探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上。

40μl反应体系：

5mmol/L探针                              4μl

5×buffer                                8μl

0.1mol/L dTTP(2’-脱氧胸苷5’-三磷酸)    10μl

20U/μl TdT(末端脱氧核苷酸转移酶)        1.5μl

ddH₂O                                    16.5μl

37℃水浴2h，最后使用0.2mmol/L EDTA终止反应；

(3)探针固定，将尼龙膜剪裁成1×20的长条，打印数字。将加尾的探针稀释成5pmol/L，使用点样仪点到尼龙膜上，见图1。紫外线(UV)照射5min，80℃烘烤2h。

3.试剂盒中液体的配制：

(1)洗脱液I组成：终浓度，

0.9mmol/L NaCl(氯化钠)

0.09mol/L柠檬酸三钠

0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)；

(2)洗脱液II组成：终浓度，

0.75mmol/L NaCl(氯化钠)

0.075mol/L柠檬酸三钠

0.1％SDS；

(3)洗脱液III组成：终浓度

0.15mmol/L NaCl(氯化钠)

0.015mol/L柠檬酸三钠

0.1％SDS；

(4)洗脱液IV组成：终浓度

0.015mmol/L NaCl(氯化钠)

0.0015mol/L柠檬酸三钠

0.1％SDS。

(5)预杂交液：终浓度

0.75mmol/L NaCl(氯化钠)

0.075mol/L柠檬酸三钠

0.5％Triton X-100(曲拉通X-100)

(6)缓冲液I组成：终浓度

0.15mol/L Nacl

100mmol/L Tris(三羟甲基氨基甲烷乙酸盐)

pH 7.5

(7)缓冲液II组成：终浓度

0.15mol/L Nacl

0.1mol/L Tris

3％牛血清白蛋白(BSA)

pH7.5

(8)缓冲液III组成：终浓度

0.1mol/L Nacl

0.1mol/L Tris

3％牛血清白蛋白(BSA)

50mmol/L Mgcl₂

pH 9.5

(9)终止液组成：终浓度

0.2mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)

(10)抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体；(市售)

(11)显色液：NBT/BCIP(氯化硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)混合显色液；(市售)。

本发明的又一目的是提供了一种检测乙型肝炎病毒变异的试剂盒的检测方法，该方法包括下列步骤：

(1)提取乙肝病毒DNA，使用引物I和II分别进行巢式PCR扩增；

(2)将杂交膜放入100ml洗脱液I中，68℃漂洗30min；

(3)68℃加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动；

(4)将扩增的PCR产物煮沸10min，冰浴5min，使DNA变性；

(5)将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与杂交膜68℃杂交120min；

(6)用50ml洗脱液II于68℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

(7)用50ml洗脱液III于37℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

(8)用50ml洗脱液IV于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min；

(9)缓冲液II中42℃封闭40min；

(10)10min缓冲液I中加入抗体10μl，37℃摇床上摇动30min；

(11)缓冲液I中室温漂洗2次，每次15min；

(12)缓冲液III中室温漂洗2次，每次15min；

(13)10ml缓冲液III中加入0.1ml显色液，避光显色10～30min；

(14)最后用终止液终止反应；

(15)结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性。

附图说明

图1：探针点样分布。

图2：反向杂交反应原理。

图3：乙型肝炎病毒PCR扩增BCP区电泳图。

图4：乙型肝炎病毒PCR扩增PreS区电泳图。

具体实施方式

实施例1试剂盒组成成分的具体制备PCR引物I、II、III、IV的制备：

人工合成引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)P1，P2，P3，P4，P5，P6，P7，P8(详细的序列见表1)，合成的浓度为2OD，按照摩尔浓度的200倍稀释，合成后的引物稀释成5μM，上游引物和下游引物各取500ul，按照1∶1混合后的引物浓度为10μM，将P1和P2混合组成1ml引物I，其它引物的稀释方法相同，总量均为1ml，P3和P4混合组成引物II，P5和P6混合组成引物III，P7和P8混合组成引物IV。

1.杂交膜的制备：

(1)针对突变位点设计多种特异探针，探针序列根据突变位点核苷酸的多态性，设计各种探针，然后人工合成探针，具体探针序列见表2。

(2)探针加尾，便于探针固定到尼龙膜上。

40μl反应体系：

5mmol/L探针         4μl

5×buffer           8μl

0.1mol/L dTTP       10μl

20U/μl TdT         1.5μl

ddH₂O               16.5μl

反应体系中，TdT为核酸转移酶，37℃水浴2h，最后使用0.2mmol/L EDTA终止反应；

(3)探针固定，将尼龙膜剪裁成1×20的长条共20张，打印编号。将加尾的探针稀释成5pmol/L，使用点样仪将探针均匀固定到尼龙膜上，每孔点样1ul，具体点样分布见图1。紫外线(UV)照射5min，80℃烘烤2h。

2.试剂盒中液体的配制，具体的配制方法如下：

(1)洗脱液I 100ml：

NaCl 5.23g

柠檬酸三钠2.65g

SDS 0.5g；

(2)洗脱液II 100ml：

NaCl 4.39g

柠檬酸三钠2.21g

SDS 0.1g；

(3)洗脱液III 100ml：

NaCl 0.88g

柠檬酸三钠0.44g，

SDS 0.1g；

(4)洗脱液IV100ml.

NaCl 0.09g

柠檬酸三钠0.04g

SDS 0.1g。

(5)预杂交液200ml

NaCl 8.78g

柠檬酸三钠4.42g

Triton X-1001ml

(6)缓冲液I 200ml组成：

Nacl 1.76g

Tris 2.42g

pH 7.5

(7)缓冲液II200ml组成：

Nacl 1.76g

Tris 2.42g

牛血清白蛋白(BSA)3ml

pH 7.5

(8)缓冲液III 200ml组成：

Nacl 1.17g

Tris 2.42g

牛血清白蛋白(BSA)3ml

Mgcl₂ 0.97g

pH 9.5

(9)终止液：0.2mmol/L EDTA 20ml。

EDTA  1.8g

ddH₂O 20ml

(10)抗体：碱性磷酸酶交联的链亲和素生物素抗体200ul；(市售)

(11)显色液：NBT/BCIP混合显色液100ml；(市售)。

实施例2、样品中DNA的提取和PCR扩增

(1)乙型肝炎病人和肝癌患者血清样本中提取DNA，煮沸法抽提DNA：

1)取200ul血清加入1.5ml离心管，加入400ul PEG(聚乙二醇)，充分振荡混匀，1300rpm/min离心10min；

2)去掉上清，加入80ul裂解液，充分振荡混匀，直至管底沉淀混匀；

3)沸水中煮沸10min；

4)1300rpm/min离心10min，去除沉淀，上清作为模板备用；

(2)巢式PCR扩增，BCP区第一轮PCR反应50ul体系：

DNA模板           6ul

引物I             2ul

缓冲液            5ul

Taq酶(DNA聚合酶)  1ul

dNTP              0.5ul

H₂O               35.5ul

扩增条件：94℃3min，94℃1min，54℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环。

(3)巢式PCR扩增，BCP(基本核心启动子)区第二轮PCR反应50ul体系：

第一轮产物作模板    2ul

引物II              2ul

缓冲液              5ul

Taq酶               1ul

dNTP                0.5ul

H₂O                 39.5ul

扩增条件：94℃3min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环。将扩增PCR产物电泳，1.5％琼脂糖电泳，溴化乙锭显色，结果见图3。

(4)巢式PCR扩增，PreS区第一轮PCR反应50ul体系：

DNA模板        6ul

引物III        2ul

缓冲液         5ul

Taq酶          1ul

dNTP           0.5ul

H₂O            35.5ul

扩增条件：94℃3min，94℃1min，51℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环。

(5)巢式PCR扩增，PreS区第二轮PCR反应50ul体系：

第一轮产物作模板  2ul

引物IV            2ul

缓冲液            5ul

Taq酶             1ul

dNTP              0.5ul

H₂O               39.5ul

扩增条件：94℃3min，94℃1min，52℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环。将扩增PCR产物电泳，1.5％琼脂糖电泳，溴化乙锭显色，结果见图4。

实施例3、乙型肝炎病毒突变的检测

选择新鲜收集的乙型肝炎感染患者血清，按照实例1方法抽提DNA，PCR扩增产物用于该试剂盒检测，同时将PCR产物进行测序，比较试剂盒检测和测序结果。具体检测步骤如下：

(1)提取乙肝病毒DNA，使用引物I和II分别进行巢式PCR扩增；

(2)将杂交膜放入100ml洗脱液I中，68℃漂洗30min；

(3)68℃加入预杂交液，预杂交60min，放置在摇床上轻轻摇动；

(4)将扩增的PCR产物煮沸10min，冰浴5min，使DNA变性；

(5)将变性的PCR产物与杂交液放入杂交管中，与杂交膜68℃杂交120min；

(6)用50ml洗脱液II于68℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

(7)用50ml洗脱液III于37℃漂洗2次，每次漂洗时间5min；

(8)用50ml洗脱液IV于室温漂洗2次，每次漂洗时间5min；

(9)缓冲液II中42℃封闭40min；

(10)10min缓冲液I中加入抗体10μl，37℃摇床上摇动30min；

(11)缓冲液I中室温漂洗2次，每次15min；

(12)缓冲液III中室温漂洗2次，每次15min；

(13)10ml缓冲液III中加入0.1ml显色液，避光显色10～30min；

(14)最后用终止液终止反应。

(15)结果判定：显色结果为兰色的结果判定阳性，和阴性对照比较无显色的为阴性。

使用该试剂盒对搜集的208例肝癌、215例慢性乙型肝炎患者血清进行了检测，结果如下(表3)。

表3使用试剂盒和直接测序的检测结果