2－甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉及其制备方法

摘要

本发明涉及一种2－甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉及其制备方法，有效解决了2－甲氧基雌二醇存在的水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低、普通注射剂较难达到高载药量和靶向作用的问题，本发明2－甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉，是由以重量比计的：2－甲氧基雌二醇1份、表面活性剂1～50份、冻干保护剂3～30份组成。2－甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉的制备由以下方法实现：1.制备纳米初混悬剂，采用沉淀法或分散法制备；2.制备纳米混悬剂，采用减小粒径的方法包括高压乳匀法和超声粉碎法；3.制备冻干粉；4.使用时，再将冻干粉用注射用水复溶。由本发明制成的供静脉注射用的冻干粉具有良好稳定性，有利于药物的运输和储存。

说明书

一、技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉及其制备方法。

二、背景技术

2-甲氧基雌二醇(1，3，5-三烯-2，3，17β-三羟基-2-甲醚甾醇)是甾体激素类化合物，属于新型激素类抗肿瘤药物，为天然甾体化合物在体内的生理代谢产物，研究表明其具有显著的抗肿瘤活性。其抗肿瘤机制可能是诱导肿瘤和内皮细胞凋亡(Lin H.L.等.Cancer.92(2001)：500-509)，也与抑制新生血管形成和肿瘤细胞生长有关(Barchiesi F.等.Circ.Res.99(2006)：266-274)，研究表明其对多种肿瘤(骨髓瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、宫颈癌等)有明显的抑制作用。文献报道2-甲氧基雌二醇对骨髓瘤细胞的抑制存在着时间依赖性，10μmol/L时作用最强(Dingli D.等.Clin Cancer Res.8(2002)：3948-3954)，这要求2-甲氧基雌二醇在临床使用中达到有效的血药浓度，并能长时间持续一个有效浓度。2-甲氧基雌二醇水溶性差，半衰期短，口服生物利用度低(Ireson CR，Br.J.Cancer 90(2004)：932-937)，且口服吸收无规律，药代动力学表明与服用剂量间缺乏相关性(James J.等，Invest New Drugs，25(2006)：41-48)。目前该药物在国外尚未上市，2-甲氧基雌二醇静脉给药可解决口服制剂的缺点，综合多方面的因素，开展该药物的新剂型研究是必要的。

2-甲氧基雌二醇在水中溶解度只有2μg/ml(Kashappa G.H.等，Eur J Pharm Biopharm.70(2008)：187-198)，属水中难溶性药物，常规单日给药剂量达400mg以上，若使用增溶剂增溶，易引起溶血和过敏反应，并缺乏缓释和靶向性。纳米混悬剂作为新型的纳米药物载体，是利用表面活性剂的稳定作用，将药物颗粒分散在水中，通过粉碎或者控制析晶技术形成稳定的纳米胶态分散体。适合大剂量、难溶性药物的口服和注射给药，可以提高制剂中的药物含量，改善药物的吸收、生物利用度和靶向性。

三、发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的主要目的是提供一种可直接用于静脉注射且制备方便、稳定性好、效果显著的2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉及其制备方法，有效解决了2-甲氧基雌二醇存在的水溶性差、半衰期短、口服生物利用度低、普通注射剂较难达到高载药量和靶向作用的问题，其解决的技术方案为：本发明2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉，是由以重量比计的：2-甲氧基雌二醇1份、表面活性剂1～50份、冻干保护剂3～30份组成。

其中所述的表面活性剂是卵磷脂、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、吐温80(Tween80)、去氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠中的任何一种或任意两种的混合物，任意两种混合物的比例为1∶1-1∶9。

所说的卵磷脂为大豆卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂等。

所述的冻干保护剂为糖类或者多元醇，可为蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇中的任何一种或其任意两种混合物，任意两种混合物的比例为1∶1-1∶9。

2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉的制备由以下方法实现：

1、制备纳米初混悬剂

采用沉淀法或分散法制备，所说的沉淀法是：

(1)将药物2-甲氧基雌二醇或2-甲氧基雌二醇与表面活性剂溶于有机溶剂中，有机溶剂体积比浓度为10-60％(v/v)，当药物含量较高时，可以进行加热溶解(30～40℃)；所选的有机溶剂可以是乙醇、丙酮、甲醇、丙二醇、氯仿、二氯甲烷中的任何一种；

(2)将表面活性剂加入磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温30～40℃加热使其完全溶解为止；

所说的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)为：1L蒸馏水中加氯化钠8.5g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.25g。

(3)磁力搅拌下，将含药物2-甲氧基雌二醇的上述有机溶剂滴加到含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，磁力搅拌后，内切式匀浆机匀浆，10000rpm条件下搅拌1-5min后，旋蒸除有机溶剂，形成初混悬剂；

所说的分散法是：

(1)将药物2-甲氧基雌二醇进行粉碎(微粉化)，粒径越小越好，有利于混悬剂的形成；

(2)将表面活性剂加入磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温30～40℃加热使其完全溶解；

(3)在磁力搅拌下将微粉化后的2-甲氧基雌二醇直接加入到含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，内切式匀浆机搅拌(预乳化)，10000rpm条件下搅拌1-5min，即形成初混悬剂；

2、制备纳米混悬剂

制得的初混悬剂需进一步减小粒径，本发明采用减小粒径的方法包括高压乳匀法和超声粉碎法。

高压乳匀法是：将制得的初混悬剂分别在9k psi和12k psi下循环3-10次，将粒径较大的粒子进行粉碎，然后在18k psi条件下循环10-30次，制得纳米混悬剂，最终平均粒径为300nm左右；

超声粉碎法是：将制得的初混悬剂在200-800W的功率下超声10-40次，超声时间为3-6秒，制得纳米混悬剂，最终平均粒径为200nm左右；

3、制备冻干粉

本发明所述冻干粉的制备步骤如下：将所制得的纳米混悬剂中加入质量浓度为1-10％冻干保护剂预冻，预冻温度为-20或-80℃，预冻时间为2h至12h，冷冻干燥，冻干时间为12h至48h。

4、使用时，再将2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉用注射用水复溶，复溶后2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂的平均粒径在300nm左右，即成供静脉注射用的纳米混悬剂。由本发明制成的供静脉注射用的冻干粉具有良好稳定性，有利于药物的运输和储存。

本发明2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉的制备方法是在表面活性剂的作用下，利用高压乳匀机或者超声粉碎机的高剪切和空化作用，制备得到粒径为100-500nm的纳米混悬剂，通过冷冻干燥制成稳定的固体粉，所得的冻干粉经适量注射用水稀释后可迅速重建成胶态分散体。

本发明2-甲氧基雌二醇纳米混悬剂冻干粉的优点是：(1)本冻干粉以表面活性剂作为稳定剂，制成的冻干粉具有良好的稳定性，提高了临床用药的安全性。(2)本纳米混悬剂冻干粉的药物含量较高，有效地解决了2-甲氧基雌二醇水溶性差，药物含量低的问题。制成的固体制剂具有良好的长期稳定性，有利于药物长期储存和运输。(3)与普通注射剂相比，本纳米混悬剂冻干粉具有较高的肝、肺、乳腺和脾等靶向性。

四、具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明权利范围的限制。

实施例1

称取600mg泊洛沙姆188，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，在磁力搅拌下加入微粉化后的2-甲氧基雌二醇原料药150mg，10000rpm内切式匀浆机预乳化5min，制得初混悬剂；将初混悬剂进行高压乳匀，条件为9k psi循环3次，12k psi循环3次，18k psi循环20次，得到乳白色纳米混悬剂，将1000mg海藻糖溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-80℃预冻10h后冷冻干燥12h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为320nm，Zeta电位-25.68mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力；大鼠体内分布见表2，表明具有明显肝、肺、乳腺和脾靶向性。

实施例2

称取600mg泊洛沙姆188，300mg Tween80，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，在磁力搅拌下加入微粉化后的2-甲氧基雌二醇原料药150mg，10000rpm内切式匀浆机预乳化5min，制得初混悬剂；将初混悬剂进行高压乳匀，条件为9k psi循环3次，12k psi循环3次，18k psi循环20次，得到乳白色纳米混悬剂，将1000mg甘露醇溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-20℃预冻10h后冷冻干燥12h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为290nm，zeta电位为-33.8mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力；大鼠体内分布见表2，表明具有肝、肺、乳腺和脾靶向能力。

实施例3

称取300mg泊洛沙姆407加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，大豆卵磷脂900mg加入8ml的二氯甲烷中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机预乳化5min，将其倒入旋转薄膜蒸发器的圆底烧瓶中，维持水浴温度为40℃，启动真空泵，真空旋转蒸发4h，形成初混悬剂，将初混悬剂进行高压乳匀，条件为9k psi循环3次，12k psi循环3次，18k psi循环20次，得到乳白色纳米混悬剂，将300mg海藻糖和700mg甘露醇溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-80℃预冻4h后冷冻干燥12h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为310nm，zeta电位为-26.54mV。

本实施例产品体外释放见表1，结果表明该制剂具有缓释能力；大鼠体内分布见表2，表明具有明显肝、肺、乳腺和脾靶向能力。

实施例4

称取300mg泊洛沙姆407加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，大豆卵磷脂900mg加入8ml的氯仿中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机预乳化5min，将其倒入旋转薄膜蒸发器的圆底烧瓶中，维持水浴温度为40℃，启动真空泵，真空旋转蒸发4h，形成初混悬剂，将初混悬剂进行高压乳匀，条件为9k psi循环3次，12k psi循环3次，18k psi循环20次，得到乳白色纳米混悬剂，将100mg海藻糖和900mg甘露醇溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-20℃预冻12h后冷冻干燥12h取出，制得冻干粉。将冷干粉用注射用水复溶，平均粒径为300nm，zeta电位为-20.85mV。

本实施例产品体外释放见表1，结果表明该制剂具有缓释能力；大鼠体内分布见表2，表明具有明显肝、肺、乳腺和脾靶向性。

实施例5

称取200mg十二烷基硫酸钠，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，氢化大豆卵磷脂900mg加入8ml的二氯甲烷中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机预乳化5min，将其倒入旋转薄膜蒸发器的圆底烧瓶中，维持水浴温度为40℃，启动真空泵，真空旋转蒸发4h形成初混悬剂，将初混悬剂进行超声粉碎，条件为400W循环30次，探超3s，停6s，得到乳白色纳米混悬剂，将500mg海藻糖和500mg甘露醇溶解在纳米混悬剂中，C0-60灭菌，用西林瓶进行分装，-80℃预冻4h后冷冻干燥24h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为260nm，zeta电位为-25.4mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力；大鼠体内分布见表2，表明具有明显肝、肺、乳腺和脾靶向性。

实施例6

称取羧甲基纤维素钠100mg，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，氢化大豆卵磷脂900mg加入10ml的无水乙醇中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机预乳化5min，将其倒入旋转薄膜蒸发器的圆底烧瓶中，维持水浴温度为40℃，启动真空泵，真空旋转蒸发4h，形成初混悬剂，将初混悬剂进行超声粉碎，条件为400W循环30次，超3s，停6s，得到乳白色纳米混悬剂，将1000mg蔗糖溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-20℃预冻12h后冷冻干燥24h取出，制得冻干粉。将冷干粉用注射用水复溶，平均粒径为220nm，zeta电位为-35.4mV。

本实施例产品体外释放见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。

实施例7

称取100mg吐温80，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，蛋黄卵磷脂600mg加入10ml的氯仿中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机乳化5min，将其倒入旋转薄膜蒸发器的圆底烧瓶中，维持水浴温度为40℃，启动真空泵，真空旋转蒸发4h，形成初混悬剂，将初混悬剂进行超声粉碎，条件为600W循环20次，超3s，停6s，得到乳白色纳米混悬剂，将1000mg葡萄糖溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-20℃预冻12h后冷冻干燥36h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为230nm，zeta电位为-15.4mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。

实施例8

称取100mg去氧胆酸钠加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，蛋黄卵磷脂800mg加入10ml的氯仿中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机乳化5min，形成初混悬剂，将初混悬剂进行超声粉碎，条件为600W循环20次，超3s，停6s，得到乳白色纳米混悬剂，将1000mg乳糖溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-20℃预冻12h后冷冻干燥48h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为240nm，zeta电位为-18.75mV。

实施例9

称取200mg泊洛沙姆188，加入20ml磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)中，微温加热(30～40℃)使其完全溶解，称取2-甲氧基雌二醇原料药200mg，大豆卵磷脂800mg加入10ml的无水乙醇中，微热使完全溶解，在磁力搅拌下将油相滴加到水相中，10000rpm内切式匀浆机乳化5min，形成初混悬剂，将初混悬剂进行超声粉碎，条件为600W循环20次，超3s，停6s，得到乳白色纳米混悬剂，将500mg蔗糖和500mg乳糖溶解在纳米混悬剂中，Co-60灭菌，用西林瓶进行分装，-20℃预冻12h后冷冻干燥48h取出，制得冻干粉。将冻干粉用注射用水复溶，平均粒径为210nm，zeta电位为-20.75mV。

本实施例产品体外释放结果见表1，结果表明该制剂具有缓释能力。

本发明冻干粉用磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)为释放介质，将供试品置于透析袋中，采用中国药典的转篮法进行体外释放研究，结果表明体外释放具有缓释能力，能满足2-甲氧基雌二醇的时间剂量动力学治疗需求。

表1  各实施例体外释放结果(％)

本发明冻干粉用大鼠进行尾静脉给药(10mg/kg)对体内分布进行研究，采用2-甲氧基雌二醇的聚氧乙烯氢化蓖麻油乙醇溶液为对照，用相对摄取率：

$r_e=\frac{{\left(\mathrm{AUCi}\right)}_p}{{\left(\mathrm{AUCi}\right)}_s}$

评价其靶向率(r_e表示样品靶器官药时曲线下面积和对照样品靶器官药时曲线下面积的比值)，结果表明2-甲氧基雌二醇易浓集于肝、肺、脾、乳腺等器官。

表2  各实施例大鼠体内分布靶向性评价

本发明经试验表明是一种适合静脉注射给药，具有一定缓释效果且在体内具有靶向能力的纳米混悬剂冻干粉，该制剂药物含量较高，解决了人们一直渴望解决的2-甲氧基雌二醇大剂量的用药技术问题。其研制成功，是医学上的一大创新，具有广泛的社会效益和经济效益。