夹竹桃多糖提取物的制备方法及多糖提取物的医药用途

摘要

本发明涉及夹竹桃多糖提取物的制备方法以及该多糖提取物在制备抗肿瘤药物方面的用途。夹竹桃鲜叶洗净晾干，烘干粉碎；用乙醇回流除色，取滤渣热水中抽提后取上清液；浓缩上清液离心弃沉淀，将上清液装入透析袋透析进一步去除溶液中的小分子成分得到夹竹桃多糖净提取物；加入乙醇，离心沉淀，该沉淀物依次三次后，冷冻干燥即得本发明所说的夹竹桃粗多糖(NP)提取物粉剂。提取物可作为制备治疗动物和人的肿瘤的药物组合物中的应用，包括该提取物与其它药物、药物载体或赋形剂的组合用于制备治疗动物和人肿瘤性疾病的药物。提取物中分离纯化得到的两种单一成分多糖可以直接抑制人源肿瘤细胞增殖和促进凋亡，说明对肿瘤细胞有直接的杀伤作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种夹竹桃多糖(NP)提取物的制备方法及其医药用途，具体地说，涉及一种夹竹桃多糖(NP)提取物的制备方法以及该多糖提取物在制备抗肿瘤药物方面的用途。

背景技术

夹竹桃(Nerium indicum Mill.)属于夹竹桃科夹竹桃属植物，是我国常见的一种观赏植物。叶及茎皮含大量强心甾，入药煎汤或研末，能强心利尿，定喘镇，试用于心力衰竭，喘息咳嗽，癫痫，跌打损伤肿痛等。也用于制备杀钉螺的农药。

目前关于夹竹桃属植物的抗肿瘤作用有美国专利5135745“extract sof Nerium species，methods of preparation，and use therefore”，描述了一种夹竹桃科植物欧洲夹竹桃(Neriumoleander)提取物的抗肿瘤效果及其制备方法，通过将植物材料煮沸几小时得到的提取物对细胞增殖性疾病有缓解作用，也有报道欧洲夹竹桃中的强心甾可以抑制肿瘤细胞增殖促进肿瘤细胞凋亡。也有报道欧洲夹竹桃(Nerium oleander)提取物可诱导γ-IFN的产生，从而起到抗病毒的效果(中国专利申请号200410058927.7)。而国内外均未见夹竹桃((Nerium indicumMill.)提取物抗肿瘤的研究报道。

植物多糖具有调节机体免疫机能，具有抗病毒、抗菌、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老等多方面的生物活性，因而越来越受到研究者的重视。近年来，大量的研究表明，中药多糖具有抗肿瘤作用，且毒副作用小，因而已成为抗肿瘤研究的热点。香菇多糖、当归多糖、猪苓多糖、云芝多糖等一批质量稳定、疗效确切、毒性和不良反应小的多糖类药物已作为抗肿瘤药物广泛用于临床。

发明内容

本发明的目的在于提供一种夹竹桃((Nerium indicum Mill.)多糖(NP)提取物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供该夹竹桃多糖(NP)提取物在制备治疗人和动物肿瘤性疾病的药品中的应用。

本发明还涉及该夹竹桃多糖(NP)提取物作为制备治疗动物和人的肿瘤的药物组合物中的应用，包括该提取物与其它药物、药物载体或赋形剂的组合用于制备治疗动物和人肿瘤性疾病的药物。

为实现本发明所说的夹竹桃多糖(NP)提取物的提取方法采用以下技术方案：

(1)采集夹竹桃鲜叶，水洗干净，晾干水分，50～65℃烘干，粉碎后过60目筛制成夹竹桃叶粉末。

(2)用70％乙醇在60℃下回流3次，每次3h，去除夹竹桃叶粉末色素和油脂，过滤取滤渣，挥干溶剂。

(3)取挥干溶剂后的滤渣，按滤渣∶水为1∶6～10的体积比例于60～99℃热水中抽提，每次4h，重复抽提3次后，离心或抽滤去渣，取上清液；热水中抽提优选温度是95℃。

(4)采用旋转蒸发器浓缩由步骤(3)得到的上清液至原体积的1/2～1/4，得到浓缩液；浓缩液加10％三氯乙酸至pH＝4.0，4℃冰箱放置24h后以8000r/min离心15min，弃沉淀，再取上清液用0.5mol/L的NaOH液调溶液的pH值至中性，采用sevage法、TCA法、酶法中的一种或者这几种方法联用去除浓缩液中的蛋白，再取上清液。

(5)将去除蛋白的上清液装入透析袋透析3d，其中先流水透析2d，后蒸馏水透析1d，进一步去除溶液中的小分子成分得到夹竹桃多糖净提取物。

(6)在得到的夹竹桃多糖净提取物中加入3倍体积的95％乙醇，在4℃下，静置1d后，以8000r/min离心15min，收集沉淀物，该沉淀物依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤三次后，冷冻干燥即得本发明所说的夹竹桃粗多糖(NP)提取物粉剂。

(7)将夹竹桃粗多糖(NP)提取物粉剂，以100mg加入1ml蒸馏水制成针剂；按照腹腔传代7d生长良好的S180荷瘤小鼠的体重(kg)分三级剂量给药，第一级：50mg/kg，第二级：100mg/kg，第三级：150mg/kg组，每组10只S180荷瘤小鼠，每天腹腔注射给药，连续给药10d后，次日称重；颈椎脱臼处死小鼠，剥离每只鼠肿块，用滤纸吸干肿瘤表面血污后称重，计算抑瘤率。三级剂量给药的抑瘤率分别为第一组40.00％，第二组50.83％第三组44.17％，表明NP对S180肉瘤有显著的抑制作用，其中NP 100mg/kg组的抑瘤效果最好，抑瘤率可达50.83％，说明夹竹桃多糖(NP)提取物在制备治疗人和动物肿瘤性疾病的药品中可以应用。同时夹竹桃多糖(NP)提取物可作为制备治疗动物和人的肿瘤的药物组合物中的应用，包括该提取物与其它药物、药物载体或赋形剂的组合用于制备治疗动物和人肿瘤性疾病的药物。

本发明采用适用于夹竹桃((Nerium indicum Mill.)叶中多糖提取物的提取分离方法，对夹竹桃((Nerium indicum Mill.)叶进行提取分离后得到夹竹桃((Nerium indicum Mill.)多糖提取物，研究表明以该方法获得的提取物对小鼠肉瘤S180有较好的抑制效果，并与临床重要抗肿瘤化疗药物有显著的协同效果；该提取物也可显著延长S180腹水瘤小鼠的寿命。该提取物的抗肿瘤作用可能与其增强机体的免疫功能相关。从该提取物中分离纯化得到的两种单一成分的多糖可以直接抑制人源肿瘤细胞的增殖和促进凋亡，说明该提取物也对肿瘤细胞有直接的杀伤作用。

附图说明

图1是本发明所述的夹竹桃多糖NP3Sephadex G-100凝胶柱层析图。

图2夹竹桃多糖NP4Sephadex G-100凝胶柱层析图；

图3是本发明所述的夹竹桃多糖(NP)提取物的NP3和NP4的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图4是本发明所述的夹竹桃多糖(NP)提取物不同浓度NP4处理K562细胞96h DNA片段化检测结果(M：Maker；A：阴性对照组；B：80μg/mL；C：160μg/mL；D：320μg/mL)。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明作进一步阐述，但并不因此而限制本发明的范围。

实施例1：

采集夹竹桃叶洗净60℃烘干后，粉碎过60目筛，称取200g，用70％乙醇在60℃下回流去色素、脱脂3次，每次3h，残渣50℃烘干；称取烘干后的药材，按照质液比药材∶水＝1∶10在95℃水浴中热水抽提，每次4h，重复抽提3次，抽滤去残渣后得上清液；采用旋转蒸发器浓缩上清液至原体积的1/2，得到浓缩液；浓缩液先用三氯乙酸法去蛋白(多糖浓缩液加10％三氯乙酸至pH＝4.0，4℃冰箱放置24h后以8000r/min离心15min，弃沉淀)，再取上清液用0.5mol/L的NaOH液调溶液的pH值至中性，再加入1/3体积的sevage(氯仿∶正丁醇＝4∶1)，振荡20min后，8000rpm离心15min，去沉淀，重复1次，去掉残余蛋白。上清液装入透析袋(分子量7000-14000D)，流动水透析2d，蒸馏水透析1d，透析液浓缩至1/2体积后按体积比95％乙醇∶多糖液＝3∶1进行醇沉多糖，静置24h(4℃)，以8000r/min离心15min，取沉淀用无水乙醇洗涤数遍，冷冻干燥得夹竹桃粗多糖(NP)7.9g。

实施例2：

按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)腹腔注射对小鼠肉瘤S180的抑制作用。

取腹腔传代7d生长良好的S180荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，无菌条件下抽取腹水；用灭菌的生理盐水稀释，混匀制成肿瘤细胞混悬液(1.0×10⁷/mL)；按0.2mL/只，接种于小鼠右侧腋窝皮下。将接种24h后小鼠随机分为5组：生理盐水阴性对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照组(20mg/kg)、NP的50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg组，每组10只，每天腹腔注射给药，连续给药10d后，次日称重，颈椎脱臼处死小鼠，剥离每只鼠肿块，用滤纸吸干肿瘤表面血污后称重，计算抑瘤率。结果见表1.

抑瘤率(％)＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

表1  NP对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用(x±s，n＝10)

与阴性对照组比较：^*P＜0.01；与CTX组对照组比较：^#P＜0.05

NP各组给药后的荷瘤小鼠毛发有光泽，活动和进食正常；阴性对照组荷瘤小鼠毛发干枯、蓬松，微微发黄，行动迟缓；CTX组荷瘤小鼠毛发颜色和活动情况不如NP组但比阴性对照组要好，体重明显减轻，进食量有所减少。阴性对照组瘤块大、界限不清、质地较软、难以剥离，有的甚至浸润至胸骨、锁骨及腋窝后侧等处；NP各组和CTX组瘤体较小、界限清晰、质地较硬、容易剥离。由表1可见NP 50、100、150mg/kg组的瘤重与生理盐水阴性对照组相比较，均有非常显著性差异(P＜0.01)，其中100mg/kg NP组与CTX组比较有显著性差异(P＜0.05)。NP 50、100、150mg/kg组的抑瘤率分别为40.00％、50.83％、44.17％，表明NP对S180肉瘤有显著的抑制作用，其中NP 100mg/kg组的抑瘤效果最好，抑瘤率可达50.83％，NP对S180肉瘤的抑制似乎不呈剂量依赖关系。

实施例3：

按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)尾静脉注射对S180腹水瘤小鼠生命延长率的影响。

腹腔接种S180肿瘤细胞，每只小鼠注射S180肿瘤细胞1.0×10⁶个，将接种24h后的小鼠随机分为5组，每组10只，24h后处理组注射NP，分别为50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg组，阴性对照组注射等量生理盐水，阳性对照组注射20mg/kg的CTX，连续给药10d，尾静脉给药。以给药当天为第1天记录小鼠生存时间，计算荷瘤小鼠生命延长率。结果见表2.

生命延长率(％)＝(给药组平均的生存时间/对照组平均的生存时间-1)×100％

表2NP对腹水瘤小鼠生命延长率的影响(x±s，n＝10)

与阴性对照组比较：^*P＜0.01

实施例4：

剥取实施例2中各组荷瘤鼠的瘤组织后，迅速在10％中性甲醛溶液固定后，24h内进行常规脱水、透蜡、包埋，所得蜡块连续切片，采用免疫组化法检测瘤组织PCNA、Bcl-2和Bax蛋白的表达。

(1)染色过程主要如下：石蜡切片经常规脱蜡和水化后，PBS(pH＝7.4)冲洗3min×3次，根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复(Bcl-2和Bax采用微波抗原修复，PCNA采用高压抗原修复)，取出于室温下冷却，蒸馏水冲洗3min×2次，PBS洗2min×2次，每张切片滴加50μL过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10min，PBS洗3min×3次，除去PBS液，加50μL正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10min，除去血清滴加第一抗体，室温下孵育60min，PBS洗5min×3次，除去PBS液，滴加50μL生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10min，PBS洗3min×3次，除去PBS液，滴加50μL生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10min，PBS洗3min×3次，除去PBS液，加新鲜配置DAB溶液，显微镜下观察3-10min，自来水冲洗，苏木素复染，0.1％HCl分化，PBS冲洗返蓝，经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

(2)结果判断：PCNA阳性染色位于细胞核，Bcl-2阳性染色位于细胞浆，Bax阳性染色位于细胞浆。阳性细胞染色为棕黄色或棕褐色。每个标本低倍镜(×100)下观察，随机选择5个视野；高倍镜(×400)下每个视野选取200个肿瘤细胞，计数1000个细胞的阳性细胞数，以百分数表示，计算肉瘤组织中表达PCNA、Bcl-2和Bax的细胞阳性率。

由表3可看出NP 50、100、150mg/kg组与阴性对照组相比，给药后肉瘤组织中PCNA细胞的阳性率明显降低，经统计学处理差异非常显著(P＜0.01)；Bcl-2细胞的阳性率明显降低，经统计学处理差异非常显著(P＜0.01)；Bax细胞的阳性率明显升高，经统计学处理差异非常显著(P＜0.01)，其中100mg/kg NP组与CTX组比较差异非常显著(P＜0.01)。说明了NP能显著抑制S180肉瘤细胞PCNA、Bcl-2蛋白的表达并且同时促进了Bax蛋白的表达。

表3各实验组PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的表达结果(x±s，n＝10)

与阴性对照组比较：^*P＜0.01；与CTX组对照组比较：^#P＜0.01

实施例5：夹竹桃多糖(NP)与环磷酰胺(CTX)联用对S180皮下移植肉瘤的抑制作用

按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)，接瘤方法与实施例2相同，将接种24h后的小鼠随机分为6组：生理盐水阴性对照组、CTX单用治疗组1给予CTX 10mg/kg、CTX单用治疗组2给予CTX 20mg/kg、NP单用组给予NP 100mg/kg、NP联合CTX治疗组1给予NP 100mg/kg+CTX 10mg/kg、NP联合CTX治疗组2给予NP 100mg/kg+CTX 20mg/kg，每组10只，NP腹腔注射给药，CTX尾静脉给药，每只小鼠每天给药，连续给药10d。末次给药后24h颈椎脱臼处死荷瘤小鼠，剥取瘤块并用吸水纸吸净瘤块表面血污后称重。比较单纯用CTX治疗组与加用NP联合治疗组间抑瘤率的差异，观察NP与CTX联用对S180皮下移植性肉瘤的抑制作用效果。NP与CTX联用的药物联合作用评价，通过以药物相互作用指数(CDI)为评价标准对NP与环磷酰胺(CTX)联合应用治疗S180小鼠肉瘤的效果进行药物联合作用评价。

抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-实验组平均瘤重)g/对照组平均瘤重g×100％

药物相互作用指数(CDI)的计算公式为：CDI＝AB/(A×B)在本实验中，AB为两联用组与生理盐水对照组瘤重的比值，A或B是各药单独用药组与生理盐水对照组瘤重的比值。当CDI＜1时，表示两药联用具有协同作用；当CDI＜0.7时，表示两药联用的协同作用非常显著。

由表4所示各用药组的瘤重与阴性对照组比较差异均非常显著(P＜0.01＝，抑瘤效果明显，抑瘤率均＞30％。其中CTX 10mg/kg组抑瘤率为31.85％，抑瘤效果明显，与NP 100mg/kg组联用抑瘤率达到62.22％，CDI＝0.95，表示此两种剂量药物联用具有协同作用。CTX 20mg/kg组抑瘤率为40.00％，与NP 100mg/kg组联用抑瘤率达63.70％，可增强CTX 20mg/kg组的抑瘤作用，CDI＝1.10＞1.0表示此两种剂量药物联用不具有协同作用。表明NP 100mg/kg与CTX10mg/kg组联用具有协同作用。

表4NP与CTX联用对S180裸鼠皮下移植瘤的协同抑制效果(x±s，n＝10)

与阴性对照组比较：^*P＜0.01

实施例6：夹竹桃多糖(NP)对小鼠巨噬细胞碳廓清能力和免疫器官指数的影响

将正常实验小鼠随机分成4组，每组10只，分别为生理盐水阴性对照组，NP 50、100、150mg/kg组，连续8d腹腔注射按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)，末次给药24h后，称其体重，按每10g体重0.1mL的剂量尾静脉注射给予小鼠墨汁(无菌生理盐水稀释5倍的印度墨水)，立即计时，于注入墨汁后2min、10min分别从眼眶静脉丛取血30μL，并立即将其加入到3mL浓度为0.1％的Na₂CO₃溶液中，以0.1％的Na₂CO₃溶液作空白对照，用分光光度计在600nm波长测定吸光度值(A)。然后颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏、胸腺和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。按下式计算吞噬指数a、碳廓清指数K、脾脏指数、胸腺指数。

吞噬指数a＝体重/(肝重+脾重)×K^1/3   碳廓清指数K＝(LgA₁-LgA₂)/(t₂-t₁)

脾脏指数(％)＝脾脏重量mg/动物体重g×100％

胸腺指数(％)＝胸腺重量mg/动物体重g×100％

公式中a：吞噬指数，反映每单位组织重量的吞噬活性；K：廓清指数，表示吞噬速率；A₁：t₁时的吸光度值；A₂：t₂时的吸光度值；t₁：给墨汁后第1次取血的时间；t₂：给墨汁后第2次取血的时间。

由表可看出NP 100、150mg/kg组的碳廓清指数和吞噬指数与阴性对照组比较差异非常显著(P＜0.01)，50mg/kg组的吞噬指数与阴性对照组比较差异显著(P＜0.05)，表明NP能显著增强巨噬细胞的吞噬功能，显著提高碳廓清率。其中NP 100mg/kg剂量组的碳廓清指数和吞噬指数最为突出，可见NP对小鼠巨噬细胞的吞噬能力不呈剂量依赖关系。

由表5可看出NP 50、100、150mg/kg组的胸腺指数和脾脏指数与阴性对照组比较差异显著或非常显著(P＜0.05或P＜0.01)，表明NP能显著增加小鼠的脏器指数。其中NP 100mg/kg剂量组的胸腺指数和脾脏指数最为突出。

表5 NP对小鼠巨噬细胞碳廓清能力的影响(x±s，n＝10)

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例7：夹竹桃多糖(NP)对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响

1.鸡红细胞悬液制备

用配好的肝素润湿注射器针管，然后抽取活鸡血，立即置人盛有5倍于取血量的1％肝素抗凝剂的三角烧瓶中，混匀，4℃冰箱内保存。使用前，以无菌生理盐水离心洗涤3次，前1次离心速度为150O rpm，离心5min，弃上清液和界面粒细胞层，最后连续离心2次(2000rpm5min)，根据压积用生理盐水配成5％鸡红细胞悬液备用。

2.小鼠分组及给药

将实验小鼠随机分成4组，每组10只，分别为生理盐水阴性对照组，NP 50、100、150mg/kg组，连续8d腹腔注射按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)，于停药后第2天每只小鼠腹腔注射6％的淀粉肉汤(0.3g牛肉膏、1.0g蛋白胨、0.5g氯化钠、6.0g可溶性淀粉溶在100mL蒸馏水中，煮沸灭菌，置4℃冰箱中保存备用)，每只鼠1mL，48h后腹腔注射鸡红细胞悬液每只鼠1mL，1h后再向腹腔注射0.9％的生理盐水1mL稍揉其腹部，颈椎脱臼处死小鼠，每只鼠取腹腔液涂片，冷风吹干，甲醇固定5min，姬姆萨染液染色10min，冲洗，晾干，高倍镜(×400)观察，计数100个吞噬细胞，按下列公式计算吞噬率及吞噬指数：

吞噬率(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100个巨噬细胞×100％

吞噬指数＝100个巨噬细胞所吞噬鸡红细胞数的总和/100

由表6可看出NP 50、100、150mg/kg组的吞噬百分率和吞噬指数与阴性对照组比较差异非常显著(P＜0.01)，表明NP能显著增强腹腔巨噬细胞吞噬活性。其中NP 100mg/kg组的吞噬百分率和吞噬指数最为突出。

表6 NP对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响(x±s，n＝10)

与阴性对照组比较^*P＜0.01

实施例8：夹竹桃多糖(NP)对ConA诱导的正常小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖反应

将实验小鼠随机分成4组，每组5只，分别为生理盐水阴性对照组，NP 50、100、150mg/kg组，连续8d腹腔注射按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)，末次给药后4h小鼠以颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡5min，无菌取脾，剪碎，加入无血清RPMI-1640培养基5mL，用研磨棒研磨，过200目不锈钢细胞筛，吸取研磨后的上清于试管内，1500rpm离心5min，弃上清液后加入0.83％Tris-NH₄Cl 5mL，静置5min，以使红细胞完全破坏，1500rpm离心5min，弃上清液后用无血清RPMI-1640培养液洗涤细胞2次，再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液制成1×10⁶/mL脾淋巴细胞悬液，加入96孔培养板，每孔180μL，每组4个复孔，每孔加入ConA 20μL至终浓度为5μg/mL，置5％CO₂培养箱37℃培养48h，加入MTT 20μL，放置5％CO₂培养箱37℃反应4h，轻轻吸出上清液，每孔加入二甲亚砜150μL，于振荡器上振荡30s，酶标仪595nm处读取A值，按以下公式计算细胞增殖率(另设4个只加培养液的调零孔)。

细胞增殖率(％)＝供试品组平均吸光度值/对照组平均吸光度值×100％

由表7可看出在NP对ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应中NP 50、100、150mg/kg组在595nm的吸光度值与阴性对照组比较差异非常显著(P＜0.01)，各组的淋巴细胞增殖率分别为130％、174％、139％，说明NP能明显提高ConA诱导的小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖能力，其中NP 100mg/kg剂量组的吸光度值和淋巴细胞增殖率最为突出。

表7 NP对小鼠脾脏T淋巴细胞增殖反应的影响(x±s，n＝5)

与阴性对照组比较^*P＜0.01

实施例9：夹竹桃多糖(NP)对LPS诱导的正常小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖反应

将实验小鼠随机分成4组，每组5只，分别为生理盐水阴性对照组，NP 50、100、150mg/kg组，连续8d腹腔注射按实施例1所述方法提取的夹竹桃多糖提取物(NP)，末次给药后4h小鼠以颈椎脱臼处死，75％乙醇浸泡5min，无菌取脾，剪碎，加入无血清RPMI-1640培养基5mL，用研磨棒研磨，过200目不锈钢细胞筛，吸取研磨后的上清于试管内，1500rpm离心5min，弃上清液后加入0.83％Tris-NH₄Cl 5mL，静置5min，以使红细胞完全破坏，1500rpm离心5min，弃上清液后用无血清RPMI-1640培养液洗涤细胞2次，再以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液制成1×10⁶/mL脾淋巴细胞悬液，加入96孔培养板，每孔180μL，每组4个复孔，每孔加入LPS 20μL至终浓度10μg/mL，置5％CO₂培养箱37℃培养48h，加入MTT 20μL，放置5％CO₂培养箱37℃反应4h，轻轻吸出上清液，每孔加入二甲亚砜150μL，于振荡器上振荡30s，酶标仪595nm处读取A值，按以下公式计算细胞增殖率(另设4个只加培养液的调零孔)。

细胞增殖率(％)＝供试品组平均吸光度值/对照组平均吸光度值×100％

由表8可看出在NP对LPS诱导的小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应中NP 50、100、150mg/kg组在595nm的吸光度值与阴性对照组比较差异非常显著(P＜0.01)，各组的淋巴细胞增殖率分别为150％、199％、142％，说明NP能明显提高LPS诱导的小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖能力。其中NP 100mg/kg剂量组的吸光度值和淋巴细胞增殖率最为突出。

表8NP对小鼠脾脏B淋巴细胞增殖反应的影响(x±s，n＝5)

与阴性对照组比较^*P＜0.01

实施例10：夹竹桃多糖的纯化

采用DEAE-SephadexA-25离子交换柱和葡聚糖Sephadex G-100凝胶柱来进一步纯化实施例1得到的夹竹桃多糖。采用下列步骤对分离胶进行预处理。

(1)DEAE-SephadexA-25离子交换柱的预处理：25g DEAE-SephadexA-25用蒸馏水充分溶胀，用0.5mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性，用0.5mol/L NaOH浸泡30min，水洗至中性，再用0.5mol/L HCl浸泡30min，水洗至中性，得C1-型DEAE-SephadexA-25，然后加蒸馏水浸泡备用。

(2)葡聚糖Sephadex G-100的预处理：加入适量(略大于吸水率)蒸馏水，加热煮沸1h，去除凝胶颗粒中的气泡。

多糖纯化步骤

(1)DEAE-SephadexA-25装柱：湿法装柱(1.6cm×50cm)，柱子垂直安装好，取蒸馏水当缓冲液倒入柱内1/3处，然后将脱气后的离子吸附剂用玻璃棒沿壁小心地缓慢倒入柱内。

(2)平衡：待离子吸附剂沉降后打开螺旋夹，用3-5倍的蒸馏水作为缓冲液来平衡层析柱，使凝胶柱的凝胶分布、膨胀度、离子分布等达到一个均衡状态。

(3)上样：加样前，在平衡好的离子交换柱表面放一片干净的滤纸。取50mg粗多糖，配成10mg/mL溶液，过滤后，沿柱壁缓慢加入，注入洗脱液开始洗脱。

(4)洗脱：分别用蒸馏水、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0mol/L NaCl分段梯度洗脱，流速2min/mL，自动收集器收集流份，每管5mL。

(5)收集：用苯酚-硫酸法跟踪检测糖液，合并洗脱液多糖阳性高峰部分。

(6)浓缩、透析、干燥：浓缩洗脱液，在蒸馏水中透析48h，用少量AgNO₃溶液检验无氯离子存在后，冷冻干燥得N1，N2两个组分。

(7)取N1，N2各50mg，分别配成10mg/mL溶液，过滤去渣后，过Sephadex G-100柱子，蒸馏水洗脱，流速2min/mL，自动收集器收集流份，每管5mL，苯酚-硫酸法跟踪检测糖峰的含量，合并洗脱液多糖阳性高峰部分，浓缩、冷冻干燥得夹竹桃纯多糖NP3和NP4。经SephadexG-100柱层析(图1，2)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(图3)纯度鉴定，证实NP3和NP4为分子量均一的多糖。

实施例11：MTT法测定NP3和NP4抑制K562细胞的增殖作用

人白血病细胞株K562，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，置37℃，含5％CO₂，饱和湿度的培养箱中培养，2-3天换液传代1次。实验用处于对数生长期的细胞。将K562细胞密度调整为1×10⁵/mL，接种于96孔培养板，每孔180μL，然后每孔分别加入不同浓度的NP3和NP4(用无血清RPMI-1640培养液配制)20μL，使多糖终浓度分别为640μg/mL、320μg/mL、160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL，阴性对照组加入等体积的无血清培养液，设空白对照组(不加细胞而只加培养基)，每组设4个平行孔，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养、孵育48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续孵育4h后，小心吸去上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，置酶标仪上测定490nm和630nm双波长处吸光度(A)，实验重复3次，取平均值，以药物浓度对细胞增值抑制率的对数值作直线回归，计算IC₅₀值。

细胞增殖抑制率(％)＝(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

IC₅₀＝lg-1[Xm-i(∑p-0.5)其中Xm：设计的最大浓度的对数值；i：各浓度倍比数的对数值；∑p：各组生长抑制率之和；0.5：经验常数。

不同浓度的NP3、NP4作用K562细胞48h后，K562细胞的生长均受到不同程度的抑制，并且随着药物浓度的升高抑制作用逐渐加强，均呈现明显的量效关系，NP3作用K562细胞48h的IC₅₀为131.21μg/mL，NP4作用K562细胞48h的IC₅₀为113.88μg/mL，结果见表9，10。

表9不同浓度的NP3作用K562细胞48h后MTT检测结果(x±s)

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

表10不同浓度的NP4作用K562细胞48h后MTT检测结果(x±s)

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例12：细胞集落形成试验检测NP3和NP4对K562细胞集落形成的影响

培养体系的总体积为1mL，RPMI-1640培养液含10％的胎牛血清和0.8％的甲基纤维素，实验组多糖的终浓度分别为120μg/mL、80μg/mL、40μg/mL，阴性对照组加无血清等量的无血清RPMI-1640，K562细胞终浓度为3×10²/mL，种于24孔板，每组设3个平行孔。培养第11d，计数集落数目(大于或等于20个细胞组成的细胞群为一个集落)，计算集落形成抑制率。实验重复3次。

集落形成抑制率(％)＝(1-实验组集落数/对数组集落数)×100％

NP3、NP4处理组与阴性对照组相比集落数差异显著或非常显著(P＜0.05或P＜0.01)。随着NP3、NP4浓度的增加，K562细胞集落形成抑制率均明显上升，NP3的抑制率依次为20.9％、48.9％、88.1％，NP4的抑制率依次为24.5％、54.9％、90.8％，并且药物处理组与阴性对照组相比，集落明显小的多，且胞内颗粒增多变大，见表11，12。

表11不同浓度的NP3对K562细胞集落形成的影响(x±s)

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

表12不同浓度的NP4对K562细胞集落形成的影响(x±s)

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

实施例13：N4对K562细胞诱导凋亡的检测

采用DNA片段化方法检测，简要步骤如下：

(1)取阴性对照组与NP4终浓度分别为80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL处理96h的K562细胞(10⁷个细胞左右)；

(2)PBS洗涤2次，加入50μL细胞裂解液充分裂解；

(3)12000rpm离心5min，吸上清于另一EP管；

(4)加入SDS(终浓度为1％)、RnaseA(终浓度为1μg/μL)，置56℃孵育120min；

(5)再加入蛋白酶K(终浓度为2.5μg/μL)，37℃作用120min；

(6)加入1/10体积的10M乙酸铵，2.5体积无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜；

(7)12000rpm离心5min，弃上清；

(8)提取的DNA风干后，溶于20μLTE缓冲液；

(9)经10g/L琼脂糖凝胶电泳，35V，3～4h后用0.5μg/mL溴化乙锭染色30min；

(10)紫外灯下观察，用凝胶图象分析仪摄取并分析结果。

NP4处理K562细胞96h后，320μg/mL、160μg/mL处理组均出现明显凋亡特征的DNA改变，即呈典型的DNA降解“梯状”条带片段，并且随着作用药物浓度的升高凋亡梯状条带更加明显，80μg/mL组现象不明显，而阴性对照组NP4处理组未出现DNA片段化现象(图4)。