一种道地药材研究模型的构建方法及其用途

摘要

本发明涉及一种用于道地药材研究模型，尤其是毛状根模型的构建方法及其用途，为道地药材生物学成因的研究提供实验平台。以道地丹参为例，其特征在于包括比较毛状根和其原药材之间的相似性、确认毛状根核DNA的稳定性、确定rol基因的遗传稳定性和化学成分的稳定性。还包括模拟环境因子，即通过改变毛状根培养条件研究其生长量和有效成分含量的变化，确定环境条件下的表型变异；模拟遗传因子，即通过改变毛状根的遗传物质，或利用不同基因型丹参的毛状根研究其生长状况和有效成分含量的变化，确定表型变异的遗传机制。该模型具备相似性、可重复性、开放性、易用性、定量和定性相结合等特征，可以进行道地丹参生物学特征的研究。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于道地药材研究的毛状根模型构建方法及其用途。

背景技术

作为中医药的精髓，药材的道地性既有来源于历史和文化的属性，又涉及到遗传、环境及生产实践等方面。从生物学上说“道地药材”的形成是基因型与环境之间相互作用的产物，可用公式表示：表型＝基因型+环境饰变。道地性首先表现在道地药材具有独特的表型特征上，其中有效成分含量及疗效等方面是确定道地药材和非道地药材之间的重要鉴别特征之一，这既是建立道地药材鉴别和质量评价标准的关键，也是道地药材生物学本质研究的基础。另外，道地药材成因研究还包括基因型研究、环境机制研究、基因与环境间的相互作用等方面(黄璐琦，陈美兰，肖培根，中药材道地性研究的现代生物学基础及模式假说，中国中药杂志，2004，29(6)：494-496，610)。道地药材是一个复杂系统，由于其形成的每一个影响因素及其相互作用不可能被同时考察，因而至今缺少直接和系统实验研究，寻找适合道地药材研究的载体已成为其生物学研究的关键。对道地药材研究对象的选择要考虑几个因素，即该药材需为常用中药材，道地特征明显；该药材的药理活性、有效成分及其生物合成代谢较为清楚；该药材在实验室内易于获得可控的实验材料。丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎是常用中药，主要用于祛瘀止痛、活血调经、养心除烦等，对冠心病、心血管病常服疗效很好，对慢性肝炎、早期肝硬化等疾病具有良好效果。其有效成分主要分为两类物质，一类是水溶性物质，如丹酚酸B，另一类是二萜类脂溶性物质，如丹参酮II_A，其生物合成途径较为清晰。目前丹参毛状根培养系统(邱德有，宋经元，马小军，丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究，分子植物育种，2004，2(5)：699-703)、基因遗传转化系统等相关技术已经成熟。由此可见，丹参可以作为一种载体用于研究道地药材的成因。

近年来，人们已经认识到，环境影响道地性的研究应是在能够人工控制的实验地进行，可以模拟一种或一种以上的影响道地药材存活及品质的关键环境因子，可以设置一系列的梯度用于研究道地药材在这些环境条件下的表型变异趋势。同时还可以以道地药材表型与生境及基因型的相互关系为切入点，采用对比试验，深入研究道地药材对环境的感受、传递和信号转导机制，研究道地药材基因的功能、表达的调控机制，从而最大限度地挖掘道地药材自身的生物学潜力(黄璐琦，郭兰萍，华国栋，道地药材属性及研究对策，中国中医药信息杂志，2007，14(2)：44-46)。科学模型因其具有简化复杂研究对象的特点，引起了道地药材研究者的关注，构建道地药材研究模型，成为道地药材生物学研究的关键。选择何种生物材料构建模型，主要是根据研究的目的、取材的方便、实验方法的可行、生物周期的长短、遗传背景情况、是否具有遗传改造和表型分析手段、是否有利于国际同行的交流等因素而决定的。毛状根培养是80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项新技术，目前已建立了众多药用植物毛状根培养体系，可以用于生产有效成分，或作为基因工程的载体用于诱导转基因植株。毛状根作为一种有效的长期保持物种优良性状的方式，越来越多的被人们作为实验材料，其具有生长速度快，且不受气候、病虫害、地理和季节的限制等特点(杜旻，吴晓俊，王峥涛，发根农杆菌介导的药用植物遗传转化研究进展，药物生物技术，2005，12(3)：193)。毛状根还可以作为研究有效成分与调控的工具之一，是一种用于进行受控实验的良好材料，但针对道地药材建立研究模型尚无报道。

作为科学模型须具备以下几个特征：①相似性，即对研究主体的各方面要素基本相应；②可重复性；③定量和定性相结合；④开放性，即模型不是孤立的、排它的，而是在不断吸收先进技术和理论的过程中交换和发展；⑤累积性，即模型有积累知识的能力，其造模方案、数据信息可以实现重复累积；⑥特异性或专门性，即一种模型表述的是特定范围的现象或过程；⑦易用性，即易于建立和使用，也易于被他人所理解。本发明人根据道地药材生物学研究的要求，选择丹参作为模式植物，建立道地药材毛状根研究模型，从植物化学、分子生物学、药理学等许多层面对该模型进行了系统评价，所建用于道地药材研究的毛状根模型再现性好、稳定性高、具有较强实用性，为进一步研究道地药材遗传、环境影响因子以及二者的相互作用奠定了重要基础。

发明内容

本发明涉及一种用于道地药材研究的毛状根模型构建方法，以道地丹参为例，其特征在于包括下列步骤：

1.比较毛状根和其原药材之间的相似性，包括①选取药典中的指标成分丹参酮II_A和丹酚酸B，对毛状根和药材进行含量测定，丹参酮II_A含量差值不超过0.05％，丹酚酸B含量差值不超过2％。同时用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行相似度分析，对毛状根与药材的指纹图谱也进行了比较，相似度在0.9以上。②丹参毛状根最大无毒剂量超过人临床用药量的100倍。③从整体、器官以及细胞三个水平上观察丹参毛状根对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，与药材无差异。

2.随机选取不少于5个批次的毛状根材料，利用流式细胞术方法确认毛状根核DNA的稳定性，核DNA含量的RSD小于7％。

3.随机选取不少于10个批次的毛状根材料，利用PCR扩增法确定rol基因的遗传稳定性，不同批次毛状根中均可检测到rol基因；同时对其化学成分的稳定性进行了分析，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行相似度分析，不同批次毛状根指纹图谱的相似度在0.95以上。

4.模拟环境因子，即通过改变毛状根培养条件，如温度、光照、矿质营养水平、pH、模拟逆境、激素信号诱导等研究其生长量和有效成分含量的变化，确定环境条件下的表型变异。

5.模拟遗传因子，即通过改变毛状根的遗传物质，如转基因、化学诱变，或利用不同基因型丹参的毛状根研究其生长状况和有效成分含量的变化，确定表型变异的遗传机制。

该模型具备相似性、可重复性、开放性、易用性、定量和定性相结合等特征，可以进行道地丹参生物学特征的研究，包括以下内容：①研究道地丹参生物学特征的环境影响因子；②研究基因型对道地丹参形成的影响；③研究道地丹参形成中功能基因的作用；④研究道地丹参形成中环境与遗传因子的相互作用等。

附图说明

图1丹参毛状根丹参酮II_A的HPLC图。A.对照品；B.样品；1.丹参酮II_A

图2丹参毛状根丹酚酸B的HPLC图。A.对照品；B.样品；1.丹酚酸B

图3丹参毛状根和丹参药材的指纹图谱比较。S1.丹参毛状根；S2.河北丹参；S3.中江丹参。

图4流式细胞柱状图。G.大豆细胞峰；S.丹参毛状根细胞峰。

图5丹参毛状根rolA基因片段的PCR检测。M.2000bp DNA marker；1-10.10个批次的丹参毛状根；11.丹参组培苗根(阴性对照)。

图610个批次丹参毛状根指纹图谱

具体实施方式

实施例1模型的建立

试验材料：由发根农杆菌菌株Agrobacterium rhizogenes 15834诱导的丹参叶片形成的毛状根继代于6，7-V培养基上。每6周收获一次，为一个批次。收获不同批次的丹参毛状根，于室温干燥。丹参药材分别购于河北灵寿县和购于四川中江县。

1.丹参毛状根与丹参药材有效成分含量的比较

按2005年版药典一部丹参项下方法测定其丹参酮II_A和丹酚酸B的含量。结果显示丹参药材中丹参酮II_A含量为0.12％，丹酚酸B含量为5.4％；各个批次的毛状根丹参酮II_A的含量在0.08％～0.10％之间，平均值与药材相比较低含量差值不超过0.05％；丹酚酸B的含量在4.21％～6.25％，平均值与药材相比含量差值不超过2％(图1，2)。

2.丹参毛状根与丹参药材指纹图谱比较研究

精密称取丹参毛状根，河北丹参药材、四川中江丹参药材样品，各0.15g，精密加入75％甲醇25mL，称定重量，加热同流1h，取出，放冷，再称定重量，用75％甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。色谱条件：Zorbax Extend C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)色谱柱；柱温：20℃；流速：0.8mL·min^-1；流动相：乙腈-磷酸水梯度洗脱；检测波长为280nm，进样体积10uL。记录指纹图谱，利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A处理，见图3，三个样品的指纹图谱的相似度均高于0.9，符合国家药典委员会谱相似度评价系统》2004A处理，见图3，三个样品的指纹图谱的相似度均高于0.9，符合国家药典委员会对“成品指纹图谱相似度计算结果在0.9～1.0(或以90～100表示)之间作为符合要求”的范围，说明丹参毛状根的化学成分组成与2个产地的丹参药材相比差异不显著。

3.丹参毛状根的急性毒性研究

称取530g毛状根粉末，75％的乙醇回流提取，减压回收，所得浸膏247.08g，按药典方法检测丹酚酸B含量5.0％，丹参酮II_A含量为0.06％。根据预试验结果，测定丹参毛状根提取物单次灌胃给药对小鼠的半数死亡量(LD₅₀)。动物(昆明小鼠70只，♀各半，体重19～21g，SPF级，购自中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心，许可证编号：SCXK(京)2002-0006)按体重随机分为对照组及相应梯度剂量组。LD₅₀以Bliss法计算，丹参毛状根提取物LD₅₀为63.94g生药/kg，按公斤体重计算相当于成人日摄入量(丹参临床人用剂量为9～15g/日，0.25g生药/kg)的255.76倍。结果表明，丹参毛状根在急毒试验中最大无毒剂量已超过人临床用药量的100倍。

4.丹参毛状根与丹参药材提取物对大鼠冠脉结扎致心肌缺血的实验研究

Wistar雄性大鼠(体重220～260g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK-(军)2002-001)，55只，220～260g，清洁级，每组11只，适应饲养1周。按体重分为：①模型对照组：灌胃蒸馏水，1mL/100g体重，②丹参药材组(DY)：2.8g生药/kg体重。③丹参毛状根小剂量组(HS)：1.4g生药/kg体重。④丹参毛状根中剂量组(HM)：2.8g生药/kg体重。⑤丹参毛状根大剂量组(HL)：5.6g生药/kg体重。每日灌胃1次，1mL/100g体重，连续7d。丹参药材浸膏：称取600g丹参药材粉末，75％的乙醇回流提取，减压回收，所得319.14g浸膏，按药典方法检测丹酚酸B含量5.4％，丹参酮II_A含量为0.12％。

各组大鼠灌胃给药7d，末次给药后1h，用乌拉坦(1.2g·kg^-1ip)麻醉，稳定5min，切开气管，接DH-140B动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器厂)进行人工呼吸，呼吸频率45～50次/min，暴露左颈总动脉，插动脉套管以监测血压。四肢皮下插电极，记录导联心电图(ECG)，同步记录于MP-100型多导生理记录仪(美国Biopac公司)。于胸骨左缘3～4肋间隙打开胸腔及心包膜，使心脏暴露于胸腔外；在肺动脉圆锥左缘，左心耳跟部下缘1～2mm处，用5/0无损伤缝合针结扎冠状动脉左前降支，然后立即将心脏放回胸腔。实验结束后，腹主动脉采血，离心分离血清。

实验结果采用SPSS13.0统计软件，所有实验数据用x±s表示，室速(VT)，室颤(VF)发生率(％)比较使用费歇尔精确卡方检验，酶学指标用单因素方差分析。研究结果表明HS组能降低VT发生率，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)；DY，HL组能降低VF的发生率，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。丹参毛状根与丹参药材相比无显著性差异。HM，HL组能降低LDH含量，与模型组相比有显著差异(P＜0.05)；HL，DY组能使MDA含量降低，与模型组相比有显著差异(P＜0.01，P＜0.05)；DY和毛状根组3个剂量组都能提高SOD活性，与模型组相比差异显著(P＜0.01)，其中HL效果最明显(P＜0.001)；毛状根与丹参药材比差异不显著。

5丹参毛状根与丹参药材提取物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用研究

实验动物采用Wistar大鼠，雌雄各半，体重250～300g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK-(军)2002-001。随机分为5组，模型组、丹参药材组、毛状根大、中、小剂量组，每组8只；①模型组(单纯缺血再灌组，Ischemic/reperfusion，I/R)；②丹参药材组(DY，生药浓度为56.00μg·mL^-1)；③丹参毛状根小剂量组(HS，生药浓度为14μg·mL^-1)；④丹参毛状根中剂量组(HM，生药浓度为28μg·mL^-1)；⑤丹参毛状根大剂量组(HL，生药浓度为56μg·mL^-1)。

制备离体心脏，实验模型采用心脏自然灌流平衡15min后，即可进行造模。本实验采用全心缺血即停灌缺血再灌注损伤导致心律失常。模型组：平衡15min→正常灌流10min→停灌30min→再灌30min；给药组：平衡15min→正常灌流10min，同时给药10min→停灌30min→再灌30min。

实验数据应用SPSS13.0统计软件，所有计量数据以x±s表示；VT，VF的发生率比较使用费歇尔精确卡方检验。实验结果显示丹参毛状根大剂量组明显降低离体心脏缺血再灌注所致VT，VF发生率，中、小剂量组和丹参药材组没有显著影响。HL组使VT，VF的持续时间和恢复时间缩短，与I/R组相比，有显著性差异(P＜0.05)；丹参毛状根中、小剂量组和丹参药材组对其没有显著性差异。HL组能降低LDH含量，与I/R组有显著差异(P＜0.05)；HM组，HS组，DY组能使MDA含量降低，与I/R组有显著差异(P＜0.01，P＜0.001，P＜0.05)；DY组和HS组能提高SOD活性，与I/R组有显著差异(P＜0.05)；毛状根组与丹参药材比差异不显著。HS组在10min后使再灌注期内的冠脉流量明显增加，与I/R组比有显著差异(P＜0.05)；HM组在25min后使再灌注期内的冠脉流量明显增加，与I/R组比有显著差异(P＜0.05)。毛状根组与丹参药材组无显著差异，

研究结果表明通过对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤保护作用的研究发现，丹参毛状根具有清除自由基的作用，对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用。同时，能够增加冠脉流量；不但降低心律失常的发生率，而且推迟心律失常的发生时间，缩短持续时间和恢复时间。结果提示丹参毛状根处理对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤可能具有保护作用，与丹参药材相当。

实施例2模型的稳定性

毛状根材料同实施例1

1.用流式细胞仪测定丹参毛状根遗传稳定性研究

取新鲜样品不同批次的丹参毛状根的根尖幼嫩部分50mg放置于1.5mL EP管中，加入1mL冰预冷的核分离缓冲液中，用锋利的剪子剪碎。核分离缓冲液(NIB)配方：15mmol·L^-1HEPES(MERCK公司)，1mmol·L^-1Na₂EDTA，80mmol·L^-1KCl，20mmol·L^-1NaCl，300mmol·L^-1蔗糖，0.2％(v/v)Triton X-100(Amresco公司)，0.5mmol·L^-1精胺(Fluka公司)，1％(w/v)polyvinylpyrrolidone(PVP-40)，pH7.5。用300目尼龙网过滤悬液，4℃，12000×g离心5min，弃上清。用70％乙醇固定过夜后，4℃，12000×g，离心5min，取上清液并用NIB缓冲液洗涤沉淀2次，使细胞恢复形态。用含有25μg·mL^-1 RNase的300μLNIB缓冲液重悬沉淀物，加入1mg·mL^-1碘化丙啶(Fluka公司)50μL对DNA进行染色，尽量使染色剂达到饱和，采用流式细胞仪COULTER EPICS XL(USA)进行检测，波长范围488～610nm。并在丹参毛状根样品中加入大豆核分离物质作为内参，图4。利用流式细胞术检测了不少于5批丹参毛状根组织的核DNA含量，结果表明丹参毛状根核DNA含量平均为0.18pg/2C，基因组大小平均为87.8Mbp，RSD小于7％，说明所选取的5批丹参毛状根样品是稳定的，

2.rol基因的遗传稳定性研究

分别提取不少于10批毛状根的总DNA。根据GeneBank中rolA基因的序列(X12579)设计引物(由上海生物工程公司合成)：rolA1：5′-AGCGTTCGGACAGCCACCA-3′；rolA2：5′-GGCGTGGAAATGAATCGAAGAC-3′

25μL反应体系为：18.0μLddH₂O，2.5μL10×Buffer，2μL dNTP(10mmol·L^-1)，0.5μL3’primer(100ng·μL^-1)，0.5μL 5’primer(100ng·μL^-1)，0.5μL Taq酶(5U·μL^-1，Takara rTaq)，1.0μL基因组DNA(1μg·μL^-1)。PCR扩增仪ABI 9700，反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，63℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃保温7min。PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，在SYNGENE型凝胶成像系统下观察，拍照(图5)，结果表明在所有的批次中均可以检测到519bp的特异DNA片段，而在阴性对照中检测不到此片段。利用TaKaRa公司试剂盒纯化PCR产物，并与PMD18-T vector载体(TaKaRa公司)与rolA基因连接。将连接产物用感受态细胞DH5α进行常规热激转化，方法参照TaKaRa公司试剂盒。连接产物送北京三博生物技术公司测序，利用DNAMAN软件对测序结果进行分析，结果表明丹参毛状根rolA序列与GeneBank登录序列(X12579)的同源性为100％，由此说明不少于10个批次的丹参毛状根样品中rolA基因是稳定的。

3.不同批次丹参毛状根化学成分稳定性研究

材料与方法同实施例1。不少于10个批次的丹参毛状根指纹图谱的相似度均高于0.95(图6)，符合国家药典委员会对“成品指纹图谱相似度计算结果在0.9～1.0(或以90～100表示)之间作为符合要求”的范围，说明不同批次丹参毛状根样品间化学成分组成的差异不显著。

4.不同批次丹参毛状根的生长情况分析

对不同批次丹参毛状根的鲜重、干重以及增长率(鲜重)进行了分析，不同批次丹参毛状根的增长率干重、折干率基本无显著差异，比较稳定。

实施例3模型的实用性研究：

1.N元素对丹参毛状根生长和有效成分积累的影响

通过调节6，7-V培养基中的NO₃^-和NH₄⁺的浓度来设计了4种氮元素浓度处理，分别用N₀(空白组)，N₁(1/4水平)，N₂(1/2水平)，N₃(完全组)表示，各处理其他矿质营养元素含量均相同。毛状根材料的培养同实施例1。将收获的不同处理的丹参毛状根样品，室温干燥，计算折干率。按实施例1方法测定样品丹参酮II_A和丹酚酸B的含量，并进行试验数据统计分析。结果表明不同氮元素浓度对丹参毛状根的生长有着显著影响。缺氮显著抑制丹参毛状根的生长；而氮元素浓度的增加使得丹参毛状根的鲜重、干重和产率均大幅增加。不同氮元素浓度对丹参毛状根有效成分含量积累有一定的影响。缺氮会显著提高丹参酮II_A的含量，而减少丹酚酸B的含量，各水平差异显著。培养基中矿质营养元素的改变都会对毛状根产生不同程度的刺激，进而影响其生长和有效成分的积累，由此证明丹参毛状根对矿质营养元素的刺激具有灵敏性，因此，可以用毛状根作为模型进行更深一步的道地产区环境因子变化的分析研究。

2.不同基因型毛状根的生长状况

分别采用河北和陕西商洛丹参叶片作为外植体，利用发根农杆菌A4进行浸染，在含有250mg/L头孢霉素的无激素MS培养基上进行诱导，结果发现陕西商洛毛状根的诱导率比河北高25％，结果暗示基因型对毛状根的生长状况会产生影响。