一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用

摘要

本发明提供一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用技术。本发明采用的枯草芽孢杆菌T122F具有促生、抗病作用。利用枯草芽孢杆菌的促生性和诱导抗性等功能，通过将枯草芽孢杆菌T122F培养液及其代谢产物添加于香蕉组织培养基中，然后接入香蕉组织培养材料培养，即可快速获得长势、耐毒、耐病性等有明显提高的健康香蕉苗。实施本发明操作简便，获得的香蕉健康苗出苗率高，实施本发明对缩短香蕉组培苗培养周期，节约生产成本具有良好的经济效益，对拓展枯草芽孢杆菌应用范围及开发一种新型的香蕉组织培养基进行香蕉种质资源抗性改良和创新利用具有重要的实践价值。

说明书

技术领域

本发明技术领域属于农学门类的植物保护学和植物细胞工程学；更具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用。

背景技术

大量使用化学农药防治植物病害已造成对环境和人类健康的危害，利用安全而环境友好的生物或化学诱导因子来激活植物的防御反应就是一种有效的策略。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一类嗜温、好氧或兼性厌氧的腐生细菌，在自然界中分布广泛，极易分离培养，对人畜无害，不污染环境。能够产生对热、紫外线、电磁辐射有很强抗性的芽孢，耐受各种不良的环境条件。产生多种抗菌素(如抗真菌肽、脂肽抗生素、小分子的多糖物质、大分子的抗菌蛋白)和酶(如蛋白酶、淀粉酶、酯酶、几丁质酶及乙酰基氨基葡糖苷酶等细胞壁降解酶)，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。对植物多种病原菌(如香蕉枯萎病菌、小麦白粉病菌，稻瘟病菌、棉花立枯病菌、大豆根腐病菌、番茄灰霉病菌、辣椒炭疽病菌等)产生抑制，目前已经在黄瓜、辣椒、香蕉、水稻、小麦、玉米、棉花等农作物主要病害上表现出很好的防治效果。

所有的植物具有多种潜在的有效的保护机制，诱导抗性(induced resistance)是指利用物理的、化学的以及生物的方法，预先处理植物，诱导植物启动自身的防御机制，增强对外界的抵抗能力。诱导抗性也是枯草芽孢杆菌防治植物病害的一种重要机制，枯草芽孢杆菌能诱导植物体内的多种防卫反应，诱导一些植物防卫基因的表达、增加与抗性有关保护酶的活性及植保素、木质素、酚类化合物的含量，产生许多新的抗病菌物质，从而提高植株对多种病原菌的系统抗性，这种诱导系统抗性通常具有广谱性、系统性和非特异性。枯草芽孢杆菌不仅含有植物生长素及类似代谢物如细胞分裂素、玉米素、脱落酸、赤霉酸等，而且还能诱导植物内源生长激素(吲哚乙酸、赤霉素、玉米素)和叶绿素含量增加，促进植物生长，提高植株对外界环境的适应性和抗逆性。枯草芽孢杆菌的应用很广泛，国内外在农业领域中多以该菌制成菌剂，以生物农药形式用于农业生产，对农业生态安全和减少环境污染起着重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用，将培养出的枯草芽孢杆菌T122F用于香蕉组织培养中，在材料来源上经济方便，技术上操作简便，具有香蕉组培苗生长安全，出苗快、整齐，育苗时间短，成本低等优点。获得的香蕉组培苗生长健壮，根系发达，抗毒素、抗病能力强，均可达到瓶苗假植质量标准。实施本项发明对开发一种新型的香蕉组织培养基，对香蕉种质资源抗性改良和创新利用具有重要作用。对拓展枯草芽孢杆菌在香蕉组织培养中的应用新领域和香蕉抗病育种研究新途径也具有重要的实践意义。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T122F菌株，其16s rDNA序列如序列表中SEQ IDNO.1所示。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T122F菌株，已经于2009年4月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.3043。

本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T122F菌株形态学鉴定：如下表1中所示：

表1细胞形态和生理生化试验结果

本发明的枯草芽孢杆菌的选育方法：所述枯草芽孢杆菌T122F菌株从香蕉枯萎病病区健康香蕉植株体内分离筛选获得。

本发明的枯草芽孢杆菌T122F菌株用于香蕉组织培养。

本发明的显著优点为：

本发明采用选育的一株枯草芽孢杆菌T122F，将该一定浓度枯草芽孢杆菌T122F培养液均匀地添加到香蕉组织培养基(含增殖培养基、分化培养基、生根培养基)，然后接入相应的香蕉培养材料(愈伤组织、丛生芽、分化苗)，使之在含有枯草芽孢杆菌T122F代谢产物的香蕉组织培养基中健康生长，通过比较香蕉不同生长时期培养材料的生长情况和抗毒素、抗病性情况之后，发现使用该技术可明显提高香蕉丛生芽增殖和苗分化能力，提高香蕉丛生芽和组培苗的抗毒素、抗病能力，使香蕉植株在组培苗期就可获得诱导抗性。

本发明使用的T122F菌株是从香蕉枯萎病病区健康香蕉植株体内分离筛选获得的一种具有促生、控病作用的香蕉内生芽孢杆菌，该菌株经中国科学院微生物研究所通过常规细胞形态、生理生化及16SrRNA序列测定，鉴定T122F菌株为枯草芽孢杆菌。与来自香蕉体内的芽孢杆菌及其它来源的枯草芽孢杆菌相比，该T122F菌株对香蕉枯萎病具有较强的抗菌活性和生防效果，能明显促进香蕉丛生芽组织和植株生长，提高香蕉苗保护酶的活性，并在香蕉体内迅速定殖和繁殖，增强植株对病害的抗性，是值得深入研究和具有开发潜力的一个菌株。

关于枯草芽孢杆菌诱导作物抗病性和促生性，目前大多基于一些作物种子和植株水平上的研究与应用，未见在香蕉细胞、组织水平上的诱导应用。香蕉细胞工程组培技术使香蕉种苗实现了工厂化生产，对香蕉产业的发展起着举足轻重的作用。本发明经过多年实验研究，得出在香蕉组织培养过程添加枯草芽孢杆菌T122F的培养滤液，一方面能明显促进香蕉丛生芽组织的生长，提高丛生芽增殖和苗分化能力，另一方面还能提高香蕉丛生芽和分化苗的耐毒素、耐病能力。本发明对进一步提高香蕉组培苗的出苗率，缩短育苗时间，节药成本，提高香蕉组培苗的抗病能力具有重要的作用。

本发明采用该枯草芽孢杆菌T122F进行香蕉组织培养，使用的菌株T122F培养原料简单，使用方法上操作简便，能使香蕉丛生芽、再生苗培养时间周期缩短、生长健壮，对促进香蕉苗安全生长、工厂化快速出苗、节约生产成本具有重要作用和良好的经济效益；获得的香蕉组培苗生长健壮，出苗整齐，根系发达，抗毒素、抗病能力强，在香蕉组培苗期即可完成并获得功能菌株T122F对香蕉植株的诱导抗性作用，使香蕉植株具备并提高对病害、毒素等条件下的抗逆能力，可达到瓶苗假植质量标准。实施本项发明对开发一种新型的香蕉组织培养基，对香蕉种质资源抗性改良和创新利用具有重要作用。对拓展枯草芽孢杆菌在香蕉组织培养中的应用新领域和香蕉抗病育种研究新途径也具有重要的实践意义。

附图说明

图1是本发明的含T122F的培养基，其中a：T122F菌株NB培养液；b：香蕉增殖培养基；c：含10％T122F菌株培养液香蕉增殖培养基；d：香蕉生根培养基；e：含10％T122F菌株培养液香蕉生根培养基。

图2是本发明的香蕉芽各阶段长势状况，其中a：丛生芽在含10％T122F菌株培养液增殖培养基中(20天)的长势；b：丛生芽在含10％BS08菌株培养液增殖培养基中(20天)的长势；c：丛生芽在空白增殖培养基中(20天)的长势；d：丛生芽在含10％T122F菌株培养液分化培养基中(20天)的长势；e：丛生芽在空白分化培养基中(20天)的长势。

图3是采用本发明的T122F菌株进行香蕉培养和不采用T122F菌株进行香蕉培养的对比状况，其中a：经10％T122F菌株培养液诱导处理的香蕉再生苗在25％粗毒液浸泡72h后的症状(示耐毒性好，叶片正常)；b：未经任何处理的香蕉再生苗在25％粗毒液浸泡72h后的症状(示耐毒性差，部份叶片萎蔫，根变黑易断)；c：经10％T122F菌株培养液诱导处理的香蕉再生苗在25％粗毒液浸泡120h后的症状(示耐毒性好，少数叶片萎垂、失绿)；d：未经任何处理的香蕉再生苗在25％粗毒液浸泡120h后的症状(示耐毒性差，全部叶片萎蔫，失绿，根变黑易断)；e：经10％T122F菌株培养液诱导处理的香蕉再生苗枯萎病菌孢子接种60d后的症状(示耐病性好，植株叶片黄化少，球茎内部组织变褐面积少)；f：未经任何处理的香蕉再生苗枯萎病菌孢子接种60d后的症状(示耐病性差，植株叶片黄化多，有的叶片枯死亡，球茎内部组织变褐面积大)。

图4是经过本发明T122F菌株培养和未经过T122F菌株培养的香蕉苗长势比较，其中a：经10％T122F菌株培养液诱导处理的香蕉苗在温棚长势(示叶色浓绿、高大)；b：未经任何处理的的香蕉苗在温棚长势(示生长正常)。

具体实施方式

枯草芽孢杆菌的选育步骤为：

从香蕉枯萎病病区采集健康香蕉植株，取其假茎中间部位组织约4g用灭菌水冲洗晾干后，用70％(V/V)酒精表面消毒30S后，再用0.1％升汞溶液(取升汞1克加1000毫升蒸馏水即可得到0.1％的升汞溶液，)表面消毒3.0min，无菌水冲洗3次后晾干。每样品加10ml无菌水碾碎，静止15min后，取50ul涂于KB培养基平板中，28℃黑暗培养48～72h，根据枯草芽孢杆菌的菌落形态、颜色等挑取单菌落，按常规方法用NA培养基进行菌株纯化和保存。

菌株对香蕉枯萎病病原菌的生物测定采用平板对峙生长法，即在直径为9cm的PDA平板中央用接种环点接一小环菌株菌落(28℃下，NA上培养24h)，同时在平板边缘接入直径为8mm的病原真菌菌块，28℃下黑暗培养5～7d，进一步筛选获得对病菌生长抑制作用明显的香蕉内生细菌T122F。

其中分离用的KB培养基配方为：蛋白胨20.0g，MgSO₄·7H₂O 1.5g，K₂HPO₄·H₂O 1.8g，甘油10.0ml，琼脂16.0～18.0g，蒸馏水1000.0ml，Ph7.2。

培养用的NA固体培养基配方为，NA：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，葡萄糖2.5g，琼脂16.0～18.0g，蒸馏水1000.0ml，Ph7.0～7.2。

培养用的NB液体培养基配方为，NB：蛋白胨5.0g，牛肉浸膏3.0g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000.0ml，Ph7.0～7.2。

对峙培养用的PDA培养基配方为：马铃薯200.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂16.0～18.0g，蒸馏水1000.0ml，Ph7.0～7.2。

枯草芽孢杆菌T122F菌株在香蕉组织培养中的应用步骤依序包括：

(1)T122F菌株培养液的制作：菌株在28℃条件下用常规的细菌液体培养基振荡培养，培养液过滤和灭菌后备用。

(2)香蕉组织培养基的制作：在MS基础培养基配方上，配制香蕉丛生芽增殖培养基、丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基。

(3)含T122F菌株培养液的香蕉组织培养基制作：T122F培养液按一定体积比均匀地添加到香蕉组织培养基中。

(4)香蕉组培材料的培养：在含T122F培养滤液的香蕉组织培养基中移入待培养香蕉组培材料，并于适宜条件下培养。

(5)试验结果比较：香蕉组培材料在相应培养基中生长适宜天数后，以未处理的香蕉组培培养基为空白对照，比较香蕉组培材料生长情况和抗性情况。

(6)健康香蕉组培苗获得：快速获得经T122F培养液诱导处理的、生长健壮、抗性能力强的香蕉组培生根苗。

实施步骤：

本发明实施例1之方法依序包括：T122F菌株培养液制作、香蕉组织培养基的制作、含T122F菌株培养液的香蕉组织培养基制作、香蕉组培材料的培养、试验结果比较、健康香蕉组培苗的获得。其中T122F菌株分离、保存、培养及香蕉组织培养属于常规的植物病理学研究法和植物组织培养学研究法。

(1)T122F无菌培养液制作：菌株在28℃条件下用常规的细菌NB液体培养基振荡培养3天，培养液双层滤纸过滤后，于121℃条件下湿热灭菌20min。(图1a)。

(2)香蕉组织培养基的制作：在MS基础培养基配方上，配制香蕉丛生芽增殖培养基、丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基。其中丛生芽增殖培养基为MS 1000ml+6-苄基氨基嘌呤(6-BA)5mg+萘乙酸(NAA)2mg(图1b)；丛生芽分化培养基为MS 1000ml+6-苄基氨基嘌呤(6-BA)3mg+萘乙酸(NAA)1mg；分生苗生根培养基为MS 500ml+6-糠基氨基嘌呤(KT)1mg+萘乙酸(NAA)1mg和活性炭粉+2g+纯水500ml(图1d)。各培养基于121℃条件下湿热灭菌20min后备用。

(3)含T122F培养液的香蕉组织培养基制作：T122F菌株培养液按10％体积比分别添加至50℃的香蕉丛生芽增殖培养基、丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基，混匀冷却后备用；(图1c，e)。

(4)香蕉组培材料的培养：

步骤1)丛生芽继代增殖培养：在含T122F菌株培养液的香蕉丛生芽增殖培养基中，每瓶(含培养基30ml)移入香蕉品种台蕉2号丛生芽组织5块(约10个芽)，于28℃～30℃，光强2000Lx、10h光/14h暗条件下培养。培养12～15天后，丛生芽即可转增殖下一代(图2a，b，c)，

步骤2)丛生芽分化培养：丛生芽在分化培养基中于28℃～30℃，每瓶(含培养基30ml)，光强2000Lx、12h光/12h暗条件下培养20天后，丛生芽分化成合格苗后即可移入生根培养基中生根培养(图2d，e)。

步骤3)分化苗生根培养：取步骤2)分化苗移入含T122F菌株培养液的香蕉生根培养基中，每瓶移香蕉分化苗8株，于28℃～30℃，光强2000Lx、12h光/12h暗条件下培养，培养20天后，分化苗即可长出良好的根、茎和叶(图2f，g)。

(5)试验结果比较：香蕉组培材料在相应培养基中生长后，以未处理的香蕉组培培养基为空白对照，抽样调查T122F菌株培养液处理的丛生芽鲜重增加值、增殖数、合格苗分化率、生根苗鲜重、生根苗株高及生根苗抗毒素、抗病菌能力，比较香蕉组培材料生长情况和抗性情况(图3a，b，c，d，e，f)。

(6)健康香蕉苗获得：快速获得经T122F培养液诱导处理、生长健壮、抗性能力强的、能达到瓶苗假植质量标准的、成株期长势健康的香蕉苗(图4a，b，)。

以下实施例进一步说明本发明，但是本发明不仅限制于此。

枯草芽孢杆菌T122F培养液对香蕉丛生芽组织诱导效应

(对比试验)

一、材料与方法

1、供试芽孢杆菌培养液制备

分别将本发明的枯草芽孢杆菌T122F和对照菌株枯草芽孢杆菌(市售，来源于土壤)菌株在28℃条件下用常规NB液体培养基振荡培养3天，培养液双层滤纸过滤后，于121℃条件下湿热灭菌20min。

2、供试香蕉枯萎病菌及其粗毒素制备

香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)4号生理小种，分离自田间罹病的香蕉，病菌在PSA培养基培养7d后(28℃)，用无菌水配成1×10⁶个孢子/mL的孢子悬浮液供接种用。病菌在查氏培养基中振荡培养10d(28℃，140rpm)，过滤离心(10000rpm，10min)后，于70℃下水浴30min，获得的培养滤液即为病菌粗毒素液。

3、含T122F菌株培养液的香蕉组织培养基制备

在MS基础培养基配方上，配制香蕉丛生芽增殖培养基、丛生芽分化培养基和分生苗生根培养基，并在这三种培养基上添加T122F和BS08培养液，使培养液最终体积比为10％，并以添加NB培养液(5％～40％)或未作任何处理的培养基为对照。其中丛生芽增殖培养基为MS1000ml+6-苄基氨基嘌呤(6-BA)5mg+萘乙酸(NAA)2mg；丛生芽分化培养基为MS 1000ml+6-苄基氨基嘌呤(6-BA)3mg+萘乙酸(NAA)1mg；分生苗生根培养基为MS 500ml+6-糠基氨基嘌呤(KT)1mg+萘乙酸(NAA)1mg和活性炭粉+2g+纯水500ml。培养基分装于香蕉组培玻璃瓶中，每瓶装30ml。

4、香蕉苗的诱导处理

台蕉2号(AAA)丛生芽在含菌株培养滤液的增殖培养基中增殖20天，在分化培养基中分化成苗20天后，移入含菌株培养滤液的生根培养基中生根20天，即可获得芽孢杆菌培养液诱导处理的再生苗。诱导过程中观察香蕉丛生芽及其分化苗、生根苗的长势，调查处理与未处理的香蕉丛生芽增殖率、增重、苗分化率(苗高2cm以上)、生根苗的株重、假茎高等生长参数。各处理共调查50瓶，试验两次。丛生芽增殖培养条件为28℃～30℃，光强2000Lx、10h光/14h暗。丛生芽在分化和分化苗生根培养条件为28℃～30℃，光强2000Lx、12h光/12h暗。

5、香蕉再生苗毒素和病菌处理

取方法4获得的香蕉再生苗(伤根并保留根长2cm)浸在25％的毒素稀释液中，浸液高度至假茎2cm处，120h后调查植株萎蔫情况，计算再生苗萎蔫指数，每处理10株苗，3次重复。苗龄60天的香蕉苗(伤根并保留根长3cm)移于花盆中，每盆1株，每株香蕉灌孢子悬浮液(浓度为1×10⁶/ml)100ml于香蕉苗根部，然后覆土，各处理10株苗，3次重复。接菌60d后调查香蕉苗发病情况，试验温度条件为28～35℃，相对温度为90％左右，试验两次，并以未经菌培养液诱导处理的香蕉苗作空白对照。

二、结果分析

1、菌株培养介质(NB培养基)对香蕉丛生芽组织增殖的影响

从表1可知，与空白对照相比，增殖培养基含NB培养基5％～10％(V/V)对香蕉丛生芽增殖无明显影响，但随NB培养液浓度的增加，香蕉丛生芽增殖率明显下降。考虑高浓度的菌株培养介质对香蕉丛生芽增殖有明显影响，因而选用T122F菌株培养液的10％(V/V)浓度进行香蕉丛生芽诱导较为适宜。

表1NB培养基不同浓度处理对香蕉丛生芽组织增殖的影响(20天)

  处理  芽增殖率(％)  空白对照  111.00Aa  5％NB  108.50Aa

  10％NB  115.47Aa  20％NB  76.92Bb  30％NB  27.25Cc  40％NB  0Dd

2、T122F培养液对香蕉丛生芽组织增殖和重量的影响

从表2可知，10％(V/V)T122F培养液对香蕉丛生芽增殖和增重有促进作用，与空白对照相比能明显提高丛生芽增殖率和重量增加率。与对照菌株BS08培养液处理相比，T122F培养液处理的芽较粗。

表210％T122F培养液对香蕉丛生芽组织增殖和增重结果

  处理  出芽组织率  (％)  芽增殖率  (％)  重量增加  率  (％)  芽长势  T122F  97.50Aa  172.00Aa  711.88Aa  芽粗  对照菌株  (BS08)  95.90Aa  159.52Aa  381.99Bb  芽细  空白对照  91.67Aa  111.00Bb  410.78Bb  正常

3、T122F培养液对香蕉丛生芽组织增重和分化的影响

从表3可知，在分化培养基中，10％(V/V)T122F培养液对香蕉丛生芽增殖仍有明显促进作用，其处理的香蕉丛生芽分化成标准苗率为51.97％，明显高于两种对照。T122F培养液处理的分化苗较壮、高、叶色浓绿。

表310％T122F培养液对香蕉丛生芽分化影响

  供试菌株  芽苗增殖率  (％)  分化苗率*  (％)  苗长势  T122F  125.63Aa  51.97Aa  苗壮、高、叶色浓  绿  对照菌株(BS08)  104.17Bb  40.48Bb  苗偏弱、叶色正常  空白  92.86Bc  45.95ABc  正常

*注：分化标准苗指高为2cm以上的芽。

4、T122F培养液诱导获得的香蕉再生苗长势及抗性能力

从表4可知，丛生芽经T122F培养液诱导增殖、分化和生根后获得的香蕉再生苗生根正常，与空白对照相比，诱导后的香蕉苗壮、高、叶色浓绿、茎粗、根系旺，标准苗率达100％，标准苗耐毒、假植苗耐病能力均比空白对照好。

表4T122F培养液诱导处理后香蕉再生苗长势及抗性能力比较

  处理  株重  (g/株)  假茎高  (cm/株)  标准苗率*  (％)  标准苗萎蔫指数  (％)  假植苗病情指数  (％)  T122F  1.30Aa  4.43Aa  100.00Aa  6.67Bb  61.90Bb  空白  0.82Bb  3.10Bb  82.37Bb  76.54Aa  82.14Aa

*注：标准瓶苗为苗无污染，根系粗状，有2条以上的白色根；假茎高约2.5-3cm，茎直径约0.3cm，假茎为绿色；有2片以上的自然叶，叶色浓绿。

三、结果评价

1、枯草芽孢杆菌T122F具有抗病、促生功能，其培养保存方便，采用常规的NB细菌培养基及冷冻、冷藏保存均可。

2、T122F培养液以10％体积比添加到香蕉丛生芽增殖培养基、分化培养基和生根培养基中，有助于香蕉丛生芽的殖增、分化、生根和再生苗生长，提高香蕉苗的标准出苗率。丛生芽在含10％T122F培养液的增殖培养基中培养12～15天即可转增殖下一代，丛生芽分化培养20天后，分化苗比率明显高于枯草芽孢杆菌BS08培养液处理及空白对照。

3、T122F培养液诱导处理的丛生芽增殖率高、芽粗，分化苗壮、高、叶色浓绿，长势均优于枯草芽孢杆菌BS08培养液处理及空白对照。由T122F培养液诱导处理获得的香蕉再生苗生根正常，苗壮、高、叶色浓绿、茎粗、标准苗率达100％，标准苗耐毒、假植苗耐病能力均比空白对照好，香蕉苗种于温棚中长势均良好。

4、采用本发明可缩短香蕉组培苗培养时间，节约成本，提高组培苗出苗率和标准率，优化组培苗长势，提高组培苗的抗性，对促进香蕉健康苗工厂化快速出苗具有重要作用。

核苷酸序列表

<110>福建省农业科学院植物保护研究所

<120>一种枯草芽孢杆菌及其在香蕉组织培养中的应用

<160>1

<210>1

<211>

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<223>该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)T122F菌株16S rDNA总长1353。

<400>1

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