一种光合细菌水产养殖饵料添加剂的生产方法

摘要

本发明涉及一种光合细菌水产养殖饵料添加剂的生产方法。该方法采取如下步骤：1.菌种扩大培养：将菌种扩大培养基调pH6.0－8.5，装入玻璃瓶并进行高温消毒，按菌种培养基体积的5％－40％接入沼泽红假单胞菌与球形红细菌二种光合细菌的混合培养物。在温度15℃－35℃，光照强度为1000lux－3000lux条件下厌氧培养3－4天，即成菌种培养液；2.发酵生产：将发酵培养基装入发酵罐内并进行高温消毒，按发酵生产培养基体积的5％－40％的接种量接入菌种培养液。在温度28－30℃；搅拌速度150－300转/分；罐压保持0.02－0.05MPa；光照强度为2000－3000lux条件下发酵6天，即成光合细菌水产养殖饵料添加剂。本发明与现有技术相比，具有产品质量稳定、功能多样化的优点。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种光合细菌水产养殖饵料添加剂的生产方法。

背景技术

随着我国工、农业的高速发展，人民生活水平的提高，大量未经处理的工、农业生产废水和生活污水的直接排放；加上我国水产养殖集约化程度的提高，使我国养殖水域污染日趋严重。由此引发的养殖水生动物疾病大量增加，且频繁发生。而盲目大量频繁使用渔(兽)药、抗生素、激素等，使水产品的貭量安全受到严重威胁。为了保护渔业生态环境，提高水产品貭量和产量，促进水产业可持续发展，应用光合细菌微生态制剂防治渔业生态环境污染和破坏，防治水产品病害，无疑具有重要意义。中国发明专利号94106402.6公开了一种名称为“利用微生物生产的动物饲料添加剂及其生产方法”的技术。这种动物饲料添加剂是一种用光合细菌生产的液体制剂，也使用在水产养殖上，但由于其生产原料采用10-40％的淀粉水溶液，营养元素不全面，难以满足光合细菌生长对氮源、磷源、硫源等大量元素的需要，因而生长不良。同时，该专利使用的淀粉水溶液经糖化后，采用自然酸化的方式得到酸性发酵液，由于酸化菌种没有加以人为控制，因而酸性发酵液的质量难以保证。而且在接种光合细菌菌种之前未经灭菌处理，所以酸性发酵液中含有大量的异养菌，这些异养菌会抑制光合细菌的生长，从而造成产品的严重污染，污染率可达80％以上，从而造成施用效果的不稳定。

发明内容

本发明的发明目的是为了克服已有技术的不足，提供一种质量稳定且功能多样化的光合细菌水产养殖饵料添加剂的生产方法。

本发明的发明目的是这样实现的；该光合细菌水产养殖饵料添加剂的生产方法采取如下步骤：

1、菌种扩大培养

生产菌种：采用菌种保藏号为M209077的沼泽红假单胞菌(H1)(Rhodopeudomonas palustris)与菌种保藏号为M209078的球形红细菌(H2)(Rhodobacter sphaeroides)二种光合细菌的1∶1的混合培养物作为生产菌种。这两株菌种于2009年4月27日保藏在武汉大学的《中国典型培养物保藏中心》。

将菌种扩大培养基的以下成份：苹果酸钠1.0克；乙酸钠1.0克；氯化铵1.0克；磷酸二氢钾1.0克；氯化钙0.1克；碳酸氢钠3.0克；氯化镁0.5克；微量元素溶液1.0ml；维生素溶液1.0ml；酵母提取物0.5克分别溶于1.0升蒸馏水中。用氢氧化鈉调pH6.0-8.5范围内，最好pH为6.8-7.2，装入玻璃瓶。在121℃灭菌30分钟。待培养基冷却至30-35℃时，按菌种培养基体积的5％-40％，最好10％-20％的接种量接入上述二种光合细菌的混合培养物。在温度15℃-35℃范围内，最好28℃-30℃，光照强度为10001ux-3000lux条件下厌氧培养3-4天，含菌量达到5X10⁸-10X10⁸cfu/ml，即成红色的菌种培养液。

微量元素溶液组成：四水氯化亚铁1.8克；六水氯化钴0.25克；六水氯化镍0.01克；二水氯化铜0.01克；四水氯化锰0.7克；氯化锌0.1克；硼酸0.5克；二水钼酸钠0.03克；五水亚硒酸钠0.01克；蒸馏水1.0升。

维生素溶液组成：生物素0.1克；烟酸0.35克；盐酸硫胺素0.3克；对-氨基苯甲酸0.2克；盐酸吡哆胺0.1克；泛酸钙0.1克；维生素B120.05克；蒸馏水1.0升。

2、发酵生产

(1)发酵培养基组成：苹果酸1.0克；乙酸钠1.5克；丙酸钠0.5克；酵母提取物1.0克；硫酸铵1.3克；七水硫酸镁0.2克；二水氯化钙0.07克；柠檬酸铁0.01克；乙二胺四乙酸(EDTA)0.02克；磷酸二氢钾0.6克；磷酸氢二钾0.9克；微量元素溶液1.0ml；维生素溶液7.5ml；自来水1.0升；pH 6.8-7.2。

其中：

微量元素溶液：柠檬酸铁3克；一水硫酸锰0.02克；硼酸0.01克；五水硫酸铜0.01克；四水钼酸铵0.02克；硫酸锌0.01克；乙二胺四乙酸(EDTA)0.5克；二水氯化钙0.2克；蒸馏水1.0升。

维生素溶液：烟酸0.2克；烟酰胺0.2克；硫胺素盐酸盐0.4克；生物素0.08克；蒸馏水1.0升。

(2)生产过程及条件控制：在全自动光合微生物发酵罐内，按上述组成配制发酵培养基。121℃灭菌60分钟。待培养基冷却至30℃-35℃时，按发酵生产培养基体积的5％-40％，最好为10％-20％的接种量接入菌种培养液。在温度28-30℃；搅拌速度150-300转/分；用无菌空气保持罐压，罐压保持0.02-0.05MPa；光照强度初期2000lux，中期2500lux，后期3000lux条件下发酵6天，即成红棕色光合细菌水产养殖饵料添加剂。内含有效活菌数5X10⁹-6X10⁹cfu/ml；pH7.0-8.5；杂菌率小于2％。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

1、用本发明生产的饵料添加剂质量稳定。

本发明采用纯净的化学试剂作生产原料，貭量和数量得到严格控制，营养元素均衡、全面。能满足光合细菌生长繁殖对碳源、氮源、磷源、硫源以及各种微量元素的需求。另外，在接种光合细菌混合培养物之前，采用121℃灭菌60分钟，杀灭了发酵生产培养基中所有杂菌的营养细胞、芽胞和霉菌胞子。在生产过程中又采用无菌空气保持罐压，使光合细菌在完全纯培养的条件下生长繁殖。每批产品内含有效活菌数5X10⁹-6X10⁹cfu/ml，杂菌率小于2％，从而保证了饵料添加剂的貭量和施用效果。

2、用本发明生产的饵料添加剂有以下多种功效：

本光合细菌水产养殖饵料添加剂是集营养和保健于一体的生物活性添加剂，其作用相当于饲料添加剂十促生长剂十抗病剂十净水剂。

1)、提供营养，促进生长，提高饵料利用率，增产增收

本饵料添加剂的主要成分光合细菌细胞含有极丰富的蛋白貭、B族维生素、类葫萝卜素、微量元素，还富含核酸、辅酶Q₁₀和促生长因子等。在鳗鱼养殖中，在饵料中按1％添加本添加剂后，比常规养殖产量平均增加8.19％；饵料系数平均下降12.6％；生长周期缩短了15天。在加州鲈鱼养殖中，在饵料中按1％添加本添加剂后，比常规养殖，产量增加7.78％；饵料系数下降5.56％；生长周期缩短28天。

2)、净化水质，维护水体生态平衡

在鳗鱼养殖中，在未使用本添加剂之前测定的各项水貭指标为：pH6.7；溶解氧5.5mg/L；氨氮1.132mg/L；亚硝酸盐0.413mg/L；硫化氢0.003mg/L。然后按1kg/亩*米泼洒本添加剂，5天后水貭检测结果如下：pH7.6(由弱酸性变为弱碱性)；溶解氧7.8mg/L(增高41.8％)；氨氮0.465mg/L(降低58.9％)；亚硝酸盐0.101mg/L(降低75.5％)；硫化氢0mg/L(降解100％)。各项指标均好于《淡水渔业水质养殖标准》。在加州鲈鱼和南美白对虾养殖过程中，坚持每15天按1kg/亩*米泼洒本添加剂，每周取样测定水貭，各项指标均好于《淡水渔业养殖水貭标准》，水体中轮虫、枝角虫等有益浮游动物数量明显增加。

3)、降解药物残留和水体污染物

(1)、本水产养殖添加剂对多种水产养殖药物残留降解效果非常明显。对含有10mg/L孔雀石绿的水体120小时的降解率可达84.6％；对含有10mg/L呋喃唑酮的水体，72小时的降解率达到100％。

(2)、在出口鳗鱼活体检测中，发现鱼体内含硝基呋喃类代谢物3.15mg/kg，随后按3％添加本添加剂到饵料中饲喂，10天后再次检测结果为：无法检出，体内降解率达100％，达到出口标准。

(3)、本添加剂含有多种降解污染物的酶类和貭粒，除了可降解各类有机物外，还可降解许多难生物降解的物貭，如鹵代芳香族化合物、胺类、烷类等，对广泛用于工农业生产中的氯代苯类化合物去除率可达96.4％。

4)、固定水体中重金属，减少重金属对水生动物的危害；并降低水产动物体内重金属含量，保障食品安全。本添加剂可将溶于水的有毒有害重金属转化为不溶于水的金属硫化物，从而避免了重金属对水产动物生长的危害；也减少了重金属在水产养殖动物体内的富集，降低体内重金属含量。试验表明：本添加剂对Pb²⁺、As⁵⁺、As³⁺、Cd²⁺、Cr²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺等多种重金属有很强的抗性。对初始浓度为10-25mg/L的Cd²⁺，36小时的去除率可85％以上。对浓度为100mg/L的Pb²⁺24小时去除率可达95％。

5)、防病抗病，提高免疫力和成活率

本添加剂含有抗病毒成分可以有效钝化水体病毒，减少病毒病的发生。对温和气单胞菌、恶臭假单胞菌等多种水产养殖病原菌也有较好抑制作用。另外本添加剂可促进动物免疫器官的发育，有效提高动物免疫力。鳗鱼养殖实验表明，使用本添加剂后，鱼病损失减少15％，成活率提高4.26％；加州鲈鱼养殖实验表明，使用本添加剂后加州鲈常见的烂鳃病、烂身病、鱼疮等疾病未发生过；成活率提高3.19％；南美白对虾高密度养殖实验表明，使用本添加剂后，基本不再使用渔药，成活率高达95％以上。

6)、改善水产品的品质

(1)、在鳗鱼养殖中使用本添加剂后，成鱼大小均匀整齐，颜色乌润光泽，肉貭好，口感佳。活体检测报告显示，抗生素类、磺胺类、六六六类、滴滴涕类、激素类、菊酯类以及各类有毒有害重金属等均为未检出。

(2)、在加州鲈鱼养殖中使用本添加剂后，鱼体整齐，鱼鳞特别有光泽，鲜活生猛，肉质丰厚嫩滑。活体检测报告显示，抗生素类、磺胺类、六六六类、滴滴涕类、激素类、菊酯类以及各类有毒有害重金属等均为未检出。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明：

实施例1

步骤一：将上述菌种扩大培养基的各种成份在蒸馏水中溶解后放进玻璃瓶，用氢氧化钠调pH6.0，在121℃灭菌30分钟，冷却至30℃时，接种入菌种培养基体积5％的沼泽红假单胞菌与球形红细菌混合培养物，在温度为15℃，光照强度为1000lux条件下厌氧培养3天，即得红棕色的菌种培养液，含菌量达到5X10⁸cfu/ml。

步骤二：将上述发酵用培养基的各种成份在自来水中溶解后放进全自动光合微生物发酵罐内，在121℃灭菌60分钟，待培养基冷却至30℃时，按发酵生产培养基体积5％的接种量接入菌种培养液。在温度为30℃；搅拌速度150转/分；用无菌空气保压，罐压保持为0.02MPa；光照强度初期为2000lux，中期为2500lux，后期为3000lux条件下发酵6天，即得红棕色光合细菌水产养殖饵料添加剂，内含有效活菌数6X10⁹cfu/ml，杂菌率小于2％。

实施例2

步骤一：将上述菌种扩大培养基的各种成份蒸馏水中溶解后放进玻璃瓶，用氢氧化钠调pH8.5，在121℃灭菌30分钟，冷却至35℃时，接种入菌种培养基体积20％的沼泽红假单胞菌与球形红细菌混合培养物，在温度为35℃，光照强度为3000lux条件下厌氧培养4天，即得红棕色的菌种培养液，含菌量达到8X10⁸cfu/ml。

步骤二：将上述发酵用培养基的各种成份在自来水中溶解后放进全自动光合微生物发酵罐内，在121℃灭菌60分钟，待培养基冷却至35℃时，按发酵生产培养基体积40％的接种量接入菌种培养液。在温度为30℃；搅拌速度300转/分；用无菌空气保压，罐压保持为0.05MPa；光照强度初期为2000lux，中期为2500lux，后期为3000lux条件下发酵6天，即得红棕色光合细菌水产养殖饵料添加剂，内含有效活菌数5.8X10⁹cfu/ml，杂菌率小于2％。

实施例3

步骤一：将上述菌种扩大培养基的各种成份在蒸馏水中溶解后放进玻璃瓶，用氢氧化钠调pH7.0，在121℃灭菌30分钟，冷却至32℃时，接种入菌种培养基体积15％的沼泽红假单胞菌与球形红细菌混合培养物，在温度为25℃，光照强度为2000lux条件下厌氧培养4天，即得红棕色的菌种培养液，含菌量达到8X10⁸cfu/ml。

步骤二：将上述发酵用培养基的各种成份在自来水中溶解后放进全自动光合微生物发酵罐内，在121℃灭菌60分钟，待培养基冷却至32℃时，按发酵生产培养基体积15％的接种量接入菌种培养液。在温度为29℃；搅拌速度250转/分；用无菌空气保压，罐压保持为0.04MPa；光照强度初期为2000lux，中期为2500lux，后期为3000lux条件下发酵6天，即得红棕色光合细菌水产养殖饵料添加剂，内含有效活菌数6X10⁹cfu/ml，杂菌率小于2％。