检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途

摘要

本发明涉及检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途。将带有R

说明书

技术领域

本发明涉及检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物、尤其涉及检测谷胱甘肽还原酶的荧光探针及其合成方法和用途。

背景技术

大量研究表明全血谷胱甘肽还原酶活性系数(BGRAC)是评价机体维生素B₂营养状况特异而灵敏的指标，它不仅能反映维生素在体内的代谢利用情况、贮存的边缘缺乏状态。且不受其它营养不良的影响。全血谷胱甘肽还原酶担负着调节体内氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的重要任务。

目前，谷胱甘肽还原酶的分析测定一般是利用其还原性及其与某些有机试剂发生反应后，用电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法及荧光方法进行分析测定，这些方法操作复杂、灵敏度不高并且选择性较差。

现代医学研究也表明，体液中某种氨基酸浓度的异常变化也是导致众多疾病产生的根源，如血液中同型半胱氨酸(Hcy)升高会促进动脉粥样硬化，进而与缺血性心、脑血管疾病密切相关，目前侦测同型半胱氨酸在血液中浓度的变化是诊断此类疾病危险性的一个独立参考因子，因此准确地检测体液中同型半胱氨酸的含量已成为控制疾病发展的重要因素之一。目前使用的检测方法繁琐且检测速度较慢，发展一种方便、灵敏、快速的检测手段是非常必要的。

目前，半胱氨酸的分析测定一般是利用其还原性及其与某些有机试剂发生反应后，用电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法及荧光方法进行分析测定，这些方法操作复杂、灵敏度不高并且选择性较差。

光化学传感器是近年来迅速发展起来的一个新的科学问题，它的出现显然和超分子科学的进展诸如分子组装、主客体化学、非共价相互作用、氢键作用、疏水作用等以及光诱导电子转移(PET)过程、分子内共扼的电荷转移化合物结构及其发光特性等研究密切相关：它的发展也和许多科学技术领域诸如生物化学、临床医学、药物化学以及环境科学中提出的大量实际问题密切相关。由于上述种种原因，有力的推动了光化学传感器的研究进展。光化学传感器按其信号检测方法的不同，主要分为荧光探针(Fluorescent probe)又称为荧光化学传感器(Fluorescent Chemosensor)和比色化学传感器(Colorimetric Chemosensor)。荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段，通常有荧光的增强、猝灭或者发光波长的移动，而比色化学传感器主要是借助于色调的变化，通过肉眼观察就可以检测，方便实际应用。用于对外来物种进行检测的荧光探针的设计和研究，是近年来受到广泛关注的一个科学问题。荧光探针的检测过程主要是通过器件接受体(Receptor)部分对外来物种(包括阳离子，阴离子及中性分子等)的选择性接纳，然后经不同的作用机制，如光诱导电子转移(PET)或能量转移、金属-探针前体电荷转移(MLCT)、分子内电荷转移(ICT)，再通过器件的信号报告部分给出有关器件在接纳物种过程中的信息变化。荧光探针由于其有选择性好、灵敏度高、响应时间快等优点，在微量化学物种的检测方面得到了很好的应用。

香豆素类化合物因其较大的摩尔消光系数和高的荧光量子产率，已作为荧光标记物在生物技术方面有一定的应用，但把它作为直接用来识别特定客体的化学传感分子的例子还很少见报道。本研究组报道了基于香豆素安替比林Schiff碱在乙腈中对Zn²⁺选择性识别的化学传感分子。这类传感分子的设计原理是，金属离子通过与接受体的配位作用，诱导了刚性结构的形成。阻止了安替比林Schiff碱的异构化作用，从而使荧光量子产率大大增强，根据这个过程实现对Zn²⁺的选择性识别。在本发明中，我们设计合成了基于香豆素检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针，与前人的工作相比(1.Yong Guo，Shijun Shao，Jian Xu，Yanping Shi and Shengxiang Jiang.A specificcolorimetric cysteine sensing probe based on pyrromethane-TCNQ assemblyTetrahedron Lett.2004.45.6477～6480.2.Weihua Wang，Oleksandr Rusin，Xiangyang Xu，Kyu Kwang Kim，Jorge O.Escobedo，Sayo O.Fakayode，Kristin A.Fletcher，Mark Lowry，Corin M.Schowalter，Candace M.Lawrence，Frank R.Fronczek，Isiah M.Warner，and Robert M.Strongin Detection of Homocysteineand Cysteine.J.Am.Chem.Soc.2005，127，15949～15958.)，其有这样的优点：荧光探针分子对谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物有识别作用时，不仅使吸收和荧光的强度有较大的增强，而且会使溶液出现由颜色的变化，这一过程可方便的实现肉眼检测。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有荧光探针的性能和结构上的不足之处，提供一种性能优良的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针。

本发明的目的之二是提供用于合成检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针的探针前体。

本发明的目的之三是提供用于合成检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针的探针前体的合成方法。

本发明的目的之四是提供检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针的合成方法。

本发明的目的之五是提供谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针的用途。

本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针具有以下结构：

用于合成本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针的探针前体具有以下结构：

上述式(I)或式(II)中的R₁或R₂分别或者同时为烷基、取代烷基或芳基；R₃为氢、烷基、烷氧基、胺基或芳基；R₄为氢、烷基、烷氧基、芳基、硝基或卤素；R₅为氢、烷基、烷氧基、胺基、芳基、硝基或卤素；X为硝酸根、硫酸根、磷酸根、高氯酸根、硫氰酸根或卤素。

所述的R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的烷基为：1至50个碳原子的烷基或3至50个碳原子的环烷基；

所述的R₁或R₂中的取代烷基为：芳基取代的1至50个碳原子的烷基、ω-羟基取代的1至50个碳原子的烷基、ω-羧基取代的1至50个碳原子的烷基或ω-酯基取代的1至50个碳原子的烷基；

所述的R₁、R₂、R₃、R₄或R₅中的芳基为：邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基，邻、对、间位卤代苯基，邻、对、间位1至50个碳原子取代或未取代的烷氧基苯基或邻、对、间位胺基苯基；

所述的R₃、R₄或R₅中的烷氧基为：1至50个碳原子的烷氧基；

所述的R₃或R₅中的胺基选自：1至50个碳原子的烷基胺基，或选自ω-羟基烷基胺基，ω-羧基烷基胺基，ω-酯基烷基胺基，芳基胺基，二烷基胺基，二(ω-羟基烷基)胺基，二(ω-羧基烷基)胺基，二(ω-酯基烷基)胺基，二芳胺基及季铵盐基中的一种；其中烷基是1至12个碳原子；

所述的R₄、R₅或X中的卤素为：氟、氯、溴或碘。

所述的R₁、R₂中的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基，己基，2-甲基戊基，庚基，2-甲基己基，辛基，2-甲基庚基，壬基，2-甲基辛基，癸基，2-甲基壬基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四烷基及十五烷基中的一种；

所述的R₃、R₄或R₅中的1至50个碳原子的烷基选自甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，叔戊基及己基中的一种；

所述的R₁、R₂中的3至50个碳原子的环烷基分别或者同时选自环丙烷基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基及环庚烷基中的一种；

所述的R₃、R₄或R₅中的3至50个碳原子的环烷基选自环丙烷基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基及环庚烷基中的一种。

所述的R₁、R₂中的芳基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基异丙基，芳基丁基，芳基异丁基，芳基戊基，芳基异戊基，芳基己基，2-甲基芳基戊基，芳基庚基，2-甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2-甲基庚基，芳基壬基，2-甲基芳基辛基，芳基癸基，2-甲基芳基壬基，芳基十一烷基，芳基十二烷基，芳基十三烷基，芳基十四烷基及芳基十五烷基中的一种；

所述的R₁、R₂中的ω-羟基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-羟基甲基，ω-羟基乙基，ω-羟基丙基，ω-羟基异丙基，ω-羟基丁基，ω-羟基异丁基，ω-羟基戊基，ω-羟基异戊基，ω-羟基己基，ω-羟基-2-甲基戊基，ω-羟基庚基，ω-羟基-2-甲基己基，ω-羟基辛基，ω-羟基庚基，ω-羟基壬基，ω-羟基-2-甲基辛基，ω-羟基癸基，ω-羟基-2-ω-羟基甲基壬基，ω-羟基十一烷基，ω-羟基十二烷基，ω-羟基十三烷基，ω-羟基十四烷基及ω-羟基十五烷基中的一种；

所述的R₁、R₂中的ω-羧基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-羧基甲基，ω-羧基乙基，ω-羧基丙基，ω-羧基异丙基，ω-羧基丁基，ω-羧基异丁基，ω-羧基戊基，ω-羧基异戊基，ω-羧基己基，ω-羧基-2-甲基戊基，ω-羧基庚基，ω-羧基-2-甲基己基，ω-羧基辛基，ω-羧基庚基，ω-羧基壬基，ω-羧基-2-甲基辛基，ω-羧基癸基，ω-羧基-2-ω-羧基甲基壬基，ω-羧基十一烷基，ω-羧基十二烷基，ω-羧基十三烷基，ω-羧基十四烷基及ω-羧基十五烷基中的一种；

所述的R₁、R₂中的ω-酯基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自ω-酯基甲基，ω-酯基乙基，ω-酯基丙基，ω-酯基异丙基，ω-酯基丁基，ω-酯基异丁基，ω-酯基戊基，ω-酯基异戊基，ω-酯基己基，ω-酯基-2-甲基戊基，ω-酯基庚基，ω-酯基-2-甲基己基，ω-酯基辛基，ω-酯基庚基，ω-酯基壬基，ω-酯基-2-甲基辛基，ω-酯基癸基，ω-酯基-2-ω-酯基甲基壬基，ω-酯基十一烷基，ω-酯基十二烷基，ω-酯基十三烷基，ω-酯基十四烷基及ω-酯基十五烷基中的一种。

所述的R₁、R₂中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲基苄基，邻、对、间位取代乙基苄基，邻、对、间位取代丙基苄基或邻、对、间位取代异丙基苄基；

所述的R₁、R₂中的邻、对、间位卤代苯基分别或者同时是邻、对、间位氟代苄基，邻、对、间位氯代苄基，邻、对、间位溴代苄基或邻、对、间位碘代苄基；

所述的R₁、R₂中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲氧苄基，邻、对、间位取代乙氧基苄基或邻、对、间位取代丙氧基苄基；

所述的R₁、R₂中的邻、对、间位胺基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲胺基苄基，邻、对、间位取代乙胺基苄基或邻、对、间位取代丙胺基苄基；

所述的R₃中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基选自邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基，邻、对、间位丙基苯基及邻、对、间位异丙基苯基中的一种；

所述的R₃中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；

所述的R₃中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；

所述的R₃中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；

所述的R₄中邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基是邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基或邻、对、间位丙基苯基中的一种；

所述的R₄中邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；

所述的R₄中邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；

所述的R⁴中邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；

所述的R₅中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基选自邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基及邻、对、间位丙基苯基中的一种；

所述的R₅中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；

所述的R₅中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、对、间位异丙基苯基，邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基或及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；

所述的R₅中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、对、间位乙胺基苯基或邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；

所述的R₃或R₅中1至50个碳原子的烷氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基，2-甲基戊氧基及苄氧基中的一种；

所述的R₄中1至50个碳原子的烷氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基及苄氧基中的一种。

所述的R₃或R₅中的1至50个碳原子的烷基胺基选自甲胺基，乙胺基，丁胺基，戊胺基，异戊胺基，新戊胺基，叔戊胺基及己胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的ω-羟基烷基胺基选自2-羟基乙基胺基，3-羟基丙基胺基，4-羟基丁基胺基，5-羟基戊基胺基及6-羟基己基胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的ω-羧基烷基胺基选自2-羧基乙基胺基，3-羧基丙基胺基，4-羧基丁基胺基，5-羧基戊基胺基及6-羧基己基胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的ω-酯基烷基胺基选自2-酯基乙基胺基，3-酯基丙基胺基，4-酯基丁基胺基，5-酯基戊基胺基及6-酯基己基胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的芳基胺基选自邻、对、间位甲基苄基胺基，邻、对、间位乙基苄基胺基，邻、对、间位丙基苄基胺基，邻、对、间位异丙基苄基胺基，邻、对、间位甲氧基苄基胺基，邻、对、间位乙氧基苄基胺基，邻、对、间位丙氧基苄基胺基，邻、对、间位氟代苄基胺基，邻、对、间位氯代苄基胺基，邻、对、间位溴代苄基胺基及邻、对、间位碘代苄基胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的二烷基胺基选自二甲胺基，二乙胺基，二丙胺基，二丁胺基，二戊胺基，二异戊胺基，二新戊胺基，二叔戊胺基及二己胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的二(ω-羟基烷基)胺基选自二(2-羟基乙基)胺基，二(3-羟基丙基)胺基，二(4-羟基丁基)胺基，二(5-羟基戊基)胺基及二(6-羟基己基)胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的二(ω-羧基烷基)胺基选自二(2-羧基乙基)胺基，二(3-羧基丙基)胺基，二(4-羧基丁基)胺基，二(5-羧基戊基)胺基及二(6-羧基己基)胺基的一种；

所述的R₃或R₅中的二(ω-酯基烷基)胺基选自二(2-酯基乙基)胺基，二(3-酯基丙基)胺基，二(4-酯基丁基)胺基，二(5-酯基戊基)胺基及二(6-酯基己基)胺基中的一种；

所述的R₃或R₅中的二芳胺基选自二(邻、对、间位甲基苄基)胺基，二(邻、对、间位乙基苄基)胺基，二(邻、对、间位丙基苄基)胺基，二(邻、对、间位异丙基苄基)胺基，二(邻、对、间位甲氧基苄基)胺基，二(邻、对、间位乙氧基苄基)胺基，二(邻、对、间位丙氧基苄基)胺基，二(邻、对、间位氟代苄基)胺基，二(邻、对、间位氯代苄基)胺基，二(邻、对、间位溴代苄基)胺基及二(邻、对、间位碘代苄基)胺基中的一种。

本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

1)将带有R₁，R₂，R₃和R₄取代基的香豆素3-羰基化合物溶于干燥的有机溶剂中，在室温或回流温度下缓慢滴加带有R₅取代基的邻巯基苯胺，其中带有R₁，R₂，R₃和R₄取代基的香豆素3-羰基化合物与带有R₅取代基的邻巯基苯胺的摩尔比是1∶1～5；搅拌反应1～4小时后得到固体沉淀，过滤除去有机溶剂，真空干燥所得固体后得到式(II)的探针前体；

2)将步骤1得到的探针前体溶于干燥的有机溶剂中，在冰浴条件下，缓慢滴加HgX₂，其中探针前体与HgX₂的摩尔比是1∶1～2；室温搅拌反应4～16小时后得到红色固体沉淀，过滤后真空干燥红色固体，然后用有机溶剂扩散结晶，得到式(I)的红色针状晶体，即所述荧光探针；

所述的取代基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵及X的定义同上述发明内容中所述。

所述的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯及甲苯等中的一种以上。

本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针可用于生物体系中谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的检测，生物活细胞和活组织内的谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的检测。

本发明提供了一种以香豆素为母体、用于检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针。该荧光探针对谷胱甘肽还原酶和还原型谷胱甘肽，半胱氨酸，乙酰半胱氨酸，高胱氨酸，谷胱甘肽等生物活性巯基化合物有很好的选择性，其它氨基酸，蛋白质和酶对检测没有影响，溶液的荧光强度与生物活性巯基化合物的浓度在1×10^-7M到1×10^-5M的范围内有一定的线性关系，表现出了它良好的实际应用性；该系列探针分子结构简单，合成方法简单且效率高，易推广于实际检测。

附图说明

图1.本发明实施例1中荧光探针对谷胱甘肽还原酶与其它蛋白质的选择性识别；其中：

图1a是荧光探针分别加入到各种酶或蛋白质溶液中后的颜色变化(左数第二为谷胱甘肽还原酶)；图1b是荧光探针分别加入到各种酶或蛋白质溶液中后的荧光选择性；由左至右分别为：荧光探针I-1(HgL)，GR(谷胱甘肽还原酶)，pepsin(胃蛋白酶)，tripsin(胰蛋白酶)，catalase，BSA，protease(蛋白酶)，lysozyme，globulin(球蛋白)，protamine。

图2.本发明实施例1中荧光探针对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽GSH的选择性识别(图中左边黑色表示未加GSH的荧光探针I-1(HgL)溶液不发荧光，右边绿色表示加入GSH后荧光增强)。

图3.本发明实施例1中荧光探针的荧光强度对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽浓度的线性关系(相关系数R＝0.99685)。

具体实施方式

实施例1

(1)将2.5g 7-N，N-二乙氨基香豆素-3-醛溶于干燥甲醇中，搅拌回流反应下缓慢滴加3.5g邻巯基苯胺，搅拌回流反应5小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-1)，产率87％。

EI-MS，m/e，319.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将3g探针前体(II-1)溶于干燥三氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴加入2g HgCl₂，搅拌回流反应3小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用乙醇结晶，得到红色针状晶体荧光探针(I-1)，产率85％。EI-MS，m/e，590.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝490nm。

荧光探针I-1的结构

将荧光探针(I-1)分别加入到各种酶或蛋白质(见图1b)溶液中，由图1a可看出在各种酶和蛋白质溶液中加入荧光探针(I-1)后的颜色变化，左数第二为谷胱甘肽还原酶，颜色由橙色变为浅黄色，而其它酶和蛋白质溶液中在加入荧光探针(I-1)后无此变化，说明本发明的荧光探针具有选择性识别。

荧光探针(I-1)分别加入到各种酶或蛋白质溶液中后的荧光选择性见图1b；荧光探针对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽GSH的选择性识别见图2(图中左边黑色表示未加GSH的荧光探针I-1(HgL)溶液不发荧光，右边绿色表示加入GSH后荧光增强)；对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽浓度的线性关系见图3(相关系数R＝0.99685)。

实施例2

(1)2.7g 7-N，N-二甲氨基香豆素-3-醛溶于干燥甲醇中，室温搅拌下缓慢滴加5g邻巯基苯胺，回流搅拌反应8小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-2)，产率78％。

EI-MS，m/e，287.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将3.6g探针前体(II-2)溶于干燥三氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴加入2g HgCl₂，搅拌回流反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用四氢呋喃(THF)与乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-2)，产率90％。

EI-MS，m/e，558.1[M]⁺.λ^ab._max/nm＝487nm。

荧光探针I-2的结构

实施例3

(1)25g 7-N，N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥甲醇中，室温搅拌下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-3)，产率61％。

EI-MS，m/e，302.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-3)溶于干燥三氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-3)，产率87％。

EI-MS，m/e，573.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝481nm。

荧光探针(I-3)的结构

实施例4

(1)6.5g 7-N，N-二乙氨基-6，8-二甲基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加5g邻巯基苯胺，搅拌反应8小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-4)，产率72％。

EI-MS，m/e，347.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝392nm。

(2)将5.7g探针前体(II-4)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢滴加入3g HgCl₂，搅拌反应14小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-4)，产率79％。

EI-MS，m/e，618.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝472nm。

荧光探针(I-4)的结构

实施例5

7-(N-乙基-N’-苄基)胺基香豆素醛的合成参见文献(J.Am.Chem.Soc.2003，125，16174～16175)。

(1)6.5g 7-(N-乙基-N’-苄基)胺基香豆素醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加7g邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-5)，产率40％。

EI-MS，m/e，380.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝387nm，

(2)将5.7g探针前体II-5溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢滴加入3.4g HgCl₂，搅拌反应14小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-5)，产率76％。

EI-MS，m/e，651.3[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝473nm。

荧光探针(I-5)的结构

实施例6

(1)25g 7-N，N-二(ω-甲酯基己基)-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-6)，产率61％。

EI-MS，m/e，590.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm，

(2)将13g探针前体(II-6)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-6)，产率57％。

EI-MS，m/e，861.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝467nm。

荧光探针(I-6)的结构

实施例7

(1)25g 7-N，N-二(ω-甲酯基己基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-7)，产率46％。

EI-MS，m/e，634.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-7)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢滴加入14g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-7)，产率79％。

EI-MS，m/e，833.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝465nm。

荧光探针(I-7)的结构

实施例8

(1)25g 7-N，N-二(ω-甲酯基己基)-4-乙氧基香豆素-3-醛，室温搅拌下缓慢滴加15g 2-巯基-6-溴苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-8)，产率47％。

EI-MS，m/e，714.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-8)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢滴加入16g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到橙色针状晶体荧光探针(I-8)，产率43％。

EI-MS，m/e，911.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝463nm。

荧光探针(I-8)的结构

实施例9

(1)14g 7-N，N-二(5-羧基戊基胺基)-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，室温搅拌下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-6)，产率88％。

EI-MS，m/e，513.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-6)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入13g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶甲苯的混合液结晶(体积比3∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-9)，产率57％。

EI-MS，m/e，855.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝467nm。

荧光探针(I-9)的结构

实施例10

(1)25g 7-N，N-二(ω-羧基丙烷基)-4-叔戊氧基香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，搅拌室温下缓慢滴加43g邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-10)，产率46％。

EI-MS，m/e，1165[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-10)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入23g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-10)，产率69％。

EI-MS，m/e，841.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝468nm。

荧光探针(I-10)的结构

实施例11

(1)25g 7-N，N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，室温搅拌下缓慢滴加32g 4-甲基邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-11)，产率76％。

EI-MS，m/e，634.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝392nm。

(2)将13g探针前体(II-11)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入43g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-11)，产率18％。

EI-MS，m/e，905.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝463nm。

荧光探针(II-11)的结构

实施例12

(1)18g 7-N，N-二(5-羧基戊基胺基)-4-溴香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，室温搅拌下缓慢滴加32g2-巯基5-溴苯胺，搅拌反应3.5小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-12)，产率75％。

EI-MS，m/e，615.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-12)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用二氯甲烷∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-12)，产率57％。

EI-MS，m/e，840.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝467nm。

荧光探针(I-12)的结构

实施例13

(1)25g 7-N，N-二(ω-丙酯基十二烷基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，搅拌室温下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-13)，产率86％。

EI-MS，m/e，877.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-13)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用甲苯∶乙醚的混合液结晶(体积比3∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-13)，产率67％。

EI-MS，m/e，1148.3[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝488nm。

荧光探针(I-13)的结构

实施例14

(1)18g 7-N，N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，室温搅拌下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，搅拌反应2小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-14)，产率97％。

EI-MS，m/e，280.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将5.5g探针前体(II-14)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgSO4，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-14)，产率75％。

EI-MS，m/e，578.8[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝476nm。

荧光探针(I-14)的结构

实施例15

(1)14g 7-N，N-二(丙酯基丙胺基)-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥乙醚中，室温搅拌下缓慢滴加27g 2-巯基-4-氯苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-15)，产率61％。

EI-MS，m/e，863.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-15)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用DMF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-15)，产率74％。

EI-MS，m/e，897.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝468nm。

荧光探针(I-15)的结构

实施例16

(1)25g 7-N，N-二(ω-乙酯基庚基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于干燥二氯甲烷中，室温搅拌下缓慢滴加32g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-16)，产率46％。

EI-MS，m/e，878.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-16)溶于干燥二氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶甲苯的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-16)，产率74％。

EI-MS，m/e，859.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝478nm。

荧光探针(I-16)的结构

实施例17

(1)25g 7-N，N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加31g 2-巯基-5-氯苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-17)，产率57％。

EI-MS，m/e，726.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-17)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgCl₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶丙酮的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-17)，产率88％。

EI-MS，m/e，997.5[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝473nm。

荧光探针(I-17)的结构

实施例18

(1)46g 7-N，N-二乙基-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加53g 2-巯基-3-氟苯胺，搅拌反应2小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-18)，产率61％。

EI-MS，m/e，241.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-18)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用THF∶DMF的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-18)，产率84％。

EI-MS，m/e，621.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝467nm。

荧光探针(I-18)的结构

实施例19

(1)36g 7-N，N-二(4-乙氧基苄基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加54g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-19)，产率46％。

EI-MS，m/e，518.2[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-19)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用DMF∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-19)，产率87％。

EI-MS，m/e，861.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝468nm。

荧光探针(I-19)的结构

实施例20

(1)43g 7-N，N-二苄基-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下缓慢滴加33g2-巯基-4-氯苯胺，搅拌反应3小时后过滤，常温真空干燥所得固体后得探针前体(II-20)，产率57％。

EI-MS，m/e，474.1[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝390nm。

(2)将13g探针前体(II-20)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入10g HgBr₂，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体，然后用丙酮∶乙醚的混合液结晶(体积比2∶1)，得到红色针状晶体荧光探针(I-20)，产率25％。

EI-MS，m/e，835.0[M+1]⁺.λ^ab._max/nm＝463nm。

荧光探针(I-20)的结构

应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下，本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例方案所进行的一定的改变，都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。