一种ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一至几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有ADP－葡萄糖焦磷酸化酶活性的由1)衍生的蛋白质。本发明的玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因将在玉米的品种改良中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因与应用，特别是涉及来源于玉米胚乳的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因与应用。

背景技术

淀粉作为一种在工业生产和人类生活中不可替代的物质资源，在人类生产和生活中占有十分重要的地位，因此科研人员对于淀粉合成的研究投入了极大的热情，并且从未间断过。在过去的很长一段时间里，为了能够满足持续增长的世界人口所带来的粮食需求和工业原料供给，人们仅仅致力于提高农作物(如玉米、小麦、水稻等)的产量。然而，随着社会的飞速发展和人们生活水平的不断提高，同时从环境保护和可持续发展的角度出发，对农作物中淀粉含量和质量的要求也会日益增加和提高。此外，由于淀粉含量高的植物细胞或器官吸收脂肪或煎炸油量少，因此食品工业上淀粉可用于生产低热量的“更健康”的食品。同时医药工业应用淀粉为原料生产抗生素和维生素；铸造工业应用淀粉为砂芯胶粘剂；石油工业油井钻泥中应用淀粉使其具有蓄水性；干电池中应用淀粉为电解质载体等。其他诸如油漆、塑料、染料、纺织、造纸、轮胎橡胶等行业，均将淀粉作为必需的材料，淀粉也是制作各类变性淀粉的起始材料。研究发现，大米、麦子及玉蜀黍等农作物中均富含淀粉。但据统计，全世界生产和生活所用淀粉80％以上来源于玉米。在美国这一比例更是高达95％以上。我国在高淀粉玉米方面的研究还存在许多欠缺之处。因此，加速工业用高淀粉玉米品种的培育和改良已势在必行。

在生物体内，淀粉的合成过程涉及到一系列酶的共同参与，如：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucose pyrophosphorylase，AGPase)、淀粉合成酶(strarchsynthase，SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，SBE)和淀粉去分支酶(starchdebranching enzyme，DBE)等。其中，AGPase是细菌糖原和植物淀粉合成的关键酶，它能够催化1-磷酸葡萄糖(1-P-Glucose)和腺苷三磷酸(ATP)生成腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)和焦磷酸(PPi)。同时，ADPG作为淀粉合成的前体物质在淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶等的协同作用下合成直链淀粉和支链淀粉。因此，AGPase活性的高低是决定淀粉积累速率的关键因素之一。提高AGPase活性以促进还原糖向淀粉合成方向的转化，是提高作物淀粉含量、实现品质改良的重要途径。在高等植物中，AGPase具有复杂的异源四聚体结构。到目前为止，已从玉米、小麦、菠菜、甜菜、拟南芥、大麦和马铃薯等多种植物中得到分离纯化到AGPase。

AGPase活性的高低受多种因素共同调控。其中别构调节是一种重要的调节方式，该方式通过调节激活剂3-磷酸甘油酸(3-PGA)和抑制剂无机磷(Pi)的比例来达到控制酶活性的目的。1969年，Cattaneo等(Cattaneo J，O.M.，Sigal N，Sanchez-Medina G，Puig J.Genitic studies of E.coli K12 mutants with alterations inglycogenesis and properties of an altered AGPase.Biochem Biophys Res Commun.1969，34：694-701.)发现了大肠杆菌(E.coli)K12株系中的一个突变菌株，其糖原含量比野生型菌株提高了33％以上。进一步研究证实，突变体糖原含量提高的原因是由于控制糖原合成的关键酶AGPase发生了突变，改变了该酶对别构调节剂的反应，即对别构调节不敏感(Lee Y M，K.A.，Preiss J.Amino acid sequence of an E.coliADPglucose synthetase allostefric mutants as deduced from the DNA sequence of theglgC gene.Nucleic Acids Res，1987，15：10603.)。1992年，Monsanto公司的Stark等人(David M.Stark，Kurt P.Timmerman et al.Regulation of the amount of starch in planttissues by AGP ase.Science，258：287-291.)将突变的AGPase基因转入马铃薯中，获得了淀粉含量提高的转基因马铃薯。该转基因马铃薯中淀粉平均含量比对照提高了35％，有的甚至高达60％，这是利用基因工程手段提高植物淀粉含量的第一个成功的例子。

环境因素(尤其是温度)对AGPase活性的影响也是不容忽视的重要因素之一。研究证实，玉米胚乳AGPase是一种热不稳定酶，耐热性低，温度的变化能够显著地影响AGPase的活性。Hannah等(Hannah L，Tuschall D，Mans R.Multiple forms ofmaize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase and their control by shrunken-2 andbrittle-2.Genetics.1980，95，961-970.)通过实验证实，57℃热处理5分钟后，玉米胚乳AGPase活性丧失了96％以上。AGPase作为植物中淀粉生物合成的限速酶，高温能够显著地降低AGPase活性的同时也减少了淀粉的合成与积累，谷物的产量也随之降低。Green等(Greene，T.W.and L.C.Hannah.Enhanced stability of maizeendosperm ADP-glucose pyrophosphorylase is gained through mutants that alter subunitinteractions.″Proc Natl Acad Sci USA.1998，95(22)：13342-13347.)利用突变技术得到了一个AGPase热稳定性提高的突变体，分析结果表明该突变体热稳定性提高的原因是由于AGPase大小亚基之间相互作用得到了增强。

虽然玉米胚乳的AGPase与马铃薯块茎和菠菜叶来源的AGPases在氨基酸序列上具有很高的同源性，但在亚细胞定位、调控性质以及热稳定性等方面，玉米胚乳的AGPase与马铃薯块茎和菠菜叶来源的AGPase却存在着很大的区别，如：马铃薯块茎AGPase定位于储藏器官的淀粉体内，而玉米胚乳的AGPase主要定位于淀粉体外的胞质中；马铃薯块茎AGPase对激活剂和抑制剂相当敏感，在没有激活剂存在的情况下，其活性可以忽略不计(检测活性比较困难)，而玉米胚乳AGPase则不同，在无激活剂存在的情况下，酶活性仍然较高，而且激活剂的存在可以部分弥补抑制剂对活性的影响；此外，马铃薯AGPase可以受不同水平的调控，如转录水平、转录后水平以及翻译后还原修饰调控等，而在玉米的籽粒中，AGPase的大小亚基的含量变化与其编码基因Shrunken-2和Brittle-2的转录水平一致，目前还没有发现其它水平的调控。

在热稳定性方面，Ballicora等(Ballicora MA，Laughlin MJ，Fu Y，Okita Tw，BarryGF，Preiss J.Adenosine 5′-diphosphate-glucose pyrophosphorylase from potato tuber.Significance of the N terminus of the small subunit for catalytic properties and heatstability.Plant Physiol.1995，109：245-21)研究发现，马铃薯块茎中的AGPase能够具备很好的热稳定性是由于在AGPase两个小亚基的N端均有半胱氨酸。随后，经过进一步研究，Ballicora等(Ballicora MA，Fu Y，Frueauf JB，Preiss J.Heat stability ofpotato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase：role of Cys residue 12in the small subunit.Biochem Biophys Res Commun.1999，257：782-786)发现半胱氨酸的存在使得两个小亚基之间形成了稳定的二硫键结构，这就更好地解释了马铃薯块茎中的AGPase在高温下仍有很好稳定性的原因。然而，玉米胚乳中的AGPase的大小亚基上均没有发现由半胱氨酸所形成的二硫键结构。因此，对玉米胚乳AGPase的深入研究不但有助于揭示单子叶植物与双子叶植物在淀粉合成途径中的异同点，而且有利于通过转基因技术进一步提高玉米中的淀粉含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因。

本发明所提供的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体，名称为AGPase-120-33，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的序列1由475个氨基酸残基组成，与野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)相比，自氨基末端第458位由Gly突变为Asp，自氨基末端第462位由Thr突变为Ile，自氨基末端第323位由Ile突变为Met，自氨基末端第449位由Met突变为Arg。

上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体AGPase-120-33的编码基因也属于本发明的保护范围。

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体AGPase-120-33的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

2)编码序列表中的序列1的氨基酸序列；

3)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体AGPase-120-33的DNA分子；

4)与1)的基因具有90％以上的同源性，且编码上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体AGPase-120-33的DNA分子。

上述严格条件可为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列2由1428个碱基组成，其编码序列为自其5’末端第1-1428位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-120-33的重组载体、转基因细胞系和重组菌，以及扩增AGPase-120-33基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区等均具有类似功能。

使用AGPase-120-33构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是人工合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

具体来讲，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pCAMBIA2301、pBI121、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明AGPase-120-33的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导或农杆菌介导等常规生物学方法转化玉米组织或细胞，并将转化的玉米组织或细胞培育成植株。

本发明的另一个目的是提供一种在高温环境下仍能够提高植物种子中淀粉含量的方法。

本发明所提供的在高温环境下仍能够提高植物种子中淀粉含量的方法，是将上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-120-33导入植物组织或细胞中，得到淀粉含量提高的植物种子。

上述植物优选为单子叶植物，如玉米。

所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-120-33可通过含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-120-33的植物表达载体导入玉米组织或细胞。

经检测，本发明的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体AGPase-120-33经高温处理后，在大肠杆菌中积累糖原的能力比野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶显著提高；电镜实验发现，转入ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体AGPase-120-33的大肠杆菌中，糖原合成量显著高于转入野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的大肠杆菌；动力学及调控性质分析结果表明，该突变体对底物(ATP和G-1-P)的亲和力增强，但对激活剂和抑制剂的敏感性与野生型玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶相同，该突变体对底物亲和力的增强是该突变体酶活提高及糖原积累能力提高的主要原因。由于AGPase是细菌糖原和植物淀粉合成的关键酶，能够催化1-磷酸葡萄糖(1-P-Glucose)和腺苷三磷酸(ATP)生成腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)和焦磷酸(PPi)。同时，ADPG作为淀粉合成的前体物质在淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶等的协同作用下合成直链淀粉和支链淀粉。所以，玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的高低决定了细菌中糖原和植物中淀粉含量的高低。本发明的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体将在玉米的品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为玉米胚乳AGPase大小亚基基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为玉米胚乳AGPase大小亚基基因原核表达载体pGEX-KG-Sh2-Bt2的结构示意图

图3为大肠杆菌突变菌株BL21-dglgC经PCR反应和碘染色鉴定的结果

图4为玉米胚乳AGPase大小亚基经随机突变后的第一轮筛选结果

图5为突变体10-3和10-3-53与对照菌的碘染色深浅比较结果

图6为玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因的第三轮碘染色筛选结果

图7为含有玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因的大肠杆菌与对照菌株在37℃和44℃的碘染色筛选结果

图8为转入玉米胚乳AGPase大亚基基因和小亚基突变体基因的大肠杆菌的糖原含量检测结果

图9为电镜观察转基因大肠杆菌中的糖原积累情况

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成和测序工作均由上海生工完成。

实施例1、玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因的获得

一、玉米胚乳AGPase大、小亚基cDNA的获得

1、引物设计

根据玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2和小亚基基因Brittle-2的cDNA序列(GenBank号分别为：M81603，AF334959)设计两对RT-PCR引物(Sh和Bt)。同时为了便于载体构建，在设计引物时针对以下2点做了特殊设计：a.在Shrunken-2的5’端添加限制性内切酶Nde I的识别位点，3’端添加限制性内切酶Sma I和SacI的识别位点；b.因Brittle-2的5’端ATG的位置存在一个限制性内切酶Nco I识别位点，于是将Brittle-2自5’端第39位的A突变为C，去掉在该位点存在的第二个NcoI识别位点，并在Brittle-2的3’端添加限制性内切酶Sac I识别位点，扩增玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2 cDNA的引物对Sh为Sh2F：5’-CCCATATGCAGTTTGCACTTGCATTGGACACG-3’和Sh2R：5’-GAGAGCTCCCCGGGCTATATGACAGACCCATCGTTGATG-3’；扩增玉米胚乳AGPase小亚基Brittle-2cDNA的引物对Bt为Bt2F：5’-CAAACCATGGACATGGCTTTGGCGTCTAAAGCCTCCCCTCCGCCCTGGAATGCCACCGCCGCCG-3’和Bt2R：5’-GAGCTCTCATATAACTGTTCCACTAGGGAGTAAAGC-3’。

2、第一链cDNA的合成

用Trizol RNA提取试剂盒(购自天为时代公司)并参照试剂盒说明书提取授粉后18天玉米综31种子中(Xiaoping Chen，Zhangying Wang，Jianhua Wang，MaoyanWang，Li Zhao，Guoying Wang.Isolation and characterization of Brittle 2 promoter fromZea Mays and its comparison with Ze19 promoter in transgenic tobacco plants.PlantCell Tiss Organ Cult(2007)88：11-20.中国农业大学)的总RNA，并以此为模板反转录合成其第一链cDNA：取1μL Oligo(dT)₁₈加到10μL浓度为200ng/μL的总RNA溶液中，70℃反应5分钟后置于冰上冷却5分钟，然后用Promega公司的AMV ReverseTranscriptase并参照说明书加入以下成分：5×反转录缓冲液(试剂盒自带)5μL，dNTPs(每种10mM)2.5μL，RNasin核糖核酸酶抑制剂(浓度为50U/μL)1μL，AMV反转录酶(30U/μL)3μL，用DEPC处理水定容至25μL。反应条件为：室温10min，42℃60min，70℃10min，冰浴2min。

3、PCR扩增

以步骤2合成的第一链cDNA为模板，分别在引物对Sh和引物对Bt的引导下，PCR扩增Shrunken-2和Brittle-2的cDNA，反应体系为：10×缓冲液5μL，dNTPs(每种10mM)1μL，引物Sh2F(Bt2F)(浓度为10μM)1μL，引物Sh2R(Bt2R)(浓度为10μM)1μL，Ex-Taq(5U/μL，TaKaRa公司)1μL，第一链cDNA(浓度为10ng/uL)5μL，用灭菌水定容至50μL。PCR反应条件为：先94℃ 5min；然后94℃ 1min，62℃ 45s，72℃ 2min，10个循环；再94℃ 1min，65℃ 45s，72℃ 2min，25个循环；最后72℃ 10min，4℃保存。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。其中，M为1Kb的DNA分子量标准。泳道Sh2为PCR扩增的Shrunken-2，泳道Bt2为PCR扩增的Brittle-2，经PCR反应扩增出约1.5kbp的Shrunken-2cDNA片段和1.4kbp的Brittle-2cDNA片段，与预期结果相符。回收并纯化这两个目的片段，将其分别克隆入载体-TEasy(购自Promega公司)中，对含有Shrunken-2的cDNA片段的克隆载体用限制性内切酶BamH I和Sma I进行双酶切鉴定，经酶切获得了1.5kbp和3.0kbp的DNA片段，与预期结果相符；对含有Brittle-2的cDNA片段的克隆载体用限制性内切酶EcoR I进行单酶切鉴定，经酶切获得了1.4kbp的DNA片段，与预期结果相符；再将上述克隆质粒进行测序，测序结果表明，除了预期的Brittle-2自5’端第39位的碱基A突变为C外，其它序列均与GenBank上登录的序列一致，表明经RT-PCR扩增获得序列正确的玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2和小亚基基因Brittle-2的cDNA。

二、玉米胚乳AGPase大小亚基基因及其突变体在无glgC活性的大肠杆菌突变菌株中的异源表达

1、原核表达载体pGEX-KG多克隆位点的改造

由于马铃薯块茎AGPase大小亚基的N端和C端对该酶的调控性质起到重要作用，所以为使玉米胚乳AGPase大小亚基基因在利用载体pGEX-KG(购自Invitrogen公司，该载体的物理图谱参见文献，Guan KL，Dixon JE.Eukaryotic proteins expressedin Escherichia coli：an improved thrombin cleavage and purification procedure of fusionproteins with glutathione S-transferase.Anal Biochem.1991，192(2)：262-7)进行原核表达时不产生融合蛋白，现对该载体进行改造，使载体上的GST蛋白既能提前终止表达，不产生融合蛋白，又不影响目的蛋白的表达，设计的多克隆位点(MCS)如下：

CTA  GGA  TCC  TAA  TAA  CCG  GGC  AGG  TCT  AGA  CCA  TGG  GAG  CTC

      BamHl    stop codon                Xbal       Ncol      Sacl

CAC  CAC  CAC  CAC  CAC  CAC  AAG  CTT  ACC

           His Tag             HindIII

合成该多克隆位点片段，对其用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切后，与经相同酶双酶切的原核表达载体pGEX-KG用T4 DNA连接酶相连，连接体系及反应条件如下：10×连接酶缓冲液2ul，pGEX-KG BamH I和Hind III双酶切片段2ul，MCS BamH I和Hind III双酶切片段10ul，T4DNA连接酶(TaKaRa公司)1ul，灭菌蒸馏水5ul，16℃连接12-24小时。反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞在37℃下培养12-24小时，挑取在LB抗性平板(含100mg/L氨苄青霉素)上长出的单克隆，提质粒，分别用限制性内切酶BamH I、EcoRI、Xho I和Xba I进行单酶切鉴定，结果与预期结果相符。再挑取其中一个单克隆进行测序，测序结果表明新合成的多克隆位点片段替代了原载体中的多克隆位点，将改造后的载体pGEX-KG命名为pGEX-KG1。

2、玉米胚乳AGPase大小亚基基因原核表达载体的构建

对步骤一扩增的玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2的cDNA用限制性内切酶Nde I和Sac I进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET30a(+)(购自Novagen公司)连接，得到含有Shrunken-2 cDNA的重组载体，命名为pET30Sh2；对步骤一扩增的玉米胚乳AGPase小亚基基因Brittle-2的cDNA用限制性内切酶NcoI和SacI进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET28a(+)(购自Novagen公司)，得到含有Brittie-2 cDNA的重组载体，命名为pET28Bt2；再以pET28Bt2为模板，在引物SD：5’-CGGAGCTCTTTAAGAAGGAGATATACC-3’和Bt2R的引导下，PCR扩增Brittle-2的cDNA及其上游的核糖体结合位点，扩增结束后，回收约3.0kbp的目的片段，将其用限制性内切酶Sac I进行单酶切后，与经相同酶酶切的重组载体pET30Sh2连接，经鉴定后，得到连接有玉米胚乳AGPase大小亚基基因及各自核糖体结合位点的重组载体，命名为pET30Sh2-Bt2；最后用限制性内切酶Xba I和Sac I对pET30Sh2-Bt2进行双酶切，回收并纯化约3.0kbp的具有各自核糖体结合位点的玉米胚乳AGPase大小亚基基因，将其命名为AGPase-Sh2-Bt2。将AGPase-Sh2-Bt2与经相同酶双酶切的载体pGEX-KG1连接，得到玉米胚乳AGPase大小亚基基因的原核表达载体，命名为pGEX-KG-Sh2-Bt2，其结构示意图见图2。

3、大肠杆菌glgC突变菌株BL21-dglgC的获得

通过同源重组的方法，将适于原核表达的大肠杆菌BL21(DE3，购自北京天为时代公司)中的glgC基因缺失突变，以便使玉米AGPase大小亚基在其中异源表达时，消除该菌株本身产生的糖原所形成的背景色。

提取大肠杆菌BL21(DE3)的DNA并以其为模板，运用cross-over PCR技术，用引物No-SmaI(No-SmaI：5’-TGTCCCGGGCGTTGTTGCTCTCCCAGGGT-3’)和Ni(Ni：5’-CCCATCCACTAAACTTAAACACTTCTCTAAACTAACCATGA-3’)扩增BL21(DE3)的glgC基因上游序列，用引物Ci(Ci：5’-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGACGGAAGTTAGGGCATAAACAGG-3’)和Co-SalI(Co-SalI：5’-GGCCGTCGACTGCACAGTAAACACCGACTT-3’)扩增glgC基因的下游序列。对PCR扩增产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶回收试剂盒(购自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)分别回收目的片段，即得到含有glgC基因上游序列的DNA片段和含有glgC基因下游序列的DNA片段。将两个DNA片段各取2μL混匀，并以此为模板，用No-SmaI和Co-SalI为引物进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃ 10min；然后94℃ 5min，60℃ 5min，72℃ 10min，1个循环；再94℃ 1min，65℃45s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃ 10min，4℃保存。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物经Sma I和SalI双酶切后，连到经同样酶切的pKOV载体(WU Wu-Wei，WANG Jing-Wen，XIE Fei，LONG Qing-Xin，WANG Xun-Zhang。Baculovirus p74Gene is a Species-specific Gene。ACTA BIOCHIMICA et BIOPHYSICA SINICA 2003，35(9)：864-872。中国农业大学)上，连接产物转化大肠杆菌BL21筛选无glgC活性的大肠杆菌突变菌株。将筛选得到的无glgC活性的大肠杆菌突变菌株命名为BL21-dglgC。大肠杆菌突变菌株BL21-dglgC经PCR反应和碘染色鉴定的结果如图3所示。图3A为大肠杆菌突变菌株BL21-dglgC PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，其中M为1Kb的DNA分子量标准，泳道1、3、4和6为未转基因的大肠杆菌BL21(DE3)PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果，泳道2、5和7为大肠杆菌突变菌株BL21-dglgCPCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；图3B为大肠杆菌突变菌株BL21-dglgC的碘染色鉴定结果，其中mt2、mt5和mt7为大肠杆菌突变菌株BL21-dglgC的碘染色鉴定结果，wt为未转基因的大肠杆菌BL21(DE3)的碘染色鉴定结果。

4、玉米胚乳AGPase大小亚基的随机突变

盐酸羟胺突变剂：0.2084g盐酸羟胺，1.488mL ddH₂O，1.2mL 125mM焦磷酸钠(pH7.0)，0.3mL 1M NaCl，12μl 500mM EDTA(pH 8.0)。

用限制性内切酶Nde I和Sac I对pGEX-KG-Sh2-Bt2进行双酶切，回收并纯化约3.0kbp的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA片段，然后取盐酸羟胺突变剂1-3mL，将纯化的待突变的20-30μg玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA片段加到1mL突变剂溶液中，75℃温浴条件下进行随机突变，分别于10、20、30、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130分钟时各取出50ul，立即放置冰上，待样品取完后，统一回收DNA片断，然后将随机突变片段连接入原核表达载体pGEX-KG1中，电转化大肠杆菌glgC突变菌株BL21-dglgC。

挑取上述转入玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因菌株的单菌落，接种于2mLLB液体培养基中，37℃振荡培养12-24小时。然后于Conberg加富培养基(磷酸二氢钾8.5g，磷酸氢二钾11g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，琼脂15g，用水定容至1L，最终pH7)上进行划线，37℃培养12-24小时，用碘-碘化钾(I₂-KI)溶液(0.1mol/L碘和0.3mol/L碘化钾)进行染色，根据染色结果筛选突变菌株。

进行第一轮筛选时，大部分突变菌株经碘染色后呈浅黄色；一部分突变菌株经染色后的颜色与转化有野生型玉米胚乳AGPase大小亚基的大肠杆菌glgC突变菌株(对照)相似，呈棕色，只有少量的突变菌株经染色后变成深棕色。此轮筛选共挑选出大约12000个单克隆，接种于96孔板中，37℃下振荡培养12-24小时，然后划线于Conberg加富培养基上，再37℃培养12-24小时，用碘染色法进行筛选，经3轮筛选后，获得了2个碘染色颜色比对照深的突变菌株，分别命名为8-2和10-3。第一轮筛选的最后结果如图4所示，其中CK为未转入外源基因的大肠杆菌。

提取筛选到的2个突变菌株的质粒，进行测序。测序结果表明10-3和8-2均是野生型玉米胚乳AGPase小亚基基因Brittle-2的自5’端第1345-1347位由编码Met的碱基突变为编码Arg的碱基。

再以突变菌株10-3为原始材料，用与上述相同的方法进行第二次随机突变，以获得活性更高的突变菌株。结果共获得了4个较好的突变菌株，分别命名为10-3-14、10-3-24、10-3-33和10-3-53。经重复实验，突变菌株10-3-53重复性较好，其中，突变菌株10-3-53与突变菌株10-3及对照菌株(CK)的碘染色情况如图5所示，图5中10-3表示突变菌株10-3的染色情况，53表示突变菌株10-3-53的染色情况，CK表示对照菌株的染色情况。

提取突变菌株10-3-53的质粒，测序，结果该突变株中的玉米胚乳AGPase小亚基突变体基因是在突变菌株10-3的玉米胚乳AGPase小亚基基因的基础上突变的，与野生型玉米胚乳AGPase小亚基基因相比，自5’末端第967-969位碱基编码突变氨基酸残基Met，自5’末端第1345-1347位碱基编码突变氨基酸残基Arg。突变菌株10-3-53中所含的玉米胚乳AGPase小亚基基因(名称为AGPase-10-3-53)的核苷酸序列是序列表中的序列3。

再以突变菌株10-3-53为原始材料，用与上述相同的方法进行第三次随机突变，以获得活性更高的突变菌株。结果共获得了4个碘染色颜色比对照深的突变菌株，分别命名为120、60、30和7，第三轮筛选的结果如图6所示。

以突变菌株120和30为原始材料，用与上述相同的方法进行第四次随机突变，突变温度变为44℃，以获得耐高温且酶活性高的突变菌株。结果仅获得了2个较好的突变菌株，分别命名为120-33和30-18。经三次重复实验，突变菌株120-33重复性较好。具体的染色情况如图7所示。其中，4为突变菌株10-3-53，5为突变菌株120-33，6为突变菌株30-7，7为突变菌株30-17，8为突变菌株30-18。

提取突变菌株120-33的质粒进行测序，结果发现，该突变菌株120-33的玉米胚乳AGPase小亚基的编码基因是在突变菌株10-3-53的玉米胚乳AGPase小亚基编码基因的基础上突变的，与突变菌株10-3-53相比，自5’末端第1372-1374位碱基编码突变氨基酸残基Asp，自5’端第1384-1386位碱基编码突变氨基酸残基Ile。突变菌株120-33中所含有的玉米胚乳AGPase小亚基基因(名称为AGPase-120-33)的核苷酸序列是序列表中的序列2，由1428个碱基组成，编码序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质，将该蛋白命名为AGPase-120-33。AGPase-120-33是将上述玉米胚乳AGPase小亚基基因突变体基因AGPase-10-3-53自5’端第1372-1374位由编码Gly的碱基突变为编码Asp的碱基，自5’端第1384-1386位由编码Thr的碱基突变为编码Ile的碱基，自序列2的5′末端第1-1428位为AGPase-120-33的编码基因。

实施例2、转基因大肠杆菌中玉米胚乳AGPase突变体糖原含量测定

1、玉米胚乳AGPase突变体载体的构建

分别人工合成玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-120-33和AGPase-10-3-53的小亚基基因Bt2，在其5’端分别引入NcoI酶切位点，在其3’端引入Sac I酶切位点。将合成的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-120-33和AGPase-10-3-53的小亚基基因Bt2分别用Nco I和Sac I进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收目的条带。将实施例1构建的载体pGEX-KG-Sh2-Bt2同时用Nco I和Sac I进行双酶切，将去除小亚基基因Bt2后的6.5Kb的大片段切胶回收。然后用T4DNA连接酶(大片段1μl，小亚基基因片段7μl，T4DNA ligase 1μl，ddH₂O 1μl，16℃12小时)将大小两个片段进行连接，构建玉米胚乳AGPase大小亚基突变体AGPase-120-33和AGPase-10-3-53的载体。

2、玉米胚乳AGPase突变体糖原含量测定

将实例1中构建的野生型玉米胚乳AGPase大小亚基基因载体和上述步骤1构建的玉米胚乳AGPase大小亚基突变体AGPase-120-33和AGPase-10-3-53的载体转化实施例1获得的大肠杆菌glgC突变菌株BL21-dglgC。分别挑取上述转入野生型玉米胚乳AGPase大小亚基基因的大肠杆菌glgC突变菌株pGEX-SB、转入玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因AGPase-120-33的大肠杆菌glgC突变菌株120-33和转入玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因AGPase-10-3-53的大肠杆菌glgC突变菌株10-3-53的单菌落，接种于Conberg加富液体培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)中，44℃培养12-24小时，然后12000rpm离心10min，收集菌体，称重后用蒸馏水重悬菌体，再在100℃下培养15min，然后加入DMSO和盐酸，60℃培养30min，用0.5M NaOH溶液调培养液pH值至4.5，加3-5U的淀粉糖苷酶，在醋酸钠(含有50mM醋酸纳，pH 5.2)培养缓冲液中，55℃反应40min降解糖原，然后按葡萄糖的测定方法测定由糖原降解产生的葡萄糖含量：加10μl培养物于250ul糖反应缓冲液(100mM pH6.9 Imidazao-HCl，5mM MgCl₂，2mM NAD，1mM ATP)中，加入1-2μl(1-2μ/μl)6-磷酸葡萄糖脱氢酶，室温反应10min，在340nm波长测吸光值，加入1-2μl己糖激酶(Hexokinase，HK)，测葡萄糖含量。

实验设三次重复，糖原含量的具体测定结果如图8所示。其中，突变株10-3-53的糖原含量为0.5μm/L，突变株120-33的糖原含量为1.58μm/L。这个结果与实施例1的碘染色结果基本一致，即碘染色浅的菌株其糖原含量低，而碘染色深的菌株其糖原含量相对较高。上述检测结果表明，与野生型玉米胚乳AGPase相比，高温环境下本发明的玉米胚乳AGPase突变体的活性得到了提高，而且其在大肠杆菌中积累糖原的能力也得到了相应的提高。

3、电镜观察转基因大肠杆菌中糖原积累量

挑取转入野生型玉米胚乳AGPase大小亚基基因的大肠杆菌glgC突变菌株pGEX-SB、转入玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因AGPase-120-33的大肠杆菌glgC突变菌株120-33和转入玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因AGPase-10-3-53的大肠杆菌glgC突变菌株10-3-53的单菌落，分别在44℃往复振荡摇床中培养至稳定期。用含有4％戊二醛的0.1M二甲砷酸盐缓冲液(PH 7.3)在4℃下预固定2小时，随后用含有0.25M蔗糖的0.1M二甲砷酸盐缓冲液洗涤两次。再用含有1％锇酸的磷酸盐缓冲液(PH 7.3)在4℃下固定2.5小时，随后用巴比妥(PH 7.4)洗两次。将菌体包埋在Epon-812中，进行超薄切片后将切片放于镍载网上。为了提高嗜碘的多聚糖细菌显色效果，将切片在室温下用1％高碘酸钠处理30分钟，然后用亚氯酸钠处理10分钟，再用超纯水洗涤三次。最后用乙酸双氧铀和柠檬酸铅分别后着色30分钟和15分钟。电镜下观察染色结果如图9所示。结果表明，经过高温染色处理后，突变株120-33在高温处理后糖原积累明显，仍然能够积累很多糖原，而突变株10-3-53和pGEX-SB则在高温下糖原积累量明显减少，说明高温能够抑制突变株10-3-53和pGEX-SB中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的酶活，而对突变株120-33的影响却很小，高温对突变株120-33的酶活影响较小。

序列表

<160>3

<210>1

<211>475

<212>PRT

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>1

Met Asp Met Ala Leu Ala Ser Lys Ala Ser Pro Pro Pro Trp Asn Ala

1               5                   10                  15

Thr Ala Ala Glu Gln Leu Ile Pro Lys Arg Asp Lys Ala Ala Ala Asn

            20                  25                  30

Asp Ser Thr Tyr Leu Asn Pro Gln Ala His Asp Ser Val Leu Gly Ile

        35                  40                  45

Ile Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys

    50                  55                  60

Arg Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp

65                  70                  75                  80

Ile Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Ile Ser Lys Ile Tyr Val

                85                  90                  95

Leu Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala

            100                 105                 110

Tyr Gly Ser Asn Ile Gly Gly Tyr Lys Asn Glu Gly Phe Val Glu Val

        115                 120                 125

Leu Ala Ala Gln Gln Ser Pro Asp Asn Pro Asn Trp Phe Gln Gly Thr

    130                 135                 140

Ala Asp Ala Val Arg Gln Tyr Leu Trp Leu Phe Glu Glu His Asn Val

145                 150                 155                 160

Met Glu Phe Leu Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr

                165                 170                 175

Glu Lys Phe Ile Gln Ala His Arg Glu Thr Asn Ala Asp Ile Thr Val

            180                 185                 190

Ala Ala Leu Pro Met Asp Glu Lys Arg Ala Thr Ala Phe Gly Leu Met

        195                 200                 205

Lys Ile Asp Glu Glu Gly Arg Ile Ile Glu Phe Ala Glu Lys Pro Lys

    210                 215                 220

Gly Glu Gln Leu Lys Ala Met Met Val Asp Thr Thr Ile Leu Gly Leu

225                 230                 235                 240

Asp Asp Val Arg Ala Lys Glu Met Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Ile

                245                 250                 255

Tyr Val Phe Ser Lys Asp Val Met Leu Gln Leu Leu Arg Glu Gln Phe

            260                 265                 270

Pro Glu Ala Asn Asp Phe Gly Ser Glu Val Ile Pro Gly Ala Thr Ser

        275                 280                 285

Ile Gly Lys Arg Val Gln Ala Tyr Leu Tyr Asp Gly Tyr Trp Glu Asp

    290                 295                 300

Ile Gly Thr Ile Ala Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu GlyIle Thr Lys

305                 310                 315                 320

Lys Pro Met Pro Asp Phe Ser Phe Tyr Asp Arg Phe Ala Pro Ile Tyr

                325                 330                 335

Thr Gln Pro Arg His Leu Pro Pro Ser Lys Val Leu Asp Ala Asp Val

            340                 345                 350

Thr Asp Ser Val Ile Gly Glu Gly Cys Val Ile Lys Asn Cys Lys Ile

        355                 360                 365

Asn His Ser Val Val Gly Leu Arg Ser Cys Ile Ser Glu Gly Ala Ile

    370                 375                 380

Ile Glu Asp Ser Leu Leu Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Glu Ala

385                 390                 395                 400

Asp Lys Lys Leu Leu Ala Glu Lys Gly Gly Ile Pro Ile Gly Ile Gly

                405                 410                 415

Lys Asn Ser Cys Ile Arg Arg Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile

            420                 425                 430

Gly Asp Asn Val Lys Ile Leu Asn Ala Asp Asn Val Gln Glu Ala Ala

        435                 440                 445

Arg Glu Thr Asp Gly Tyr Phe Ile Lys Asp Gly Ile Val Ile Val Ile

    450                 455                 460

Lys Asp Ala Leu Leu Pro Ser Gly Thr Val Ile

465                 470                 475

<210>2

<211>1428

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>2

atggacatgg ctttggcgtc taaagcctcc cctccgccct ggaatgccac cgccgccgag    60

cagctaattc caaagcgtga caaagccgct gcaaatgatt caacatacct caatcctcaa    120

gctcatgata gtgttcttgg aatcattctg ggaggtggtg ctgggactag attgtacccc    180

ttgacaaaga agcgtgccaa gcctgcagtg ccattgggtg ccaactatag actgattgat    240

attcctgtca gcaattgtct caacagcaac atatccaaga tctatgtgct aacgcaattt    300

aactctgctt ccctcaaccg tcacctctca agagcctacg ggagcaacat tggagggtac    360

aagaatgaag ggtttgttga agtcttagct gcacagcaga gcccagataa tccaaactgg    420

tttcagggta ctgcagatgc tgtaaggcag tacttgtggt tgtttgagga gcataatgtg    480

atggaatttc taattcttgc tggcgatcac ctgtaccgga tggactatga aaagttcatt    540

caggcacaca gagaaacaaa tgctgatatt accgttgctg ccctaccgat ggatgagaaa    600

cgtgcaactg catttggcct catgaaaatt gatgaagaag ggaggatcat tgagtttgct    660

gagaaaccga aaggagagca gttgaaagca atgatggttg acaccaccat acttggcctt    720

gatgacgtga gggcaaagga aatgccttat attgctagca tgggtatcta tgttttcagc    780

aaagatgtaa tgcttcagct cctccgtgaa caatttcctg aagccaatga ctttggaagt    840

gaggttattc caggtgcaac cagcattgga aagagggttc aggcttatct gtatgatggt    900

tactgggaag atatcggtac cattgcggca ttttataatg caaacttggg aataaccaag    960

aagccaatgc cagatttcag cttctatgac cgttttgctc caatttatac acaacctcga    1020

cacctgccac cttcaaaggt tcttgatgct gatgtgacag acagtgttat tggtgaagga    1080

tgtgttatta aaaactgcaa gataaaccat tctgtagttg gactccgatc ttgcatatct    1140

gaaggtgcta tcatagagga cagtttacta atgggtgcgg actactatga gacagaagct    1200

gataaaaaac tccttgccga aaaaggtggc attcctattg gtattgggaa aaattcatgc    1260

atcaggagag caatcattga caagaatgct cgaattggag acaatgttaa gatactcaat    1320

gctgacaatg ttcaagaagc tgcaagggag acagacgggt acttcatcaa agatggaatt    1380

gtcatagtga tcaaggatgc tttactccct agtggaacag ttatatga                 1428

<210>3

<211>1428

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>3

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