细胞染色试剂及其配制方法和在细胞染色中的应用

摘要

本发明提供的细胞染色试剂，包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中：每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配制而成；每210毫升染色液包括：硫肼100.00毫克，叔丁醇液87.0毫升，5mol/L盐酸5.2毫升，1800毫克亚硫酸氢钠，余量为蒸馏水；每200毫升漂洗液包括：偏重亚硫酸钠1.0克，5mol/L盐酸2.0毫升，蒸馏水198.0毫升；每600毫升EA50染液包括：15毫升纯净水，亮绿0.3克，水溶性曙红Y2克，95％乙醇450毫升，纯甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷钨酸1克。本发明还提供了上述细胞染色试剂的配制方法及其在细胞染色中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能同时分别将细胞核与细胞质染上不同颜色的细胞染色试剂，及其配制方法和在细胞染色中的应用。

技术背景

近一个世纪以来，随着医学的发展，病理研究的深入，对细胞的定性和定量检测已成为医学上的常用方法。

细胞形态学分析就是对细胞进行定性检测的方法，通过在显微镜下观察脱落细胞的形态学特征来对细胞进行定性分析，以供是否作进一步病理分析作参考。为了对细胞进行观察，通常要先对整个细胞进行染色，令细胞膜、细胞质和细胞核可以容易的在显微镜下观察，常用的染色方法有：苏木精伊红染色法(同组织切片染色)、巴氏染色法、绍氏染色法、迈格吉染色等。在细胞形态学分析中仅有几种描述性的细胞特征(如很大的细胞核、很大的核浆比例或者颗粒化严重的细胞核等)，但是，这些观察都是主观的，不具有很好的重复性，而且细胞学家必须经过很好的训练才能正确地检测和诊断疾病。此外，由于此种观测方法主观因素太强，医生自身及医生之间存在着很大的差异，容易导致分析不够准确。虽然细胞形态学分析的诊断准确率只有60％左右，但在近一个世纪以来仍然在医学中得到了广泛的应用。

许多国家几十年的防癌普查结果证实，用巴氏涂片作为子宫颈癌的筛查方法可以及早对子宫颈癌发现和治疗，使子宫颈癌死亡率明显下降。然而，由于受取材方法、涂片制作、染色技巧、阅片水平等因素影响，导致巴氏细胞学方法假阴性率达15％～40％。巴氏方法的另一不足是与其它常规细胞病理学诊断方法一样，对子宫颈癌前病变的发展趋向无法进行预测评估。

自从1924年Feulgen(福尔根)等人建立了DNA-Feulgen染色方法以来，至今这种方法仍是DNA定量测定的主要染色方法之一。Feulgen染色是经典显示去氧核糖核酸的方法，其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基，醛基具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。近30年来，随着数码显微镜的发展，现在已经可以捕捉细胞图像到计算机内存，并对细胞进行非常精确的测量。特别有用的是利用DNA特异和化学计量的染色方法(即染色与细胞核DNA和含量成正比)对细胞核的DNA进行染色，可以测量细胞核的特征。例如福尔根染色在定量细胞学中得到了广泛的应用。利用这种方法就可以计算细胞核的DNA含量，从而计算出处于不同细胞周期的细胞数目比例，对不同的细胞类型进行检测和分类，以及对非整倍体细胞进行检测等等。DNA含量的变化可作为直接反映肿瘤增殖能力的重要生物学指标。细胞增殖取决于细胞核的DNA复制与细胞分裂。细胞癌变的本质是细胞迅速无限增殖和转移，测定细胞核DNA含量，可作为恶性肿瘤的客观指标。然而这种方法受制于DNA固定的好坏、染色的深浅及测定系统(扫描显微镜、数码相机、应用软件等)的品质，并且这种方法没有利用细胞形态学方面的信息，而这方面的信息对很多病例的诊断和预测有很大的作用。

因此，一般来说，这两种分析方法(定性和定量)有以下问题：1、细胞形态学定性分析的方法只基于细胞的形态学特征，依赖细胞学家的经验和技巧，误诊率非常高。2、DNA定量分析方法基于DNA特异的染色方法，依赖于细胞核的特征，不能提供任何关于细胞形态学方面的信息。

到目前为止，还没有一种方法可以同时进行细胞的形态学特征定性分析和DNA定量分析，然而，在许多疾病诊断过程中，为了提高准确率，需要同时进行定性和定量两方面检测，因此需要分别进行两次切片和染色，不仅十分麻烦，还增加病患的费用负担，而且，定性和定量检测的结果不能一一对应，比如说医生在观测细胞形态学特征是发现某个具有特异性的细胞，想得到该细胞的DNA定量分析数据以便进行对照确认时，却无法实现，因为无法在进行DNA定量分析的切片中找到对应的细胞以进行分析。

因此，为了同时进行细胞形态学分析和DNA的定量检测，亟需一种能同时将细胞核与细胞质、细胞膜染上不同颜色的细胞染色试剂及染色方法，本案油然而生。

发明内容

本发明的目的是提供一种能同时将细胞核与细胞质、细胞膜染上不同颜色的细胞染色试剂，以便于同时进行细胞形态学分析和DNA的定量检测。

本发明的再一目的是提供上述细胞染色试剂的配制方法。

本发明的目的还在于提供一种使用上述细胞染色试剂同时将细胞核与细胞质、细胞膜染上不同颜色的染色方法。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

细胞染色试剂，包括B.S液、染色液、漂洗液、EA50染液，其中：

每400毫升B.S液是由甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升配制而成；

每210毫升染色液包括：Thionin(硫肼)100.00毫克，叔丁醇液(分析纯)87.0毫升，5mol/L盐酸(分析纯)5.2毫升，1800毫克亚硫酸氢钠(分析纯)，余量为蒸馏水；

每200毫升漂洗液包括：偏重亚硫酸钠(分析纯)1.0克，5mol/L盐酸(分析纯)2.0毫升，蒸馏水198.0毫升；

每600毫升EA50染液包括：15毫升纯净水，亮绿0.3克，水溶性曙红Y 2克，95％乙醇450毫升，纯甲醇125毫升，冰醋酸10毫升，磷钨酸1克。

上述细胞染色试剂的配制方法如下：

B.S液的配制：甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均匀；

染色液的配制：精确称取Thionin(硫肼)100.00毫克，加入蒸馏水100.0毫升加热煮沸8～12分钟后冷却至45℃～55℃(夏季45℃～50℃)，加入叔丁醇液(分析纯)87.0毫升，混匀后再加入5mol/L盐酸(分析纯)5.2毫升，加入1800毫克亚硫酸氢钠(分析纯)，混合，加蒸馏水至210毫升后置磁力加热搅拌器上避光搅拌60分钟后，(搅拌环境温度在33℃～38℃)过滤后调PH至1.3～1.5(25℃)即可；5mol/L盐酸的配制：取420毫升盐酸(分析纯)原液加蒸馏水至1000.00毫升；

漂洗液的配制：称取偏重亚硫酸钠(分析纯)1.0克，加入5mol/L盐酸(分析纯)2.0毫升，加蒸馏水至200.0毫升，混合均匀，漂洗液应在使用前现配现用；

EA50染液的配制：a.用吸管吸取10毫升纯净水置于一只干净标本管中，用记号笔标记伊红，吸取5毫升纯净水置于另一只干净标本管中，用记号笔标记亮绿；b.称取亮绿0.3克倒入标记亮绿的标本管中，盖上盖子，用手摇晃直到亮绿完全溶解；c.称取水溶性曙红Y 2克倒入标记伊红的标本管中，盖上盖子，用手摇晃直到伊红完全溶解；d.量取95％乙醇450毫升倒入洗净的染色缸中，再量取纯甲醇125毫升倒入缸中；e.将溶解完全的亮绿液倒入缸中，将溶解完全的伊红液倒入缸中，吸取冰醋酸10毫升加入缸中，称取磷钨酸1克加入缸中，用搅棒搅动至混合均匀即可使用。

以上描述的细胞染色试剂各组分的体积和质量只是提供一种比例关系，并不表示本产品发明的各组分只能使用上述的体积和质量。

上述细胞染色试剂在细胞染色方法中的应用，包括以下步骤：

第1步，将制好的标本片自然干燥。

第2步，将干燥的标本片置入无水乙醇液内固定30分钟后，直接放入B.S液中固定60分钟，取出后用蒸馏水洗涤二次，再放入5mol/L的盐酸内酸化60分钟(酸化温度在22℃～25℃)，取出后用蒸馏水洗涤2次。

第3步，将经上述处理过的标本片放入染色缸内，加满染色液染色67分钟(染色温度在22℃～25℃)，倾出染液，用蒸馏水冲洗5～6次。

第4步，用漂洗液洗涤三次(第一次1～2分钟，第二次1～2分钟，第三次1～2分钟)，再用水洗涤2至3次。

第5步，进入复染，放入95％乙醇液内浸泡2～3分钟。

第6步，在巴氏染色液III(EA50染液)中染胞浆5～8分钟。

第7步，放入95％乙醇内浸泡2～3分钟。

第8步，在无水乙醇中浸泡两次每次2～3分钟。

第9步，将干燥的脱水片放入二甲苯原液缸内透明30～60秒。

第10步，将透明过的标本片用中性树胶加盖玻片封固。

采用上述方案后，本发明提供的细胞染色试剂，能使细胞核染上较深的颜色，而细胞质和细胞膜染上较浅的颜色，使得细胞被染色后，在显微镜捕捉到的图像中，深色的细胞核和浅色的细胞质和细胞膜都能清晰的呈现。这样，通过显微镜观察，在定量测定细胞核DNA的同时还能检测细胞的形态学特征用以定性分析，可以提高细胞检测及分类的准确性。

附图说明

图1是经染色处理后的细胞在显微镜下观测到的图像；

图2是条形码为145731的甩片在显微镜下观察的图像；

图3是条形码为145732的甩片在显微镜下观察的图像；

图4是条形码为145733的甩片在显微镜下观察的图像；

具体实施方式

以下提供一个具体实施例以详细说明本发明提供的细胞染色试剂的配制及使用方法，但并不用于限定本发明的权利范围。

染色试剂的配制：

B.S液的配制：甲醇320.0毫升，甲醛60.0毫升，冰乙酸20.0毫升，混合均匀；

染色液的配制：精确称取Thionin(硫肼)100.00毫克，加蒸馏水100.0毫升加热煮沸10分钟后冷却至45℃～55℃(夏季45℃～50℃)，加入叔丁醇液(分析纯)87.0毫升，混匀后再加入5mol/L盐酸(分析纯)5.2毫升，加入1800毫克亚硫酸氢钠(分析纯)，混合，加蒸馏水至210毫升后置磁力加热搅拌器上避光搅拌60分钟后，(搅拌环境温度在33℃～38℃)过滤后调PH至1.3～1.5(25℃)即可；5mol/L盐酸的配制：取420毫升盐酸(分析纯)原液加蒸馏水至1000.00毫升；

漂洗液的配制：称取偏重亚硫酸钠(分析纯)1.0克，加入5mol/L盐酸(分析纯)2.0毫升，加蒸馏水至200.0毫升，混合均匀，漂洗液应在使用前现配现用；

EA50染液的配制：(1)用吸管吸取10毫升纯净水置于一只干净标本管中，用记号笔标记伊红，吸取5毫升纯净水置于另一只干净标本管中，用记号笔标记亮绿；(2)称取亮绿0.3克倒入标记亮绿的标本管中，盖上盖子，用手摇晃直到亮绿完全溶解；(3)称取水溶性曙红Y2克倒入标记伊红的标本管中，盖上盖子，用手摇晃直到伊红完全溶解；(4)量取95％乙醇450毫升倒入洗净的染色缸中，再量取纯甲醇125毫升倒入缸中；(5)将溶解完全的亮绿液倒入缸中，将溶解完全的伊红液倒入缸中，吸取冰醋酸10毫升加入缸中，称取磷钨酸1克加入缸中，用搅棒搅动至混合均匀即可使用。

使用本发明提供的细胞染色试剂对细胞切片进行染色处理的具体步骤是：

第1步，将制好的标本片自然干燥。

第2步，将干燥的标本片置入无水乙醇液内固定30分钟后，直接放入B.S液中固定60分钟，取出后用蒸馏水洗涤二次，再放入5mol/L的盐酸内酸化60分钟(酸化温度在22℃～25℃)，取出后用蒸馏水洗涤二次。

第3步，将经上述处理过的标本片放入染色缸内，加满染色液染色67分钟(染色温度在22℃～25℃)，倾出染液，用蒸馏水冲洗6次。

第4步，用漂洗液洗涤三次(第一次1～2分钟，第二次1～2分钟，第三次1～2分钟)，再用水洗涤2至3次。

第5步，进入复染，放入95％乙醇液内浸泡2～3分钟。

第6步，在巴氏染色液III(EA50染液)中染胞浆5～8分钟。

第7步，放入95％乙醇内浸泡2～3分钟。

第8步，在无水乙醇中浸泡两次每次2～3分钟。

第9步，将干燥的脱水片放入二甲苯原液缸内透明30～60秒。

第10步，将透明过的标本片用中性树胶加盖玻片封固。

本发明提供的染色方法对细胞进行了复染，以使细胞质、细胞膜与细胞核分别被染上不同深浅的颜色以便观测(如图1所示)。

为保证本发明提供的染色试剂不会对细胞核的DNA定量测试造成影响，还进行了以下两项实验：

1、选取3例标本，编号分别为标本1，标本2和标本3，每例标本各做2张甩片，其中一张使用本发明提供的染色试剂进行复染，将细胞核与细胞质都染上颜色，另一张不经过复染，只对细胞核进行常规染色，得出细胞数Nomal/abnomal(正常/异常)与积分光密度值

(IOD)的对照。参见附表1是经过复染与没有经过复染的扫描结果对比。

附表1

参见图2至图4，采用本发明提供的染色方法对细胞切片进行染色后，在显微镜下观察，背景清楚，胞核染深蓝色，并且一个个清晰可见，胞浆多数呈红色，少量绿色。从附表1中的DNA检测数据来看，经过复染与没有经过复染的检测结果相近，说明此种染色试剂不会对细胞核的DNA定量检测产生影响。

2.选取5例标本，每例标本做1张甩片，先用常规方法对每例细胞切片进行细胞核染色，通过扫描得出DI值(DNA指数)；然后对细胞切片进行退染，退染后采用本发明提供的染色方法对每例细胞切片进行染色，通过扫描得出DI值(复染)。附表2是经扫描得出的41组细胞核DI值的对照。

附表2

以上每组细胞核的DI值是同一细胞核经常规方法染色(染色)及采用本发明提供的染色试剂染色(复染)后的细胞核DNA含量(DI值)的对比，统计学分析结果表明，第一组与第二组之间无统计学差异。

综上所述，本发明提供的细胞染色试剂能使细胞核染上较深的颜色，而细胞质和细胞膜染上较浅的颜色，使得细胞被染色后，在显微镜捕捉到的图像中，深色的细胞核和浅色的细胞质和细胞膜都能清晰的呈现。且采用本发明提供的染色方法对细胞进行染色后，在显微镜下观察，细胞核呈现较深的颜色，细胞质和细胞膜呈现较浅的颜色，都能清晰呈现，且不会对细胞核的DNA定量测定造成影响。这样，通过显微镜观察，在定量测定细胞核DNA的同时还能检测细胞的形态学特征用以定性分析，可以提高细胞检测及分类的准确性。