相思树AmCesA2基因及提高植物纤维素含量的方法

摘要

本发明涉及一个新的相思树纤维素合酶基因AmCesA2及以转基因技术利用它来提高植物纤维素含量，并研究其可能功能的方法。本发明从相思树中克隆了一个新的纤维素合酶基因AmCesA2，并构建了正义及反义的植物双元表达载体。其主要的目的就是加快一些热带、亚热带树种的生长速度，缩短其生育周期，增加其纤维素含量，同时改良多种植物的纤维素品质。其次，探讨这个基因在相思树中的表达机制与机能。目前，在烟草中这个基因已表现出提高转化受体植物纤维素含量的特性。

说明书

技术领域：

本发明涉及相思树纤维素合酶基因AmCesA2及通过转基因技术利用它来提高植物纤维素含量，研究其可能功能的方法。

背景技术：

相思树种共有1200余种，原产地为澳大利亚和非洲。它是一种适应性较强的树种，速生，能迅速固氮，改良土壤。其生长量、制浆性能和纤维质量都可以和桉树媲美甚至优于桉树，是一种优良的纸浆工业原料。

我国引种的主要相思树种有：大叶相思(Acacia auriculiformis willd)，马占相思(Acacia mangium willd)和厚荚相思(Acacia crassicarpa)。目前，主要分布于海南、福建及两广地区。在几种相思树种中，马占相思的制浆性能及纤维质量都优于其它两类相思树种，且由于其生长期相对较短(6年)，对土壤具有改良作用，成为东南亚一种普遍种植的造纸用树。

纤维素是细胞壁的主要组成成分之一，也是评价造纸原料性能优劣的一个重要指标。纤维素的基本结构单位是吡喃式D-葡萄糖，以β-1，4糖苷键相连。植物细胞壁中多糖的结构、糖基组成、糖基间的连接键及糖基的修饰作用等已研究的较为清楚，但对涉及多糖合成的酶与多糖聚合还知之甚少(Gibeaut eta1，1994)。相思树作为一种重要的造纸原料，目前还没有有关其纤维素合酶方面的报道。

纤维素合酶属于糖基转移酶类家族，后者基于其氨基酸序列的相似性被划分为47个家族。植物因其具有广泛的糖基转移反应，从而有大量的糖基转移酶类基因被分离、鉴定(Saxena I M et al，2000)。

第一个纤维素合酶基因是在本醋杆菌(Acetobacter xylinum)中分离得到的(Saxena IM.et a1，1990；WongHC.et al，1990，Saxena，1995)，它含有糖基转移酶类的D，D，D，QXXRW保守区域。植物中的纤维素合酶基因首先发现于棉花。由Pear等(1996)对棉花纤维cDNA文库进行随机时发现，其编码的蛋白具D，D，D，QxxRW保守特征。而在N-末端与保守的天冬氨酸残基之间还具额外的特异性片断，显示了独特的序列特征。

目前，在拟南芥、玉米、杨树、水稻中已得到了编码纤维素合酶的基因全长(Richmond TA，2000；SamugaA，2002等)。植物的纤维素合酶在N端特有一个类似于植物转录因子的“亮氨酸拉链”区域，称作LIM-likeZn-binding domain/RING finger区域(Kawagoe and Delmer，1997a，1997b；Arioli et al，1998)，前者介导蛋白与蛋白间的相互作用(Bach，2000)，而后者在蛋白的泛数降解中具有功能(Freemont，2000)，因此推测这个结构在CesA的功能实现中参与蛋白偶联和定向降解。

与细菌的纤维素合酶不同，植物的CesA具有一个特异的植物特异性保守区CR-P(for conservedplant-specific)和植物特异的高度可变区HVR(for hyper-variable plant-specific)(Delmer DP，1999)。但其功能目前还不清楚。

目前，CesA的功能推测主要来自于基因表达、UDP-G结合实验(Pear JR et al，1996)、突变分析(FagardM et al，2000)及基因沉默实验(Burton et al，2000)。Burton等(2000)借助病毒诱导的基因沉默技术对植物纤维素合酶基因进行了研究。他们采用马铃薯X病毒为载体，将一个推测可能编码纤维素合酶的基因导入烟草，结果烟草出现了矮化现象，纤维素含量明显降低，从而验证了目标基因编码的蛋白具纤维素合酶功能。但这种降低可被同源的乳糖的增加所抵消，从而说明在纤维素和果胶的生物合成过程中或其他可能的新陈代谢途径中存在着反馈环。

此外，还可以根据突变分析、基因表达实验以及同源序列比较来分析不同的Ces的功能。目前已有研究证明，初生、次生细胞壁形成过程中，纤维素的合成涉及不同的纤维素合酶(Saxena and Brown，2000)。Holland等(2000)对棉花、杨树、拟南芥及玉米的纤维素合酶进行了比较研究，结果表明这些酶本身的某些特异性序列决定其在初生或次生细胞壁中表达，而并非单独由启动子决定。初生与次生细胞壁中的纤维素具有不同的特征，比如聚合度，其特征差异可能与不同的纤维素合酶有关(Delmer，1999)。Wu等(2000)从杨树中克隆了一个纤维素合酶基因：PtCesA，正常生长时，其在木质部表达，在受到外界压力胁迫时，它在韧皮部微管中也有表达，说明它可能参与信号传导机制。

发明内容：

迄今为止，我们对Ces的所知还相当有限。纤维素合酶超家族的基因分离和酶的结构及功能分析将有利于了解它们自然存在的结构及形态。而且，木材作为一种重要的造纸原料，对其也存在着速生性与高纤维品质的要求。但传统的改良措施对于生长周期相对较长的林木类植物的改造功效十分有限，以基因工程的手段去提高其品质，加快其生长速度不失为一种切实可行的方法。本发明的一个主要目的是加快一些热带、亚热带树种的生长速度，缩短其生育周期，增加其纤维素含量，提高可利用性。另外，多种植物的纤维素品质是重要的经济性状，纤维素合酶研究的深入最终会应用到经济植物目标改善的改良中。纤维素合酶的基因工程改造将提高纤维的品质，树种中纤维素的长度、长宽比、均匀度等。本发明现已：

1、从相思树中克隆得到了一个新的纤维素合酶基因，命名为AmCesA2，与2004100461112分案1中的AmCesA1基因核苷酸序列有5％的差异，该差异可能导致基因功能的不同；

2、构建了该相思树纤维素合酶基因AmCesA2的正义表达载体，用于转化烟草及桉树、杨树、矮牵牛等。由于外源CesA基因的引进，植物纤维素表达量增高，从而刺激植物生长，加快其生长速度。

3、构建了该相思树纤维素合酶基因AmCesA2的反义表达载体，利用反义基因技术，即通过引入一个特定内源基因的反义序列来抑制其表达，从而深入研究该纤维素合酶基因的功能。

4、通过AmCesA1和AmCesA2的比较，确定两个基因的功能相同和差异。

具体的技术方案如下：

1.从相思中获得纤维素合酶基因：

由于相思树中的纤维素合酶基因为未知序列，因此，我们比较了一系列已知的纤维素合酶的氨基酸序列，设计了两条简并引物，利用RT-PCR技术，再结合5′RACE技术，以获得全长的相思树纤维素合酶基因。

简并引物序列

保守区域I：    V     I      C      E   I(V)      W    F     A

CesDe1：5`＞g GTI AT(A/C/T)TG(T/C)GA(A/G)(A/G)TI TGG TT(T/C)GC＜3`

保守区域II：   F    P    Q     R        F     D      G    I      D

CesDe2：5`＞TT(T/C)CCI CA(A/G)(A/C)GI TT(T/C)GA(T/C)GGI AT(A/C/T)GA＜3`

2.构建正义及反义形式的纤维素合酶基因AmCesA2的植物表达载体：

我们选用了适用于大多数植物且启动能力很强的、亦是在植物基因工程中最常用的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子，将克隆得到的正义及反义纤维素合酶基因连于其后，构建成功双元表达载体，转化植物。

3.以烟草及桉树、杨树、矮牵牛等进行植物转基因操作：

烟草作为一种模式植物常常被用于转化外源基因以研究其功能。本发明以烟草为转化受体，导入纤维素合酶的正义及反义基因，以观察其对植物生长速率及生长状态的影响，进一步探讨其可能的功能。另外，也在杨树及桉树上进行了转化研究。

此外，还应该特别指出以下事项：

本发明利用我们所得纤维素合酶基因，构建正义及反义表达载体，但这并不意味着此基因只有这一个应用价值。使用本发明中的基因进行其他方面的应用均在本发明权利要求之内，包括利用RNAi技术对植物进行遗传转化以影响植物生长状态及途径。

在本发明的一个实施方案中，纤维素合酶基因AmCesA2被置于CaMV35s启动子和nos polyA终止子的调控之下，再连至CAMBIA公司的双元表达载体pCAMBIA1301，构成一个植物表达载体。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的植物表达载体除了pCAMBIA1301之外，还可以选用CAMBIA公司的其它表达载体或者本领域技术人员所熟悉的其它如pGPTV系列，pBI系列，pCB系列等的植物表达载体。

在本发明的一个实施方案中，我们选用烟草作为转基因植物材料。但这并不意味着本发明所构建的转基因载体只能用于转化烟草。使用含本发明中纤维素合酶基因的正义及反义表达载体转化其他植物材料，以调控植物生长速度的转基因植物的方法，均在本发明的权利要求之内。

有益效果：

1.得到一个新的来源于相思树的纤维素合酶基因AmCesA2，该基因与分案1中的AmCesA1基因有序列差异，该差异可能导致基因功能的不同。

2.利用该纤维素合酶基因的正义形式转化烟草，烟草生长加快，推测它们对桉树及杨树等材料的转化，将会对加快其生长周期，提高其生长速度大有裨益。

3.得到了内源纤维素合酶基因沉默的转基因植株，观察这个纤维素合酶基因对植物生长发育的影响，确定其在相思树中的功能。

附图说明：

图1.正义植物表达载体pCAmCesA2的示意图

图2.反义植物表达载体pCAmCesAR2的示意图

图3.转正义及反义AmCesA2基因烟草的形态学变化

A：转正义AmCesA2基因烟草；B：转空载体烟草；C：转反义AmCesA2基因烟草。

实施方式：

实验所涉及的药品均购自Promega公司，Takara公司，上海生工及欣经科公司。具体实验操作依据《分子克隆》及《植物基因工程原理与技术》。

实施例1：相思树纤维素合酶基因AmCesA2的获得：

(1)用于PCR反应的引物设计

根据已知的拟南芥、玉米、烟草、棉花的纤维素合酶的氨基酸序列，进行比对，找出其保守区域，设计简并引物：

第一条简并引物：

CesDe1：5`＞g GTI AT(A/C/T)TG(T/C)GA(A/G)(A/G)TI TGG TT(T/C)GC＜3`

第二条简并引物：

CesDe2：5`＞TT(T/C)CCI CA(A/G)(A/C)GI TT(T/C)GA(T/C)GGI AT(A/C/T)GA＜3`

(2)相思树RNA的获得

a.取1克植物组织，液氮研磨后加入10ml提取液，同时加入0.1g PVP-40，200ul2-巯基乙醇继续研磨，待其充分融解后转移至30ml管子，加等量的CI，剧烈振荡混匀5min。

b.4℃下11000rpm离心10min，取上清，加等体积CI抽提，重复此步骤，一直至相面无可见物质存在。

c.加2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的5M的NaCl，-20℃过夜。

d.4℃下11000rpm离心20min，将沉淀溶于10ml的提取缓冲液中，加等量PCI，混匀5min，室温离心10min，取水相，重复抽提，到相面无可见物质存在。

e.加2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的5MNaCl，-20℃放置过夜。

f.4℃下11000rpm离心15min，沉淀溶于1ml的DEPC H₂O中，加入333ul 8M的LiCl溶液，4℃下放置过夜。

g.4℃下11000rpm离心30min，沉淀用80％乙醇洗涤，自然干燥，加30ul的DEPC H₂O溶解。

(3)ESTs的获得

对所获得的相思树RNA按Promage的反转录Kit说明，以OligodT作为下游引物进行反转录，对所得到的反转录产物以CesDe2和OligodT为引物进行PCR扩增，之后与T-easy进行连接，对所得到的菌落进行鉴定后进行测序，得到了一个与CesA同源的cDNA片段.依据测序后核苷酸序列，分别设计引物，对相思树的反转录产物以CesDe1和后设计引物进行PCR，获得大约2.5kb的cDNA片段。

其引物序列分别为：

Aces 1.3-3：5`＞TTTTGCTGCCCTCTTCTTGTCAA＜3

Aces2.3-3：5`＞TGGTTGGGTCAACATGCTTGCT＜3`

(4)5`RACE技术

根据已知序列，设计这个纤维素合酶基因的GSP引物，其序列分别如下：

Aces2GSP 1：5`-ATATATCAACAGCTGCTAGT-3`

Aces2GSP2：5`-AGATATGTTTCCCGGTTTACC-3`

参照5`RACE(Invitrogen公司)的操作说明进行操作，将所获得片段进行测序。

测序后，发现这个基因已得到了基因的起始序列，在此基础上设计引物，扩增全长的Acacia cDNA.序列。

(5)全长cDNA序列的获得

AmCesA2全长扩增的引物序列：

Aces2.3`-1：5`-TGAGCTCTTCTAGCAGTTTATTCCACACT-3`

Aces2.5`-1：5`-ATCTAGACAGCTTATGGAGTCAGAAGG-3`

对所获得的相思树RNA反转录产物，以基因两端引物进行PCR扩增，得到一个新的纤维素合酶基因，命名为AmCesA2。将该全长基因连接到pT-easy(Promega公司)载体上，得到含有AmCesA2基因的载体pT-AC2。

实施例2：植物表达载体的构建：

正义植物表达载体pCAmCesA2的示意图见附图1。

正义表达载体pCAmCesA2的具体构建流程如下：将35S以HindIII+PstI从中间载体pMM23上转移至pCAMBIA1300上，以XbaI+SacI进行酶切，同时对连有全长AmCes2基因的pT-AC2进行SpeI+SacI酶切，连接，得到正义的AmCesA2双元表达载体pCAmCesA2。

反义植物表达载体pCAmCesAR2的示意图见附图2。

反义表达载体pCAmCesAR2的具体构建流程如下：将35S以HindIII+PstI从pMM23上转移至pCAMBIA1300上，以PstI+SphI进行酶切，同时对连有全长AmCes2基因的pT-AC2进行PstI+SphI酶切，连接，得到反义的AmCesA2双元表达载体pCAmCesAR2。

中间载体pMM23农部植物基因表达研究中心David Ow教授惠赠，其作用为提供植物基因工程常用的CaMV 35S(简称35S)启动子。植物表达载体pCAMBIA1300从CAMBIA公司购得，是植物基因工程中非常常用的载体。pT-easy载体由Promega公司购得，是分子克隆非常常用的构建载体。具体资料见http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.asp？catalog_name＝Promega_Products&category_name＝nGEM-T+Easy+Vector+Systems。

实施例3：农杆菌的转化：

(1)感受态的制备

a.挑取土壤农杆菌单菌落接种于5ml含适当抗生素的LB/YEB液体培养基中，28℃、250rpm振荡培养过夜；

b.按1：25-50接种于20ml含适当抗生素的LB/YEB液体培养基中继续培养4-6h；

c.4℃，5,000rpm离心10min，去上清；

d.用600μl冰预冷的TE缓冲液(PH7.5)洗涤菌体；

e.4℃，5,000rpm离心10min，去上清；

f.用200μl冰预冷的液体LB/YEB重悬菌体，液氮冷冻，于-70℃保存。

(2)转化

a.将感受态农杆菌置冰浴中溶化，然后加入约0.5-1.0μg质粒DNA，轻轻混匀，冰上放置5min；

b.置于液氮中5min；

c.37℃温育5min；

d.加入800μl LB/YEB液体培养基，28℃振荡培养5-6h；

e.6,000rpm离心5min，去大部分上清，剩50μl左右，悬浮菌体，

f.均匀涂布于含适当抗生素的LB/YEB选择平板上，28℃倒置培养两天。

实施例4：烟草的遗传转化及再生：

(1)接种转化菌单菌落于含适当抗生素的2ml YEB液体培养基中，28℃培养1-2天，转接入20ml YEB液体培养基中，28℃继续培养至OD600约0.5；

(2)将健壮的烟草叶片剪成0.5-1cm见方，放入MS液体培养基稀释过的农杆菌中，浸泡10-15分钟，其间不断轻摇儿次；

(3)取出材料，用无菌纸吸去多余菌液，于MS固体培养基中28℃暗培养两天；

(4)用无菌纸吸去生长过度的菌体，把材料转入含选择压Hyg 10mg/L、Cb 500mg/L和6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L的分化培养基中(基本培养基为MS培养基)，25℃光下培养，每两周换一次培养基，至分化出愈伤组织，直至长出芽；

(5)将长至1cm以上的芽转入含Hyg 10mg/L、Cb 500mg/L的生根培养基上诱导生根；

实施例5：桉树，杨树，矮牵牛的遗传转化及再生：

除在培养基的营养成份及激素配比上有适当的调整外，其它大至方法相同。所用抗生素浓度与烟草一致。具体方法见《植物基因工程原理与技术》。

实施例6：以AmCesA2基因进行的几种转化方法：

除农杆菌转化法外，本发明还涉及到电击法、原生质体转化法、花粉管通道法及基因枪转化方法。具体操作方法见《植物基因工程原理与技术》。

专利菌种说明：

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli(DH5α))，保藏代号为pT-AmcesA2，保藏编号为CGMCCNO.1136，保藏日期为2004年4月22日。

相思树生长周期短，生长速度快，土壤适应性广，作为一种优质的造纸原料，在我国南方的种植面积呈上长趋势，在整个东南亚也占有很大的种植比例。作为一种极有应用前景的树木品种，有关其纤维素生化性状的研究报道相对较少，而有关纤维素合酶的信息无论是在国内还是在国际均未见报道。

本专利运用基因工程的方法克隆得到了具有自主知识产权的相思树纤维素合酶基因，从基因水平上推测其酶的功能进而应用于生产实践，在加快相思树的生长速度，提高纤维素的产量和质量方面都将产生积极的影响。

序列表

<110>林忠平

<120>相思树AmCesA2基因及提高植物纤维素含量的方法

<140>2004100461112

<141>2004-06-01

<160>1

<210>1

<211>3228

<212>DNA

<213>马占相思树(Acacia mangium willd)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(3228)

<400>1

                               atg gag tca gaa ggg gaa gct ggg gca aag cca aag  36

                               Met Glu Ser Glu Gly Glu Ala Gly Ala Lys Pro Lys

                                1               5                  10

acg gca ttg ggt gcc caa gtg tgc cag ata tgt ggt gat agt gtt ggg aag act gtg gat 96

Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Cys Gln Ile Cys Gly Asp Ser Val Gly Lys Thr Val Asp

        15                  20                  25                  30

ggt gag cca ttc att gcc tgt gat gtt tgc gct ttt cct gtt tgc agg ccg tgc tat gag 156

Gly Glu Pro Phe Ile Ala Cys Asp Val Cys Ala Phe Pro Val Cys Arg Pro Cys Tyr Glu

        35                  40                  45                  50

tat gaa agg aag gat gga aac cag tct tgc ccc cag tgc aaa acc cgg tac aag aga cac 216

Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Asn Gln Ser Cys Pro Gln Cys Lys Thr Arg Tyr Lys Arg His

        55                  60                  65                  70

aaa gga agt cct gca att ctt gga gat ggg gag gag gat ggt gtt gct gat gat ggt act 276

Lys Gly Ser Pro Ala Ile Leu Gly Asp Gly Glu Glu Asp Gly Val Ala Asp Asp Gly Thr

        75                  80                  85                  90

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Ser Asp Leu Asn Tyr Asp Ser Glu Asn Gln Asn Gln Lys Gln Lys Ile Ser Glu Arg Met

        95                  100                 105                 110

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        115                 120                 125                 130

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Glu Val Ser His Asn Gln Ile Pro Leu Leu Thr Asn Gly Gln Glu Val Ser Gly Glu Leu

        135                 140                 145                 150

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Ser Ala Ala Ser Pro Glu Arg Leu Ser Met Ala Ser Pro Gly Gly Pro Gly Gly Lys Arg

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        175                 180                 185                 190

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Lys Asn Val Val Pro Met Ser Thr Gly Gln Ala Ala Ser Glu Arg Gly Ala Gly Asp Ile

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Leu Ser Arg Lys Val Ser Ile Pro Ser Ser Arg Ile Asn Pro Tyr Arg Met Val Ile Ile

        255                 260                 265                 270

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Leu Arg Leu Ile Ile Leu Cys Phe Phe Leu His Tyr Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Asn

        275                 280                 285                 290

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Ala Tyr Pro Leu Trp Leu Val Ser Val Ile Cys Glu Ile Trp Phe Ala Leu Ser Trp Ile

        295                 300                 305                 310

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Leu Asp Gln Phe Pro Lys Trp Leu Pro Val Asn Arg Glu Thr Tyr Leu Asp Arg Leu Ala

        315                 320                 325                 330

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Leu Arg Tyr Asp Arg Glu Gly Glu Pro Ser Gln Leu Ala Ala Val Asp Ile Phe Val Ser

        335                 340                 345                 350

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Thr Val Asp Pro Leu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Ala Leu Ser Ile Leu

        355                 360                 365                 370

gcc gtt gat tat ccc gtg gat aag gtc tct tgc tat gtc tcc gat gat ggt gct gct atg 1176

Ala Val Asp Tyr Pro Val Asp Lys Val Ser Cys Tyr Val Ser Asp Asp Gly Ala Ala Met

        375                 380                 385                 390

ctg aca ttt gaa gct ctt tca gag aca gca gaa ttt gca agg aaa tgg gtt cct ttc tgc 1236

Leu Thr Phe Glu Ala Leu Ser Glu Thr Ala Glu Phe Ala Arg Lys Trp Val Pro Phe Cys

        395                 400                 405                 410

aaa aaa tac aac att gaa cct cgg gca cca gag tgg tac ttt acg caa aag att gac tac 1296

Lys Lys Tyr Asn Ile Glu Pro Arg Ala Pro Glu Trp Tyr Phe Thr Gln Lys Ile Asp Tyr

        415                 420                 425                 430

tta aaa gac aag gtt caa aca tca ttc gtc aaa gat cgt aga gca atg aag aga gaa tat 1356

Leu Lys Asp Lys Val Gln Thr Ser Phe Val Lys Asp Arg Arg Ala Met Lys Arg Glu Tyr

        435                 440                 445                 450

gaa gag ttt aaa gtt cgt gtt aat gca ctt gtt gca aag gca cag aaa att cca gaa gaa 1416

Glu Glu Phe Lys Val Arg Val Asn Ala Leu Val Ala Lys Ala Gln Lys Ile Pro Glu Glu

        455                 460                 465                 470

ggg tgg gta atg caa gac ggt act cca tgg cct gga aac aac acc aga gat cat cct gga 1476

Gly Trp Val Met Gln Asp Gly Thr Pro Trp Pro Gly Asn Asn Thr Arg Asp His Pro Gly

        475                 480                 485                 490

atg atc cag gtt ttc ttg ggc caa agt gga ggg ctt gat gca gag ggt aat gaa ctt cca 1536

Met Ile Gln Val Phe Leu Gly Gln Ser Gly Gly Leu Asp Ala Glu Gly Asn Glu Leu Pro

        495                 500                 505                 510

cgt tta gtc tat gtt tct cgt gaa aag cgt cca gga ttt caa cat cac aag aag gct ggt 1596

Arg Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Phe Gln His His Lys Lys Ala Gly

        515                 520                 525                 530

gcc atg aat gcc ctt gtt cga gtt tca gct gtc ctt aca aat gga cct ttc cta ttg aat 1656

Ala Met Asn Ala Leu Val Arg Val Ser Ala Val Leu Thr Asn Gly Pro Phe Leu Leu Asn

        535                 540                 545                 550

ctt gat tgt gat cac tac ata aac aac agc aaa gcc ttg agg gaa gcc atg tgc ttt atg 1716

Leu Asp Cys Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Lys Ala Leu Arg Glu Ala Met Cys Phe Met

        555                 560                 565                 570

atg gat ccc aac cta ggg aaa cat gtt tgc tat gtt cag ttc ccg cag agg ttt gat ggt 1776

Met Asp Pro Asn Leu Gly Lys His Val Cys Tyr Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Asp Gly

        575                 580                 585                 590

att gac agg aat gat cga tat gcc aat cgt aat aca gtt ttc ttt gat ata aac ttg aga 1836

Ile Asp Arg Asn Asp Arg Tyr Ala Asn Arg Asn Thr Val Phe Phe Asp Ile Asn Leu Arg

        595                 600                 605                 610

ggt ttg gat ggc att caa ggt cct gtc tat gtg ggc act gga tgt gtc ttc aac aga aca 1896

Gly Leu Asp Gly Ile Gln Gly Pro Val Tyr Val Gly Thr Gly Cys Val Phe Asn Arg Thr

        615                 620                 625                 630

gct tta tat ggt tat gaa cct cct ctc aaa ccc aaa cat aaa aag cca ggg ttg ctg tct 1956

Ala Leu Tyr Gly Tyr Glu Pro Pro Leu Lys Pro Lys His Lys Lys Pro Gly Leu Leu Ser

        635                 640                 645                 650

tca tta tgt ggt gga agt cga aag aag agt tca aaa tct agt aag aaa ggt tct gac aag 2016

Ser Leu Cys Gly Gly Ser Arg Lys Lys Ser Ser Lys Ser Ser Lys Lys Gly Ser Asp Lys

        655                 660                 665                 670

aaa aaa tct agc aag cat gtt gac cca acc atc ccc ata tac aat ctg gaa gat ata gaa 2076

Lys Lys Ser Ser Lys His Val Asp Pro Thr Ile Pro Ile Tyr Asn Leu Glu Asp Ile Glu

        675                 680                 685                 690

gaa gga gtg gaa ggt gct gga ttt gat gat gag aag tca cta ctc atg tcc caa atg agc 2136

Glu Gly Val Glu Gly Ala Gly Phe Asp Asp Glu Lys Ser Leu Leu Met Ser Gln Met Ser

        695                 700                 705                 710

ctt gag aaa agg ttt ggt caa tca gct gtc ttt gtt gct tcc gcg ctt atg gag aat ggc 2196

Leu Glu Lys Arg Phe Gly Gln Ser Ala Val Phe Val Ala Ser Ala Leu Met Glu Asn Gly

        715                 720                 725                 730

ggt gtt cct cag tct gct act cct gat act ctt ctt aag gag gct att cat gtt atc agc 2256

Gly Val Pro Gln Ser Ala Thr Pro Asp Thr Leu Leu Lys Glu Ala Ile His Val Ile Ser

        735                 740                 745                 750

tgt ggt tac gag gac aaa tca gat tgg gga agt gag ata gga tgg atc tat ggg tct gtt 2316

Cys Gly Tyr Glu Asp Lys Ser Asp Trp Gly Ser Glu Ile Gly Trp Ile Tyr Gly Ser Val

        755                 760                 765                 770

acg gaa gat att ctt aca gga ttt aag atg cat gcc cgt ggt tgg agg tca ata tac tgc 2376

Thr Glu Asp Ile Leu Thr Gly Phe Lys Met His Ala Arg Gly Trp Arg Ser Ile Tyr Cys

         775                780                 785                 790

atg ccg aag cgc cca gca ttc aaa ggt tct gct cct atc aat ctt tca gac cgt ctg aac 2436

Met Pro Lys Arg Pro Ala Phe Lys Gly Ser Ala Pro Ile Asn Leu Ser Asp Arg Leu Asn

        795                 800                 805                 810

caa gtg ctt cgg tgg gcc ctg ggt tcc gtg gag att ctt ttt agt cgg cac tgc ccc atc 2496

Gln Val Leu Arg Trp Ala Leu Gly Ser Val Glu Ile Leu Phe Ser Arg His Cys Pro Ile

        815                 820                 825                 830

tgg tac ggt tat tct gga agg ctc aag tgg ctc gag agg ttt gca tat gtg aac acc aca 2556

Trp Tyr Gly Tyr Ser Gly Arg Leu Lys Trp Leu Glu Arg Phe Ala Tyr Val Asn Thr Thr

        835                 840                 845                 850

atc tat ccg atc acc gct att ccc ctt gtc atg tac tgt acc ttg cct gct gtc tgt ctt 2616

Ile Tyr Pro Ile Thr Ala Ile Pro Leu Val Met Tyr Cys Thr Leu Pro Ala Val Cys Leu

        855                 860                 865                 870

ctc aca aac agg ttc atc att ccc cag att agt aac att gcg agc ata tgg ttt ata tca 2676

Leu Thr Asn Arg Phe Ile Ile Pro Gln Ile Ser Asn Ile Ala Ser Ile Trp Phe Ile Ser

        875                 880                 885                 890

ctt ttc att tcc atc ttt gcg acc ggt atc ctt gag atg agg tgg agt ggg gtc gga att 2736

Leu Phe Ile Ser Ile Phe Ala Thr Gly Ile Leu Glu Met Arg Trp Ser Gly Val Gly Ile

        895                 900                 905                 910

gat gag tgg tgg aga aat gaa caa ttt tgg gtc ata ggt ggc gtt tca gct cat ctt ttt 2796

Asp Glu Trp Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile Gly Gly Val Ser Ala His Leu Phe

        915                 920                 925                 930

gct gtc gtc caa ggt tta ctc aaa gtg ctt gct gga atc gat acc aac ttt aca gtt acc 2856

Ala Val Val Gln Gly Leu Leu Lys Val Leu Ala Gly Ile Asp Thr Asn Phe Thr Val Thr

        935                 940                 945                 950

tcc aag gcg tct gat gaa gac gga gac ttt gcg gaa tta tac atg ttc aaa tgg aca acc 2916

Ser Lys Ala Ser Asp Glu Asp Gly Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Met Phe Lys Trp Thr Thr

         955                 960                 965                 970

ctt ctc att cca cct aca aca ctg cta atc ata aac atg gtg ggt gtt gtt gct ggg atc 2976

Leu Leu Ile Pro Pro Thr Thr Leu Leu Ile Ile Asn Met Val Gly Val Val Ala Gly Ile

        975                 980                 985                 990

tcg tat gcc atc aat agt ggc tac cag tca tgg ggt ccg cta ttt ggc aag ctt ttc ttc 3036

Ser Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Tyr Gln Ser Trp Gly Pro Leu Phe Gly Lys Leu Phe Phe

        995                1000                1005                1010

gca ttt tgg gtg att atc cat ctc tat cct ttc ctc aga ggt ctc atg ggc cgc cag aac 3096

Ala Phe Trp Val Ile Ile His Leu Tyr Pro Phe Leu Arg Gly Leu Met Gly Arg Gln Asn

        1015                1020                1025                1030

cga aca cca acc att gtg gtt gtc tgg tcc att ctg ctc gct tcc atc ttc tca ctg tta 3156

Arg Thr Pro Thr Ile Val Val Val Trp Ser Ile Leu Leu Ala Ser Ile Phe Ser Leu Leu

        1035                1040                1045                1050

tgg gtc cga gcc gac cca ttc ata aca cga gtc agg ggt cct gac acc gag cag tgt gga 3216

Trp Val Arg Ala Asp Pro Phe Ile Thr Arg Val Arg Gly Pro Asp Thr Glu Gln Cys Gly

        1055                1060                1065                1070

ata aac tgc tag                                                                 3228

Ile Asn Cys  *

        1075

<210>2

<211>1075

<212>PRT

<213>马占相思树(Acacia mangium willd)

<400>2

Met Glu Ser Glu Gly Glu Ala Gly Ala Lys Pro Lys Thr Ala Leu Gly Ala Gln Val Cys Gln Ile Cys Gly Asp

1               5                   10                  15                  20                  25

Ser Val Gly Lys Thr Val Asp Gly Glu Pro Phe Ile Ala Cys Asp Val Cys Ala Phe Pro Val Cys Arg Pro Cys

                30                  35                  40                  45                  50

Tyr Glu Tyr Glu Arg Lys Asp Gly Asn Gln Ser Cys Pro Gln Cys Lys Thr Arg Tyr Lys Arg His Lys Gly Ser

                55                  60                  65                  70                  75

Pro Ala Ile Leu Gly Asp Gly Glu Glu Asp Gly Val Ala Asp Asp Gly Thr Ser Asp Leu Asn Tyr Asp Ser Glu

                80                  85                  90                  95                  100

Asn Gln Asn Gln Lys Gln Lys Ile Ser Glu Arg Met Leu Ser Trp His Met Thr Tyr Gly Arg Thr Glu Glu Ile

               105                 110                 115                  120                125

Gly Ala Pro Asn Tyr Asp Lys Glu Val Ser His Asn Gln Ile Pro Leu Leu Thr Asn Gly Gln Glu Val Ser Gly

               130                  135                 140                 145                 150

Glu Leu Ser Ala Ala Ser Pro Glu Arg Leu Ser Met Ala Ser Pro Gly Gly Pro Gly Gly Lys Arg Val His Ser

               155                  160                 165                 170                 175

Leu Pro Tyr Ser Ser Asp Ile Asn Gln Ser Pro Asn Ile Arg Ala Val Asp Pro Gly Leu Gly Asn Val Ala Trp

               180                  185                 190                 195                 200

Lys Glu Arg Val Asp Gly Trp Lys Met Lys Gln Glu Lys Asn Val Val Pro Met Ser Thr Gly Gln Ala Ala Ser

               205                  210                215                  220                 225

Glu Arg Gly Ala Gly Asp Ile Asp Ala Ser Thr Asp Val Leu Val Asp Asp Ser Leu Leu Asn Asp Glu Ala Arg

               230                  235                240                  245                 250

Gln Pro Leu Ser Arg Lys Val Ser Ile Pro Ser Ser Arg Ile Asn Pro Tyr Arg Met Val Ile Ile Leu Arg Leu

               255                  260                265                  270                 275

Ile Ile Leu Cys Phe Phe Leu His Tyr Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Asn Ala Tyr Pro Leu Trp Leu Val Ser

               280                  285                290                  295                 300

Val Ile Cys Glu Ile Trp Phe Ala Leu Ser Trp Ile Leu Asp Gln Phe Pro Lys Trp Leu Pro Val Asn Arg Glu

               305                  310                315                  320                 325

Thr Tyr Leu Asp Arg Leu Ala Leu Arg Tyr Asp Arg Glu Gly Glu Pro Ser Gln Leu Ala Ala Val Asp Ile Phe

               330                  335                340                  345                 350

Val Ser Thr Val Asp Pro Leu Lys Glu Pro Pro Leu Val Thr Ala Asn Thr Ala Leu Ser Ile Leu Ala Val Asp

               355                  360                365                  370                 375

Tyr Pro Val Asp Lys Val Ser Cys Tyr Val Ser Asp Asp Gly Ala Ala Met Leu Thr Phe Glu Ala Leu Ser Glu

               380                  385                390                  395                 400

Thr Ala Glu Phe Ala Arg Lys Trp Val Pro Phe Cys Lys Lys Tyr Asn Ile Glu Pro Arg Ala Pro Glu Trp Tyr

               405                  410                415                  420                 425

Phe Thr Gln Lys Ile Asp Tyr Leu Lys Asp Lys Val Gln Thr Ser Phe Val Lys Asp Arg Arg Ala Met Lys Arg

               430                  435                440                  445                 450

Glu Tyr Glu Glu Phe Lys Val Arg Val Asn Ala Leu Val Ala Lys Ala Gln Lys Ile Pro Glu Glu Gly Trp Val

               455                  460                465                  470                475

Met Gln Asp Gly Thr Pro Trp Pro Gly Asn Asn Thr Arg Asp His Pro Gly Met Ile Gln Val Phe Leu Gly Gln

               480                  485                490                  495                500

Ser Gly Gly Leu Asp Ala Glu Gly Asn Glu Leu Pro Arg Leu Val Tyr Val Ser Arg Glu Lys Arg Pro Gly Phe

               505                  510                515                  520                525

Gln His His Lys Lys Ala Gly Ala Met Asn Ala Leu Val Arg Val Ser Ala Val Leu Thr Asn Gly Pro Phe Leu

               530                  535                540                  545                550

Leu Asn Leu Asp Cys Asp His Tyr Ile Asn Asn Ser Lys Ala Leu Arg Glu Ala Met Cys Phe Met Met Asp Pro

               550                  560                565                  570                575

Asn Leu Gly Lys His Val Cys Tyr Val Gln Phe Pro Gln Arg Phe Asp Gly Ile Asp Arg Asn Asp Arg Tyr Ala

               580                  585                590                  595                600

Asn Arg Asn Thr Val Phe Phe Asp Ile Asn Leu Arg Gly Leu Asp Gly Ile Gln Gly Pro Val Tyr Val Gly Thr

               605                  610                615                  620                625

Gly Cys Val Phe Asn Arg Thr Ala Leu Tyr Gly Tyr Glu Pro Pro Leu Lys Pro Lys His Lys Lys Pro Gly Leu

               630                  635                640                  645                650

Leu Ser Ser Leu Cys Gly Gly Ser Arg Lys Lys Ser Ser Lys Ser Ser Lys Lys Gly Ser Asp Lys Lys Lys Ser

               655                  660                665                  670                675

Ser Lys His Val Asp Pro Thr Ile Pro Ile Tyr Asn Leu Glu Asp Ile Glu Glu Gly Val Glu Gly Ala Gly Phe

               680                  685                690                  695                700

Asp Asp Glu Lys Ser Leu Leu Met Ser Gln Met Ser Leu Glu Lys Arg Phe Gly Gln Ser Ala Val Phe Val Ala

               705                  710                715                  720                725

Ser Ala Leu Met Glu Asn Gly Gly Val Pro Gln Ser Ala Thr Pro Asp Thr Leu Leu Lys Glu Ala Ile His Val

               730                  735                740                  745                750

Ile Ser Cys Gly Tyr Glu Asp Lys Ser Asp Trp Gly Ser Glu Ile Gly Trp Ile Tyr Gly Ser Val Thr Glu Asp

               755                  760                765                  770                775

Ile Leu Thr Gly Phe Lys Met His Ala Arg Gly Trp Arg Ser Ile Tyr Cys Met Pro Lys Arg Pro Ala Phe Lys

               780                  785                790                  795                800

Gly Ser Ala Pro Ile Asn Leu Ser Asp Arg Leu Asn Gln Val Leu Arg Trp Ala Leu Gly Ser Val Glu Ile Leu

               805                  810                815                  820                825

Phe Ser Arg His Cys Pro Ile Trp Tyr Gly Tyr Ser Gly Arg Leu Lys Trp Leu Glu Arg Phe Ala Tyr Val Asn

               830                  835                840                  845                850

Thr Thr Ile Tyr Pro Ile Thr Ala Ile Pro Leu Val Met Tyr Cys Thr Leu Pro Ala Val Cys Leu Leu Thr Asn

               855                  860                865                  870                875

Arg Phe Ile Ile Pro Gln Ile Ser Asn Ile Ala Ser Ile Trp Phe Ile Ser Leu Phe Ile Ser Ile Phe Ala Thr

               880                  885                890                  895                900

Gly Ile Leu Glu Met Arg Trp Ser Gly Val Gly Ile Asp Glu Trp Trp Arg Asn Glu Gln Phe Trp Val Ile Gly

               905                  910                915                  920                925

Gly Val Ser Ala His Leu Phe Ala Val Val Gln Gly Leu Leu Lys Val Leu Ala Gly Ile Asp Thr Asn Phe Thr

               930                  935                940                  945                950

Val Thr Ser Lys Ala Ser Asp Glu Asp Gly Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Met Phe Lys Trp Thr Thr LeuLeu Ile

               955                  960                965                  970                975

Pro Pro Thr Thr Leu Leu Ile Ile Asn Met Val Gly Val Val Ala Gly Ile Ser Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Tyr

               980                  985                990                  995                1000

Gln Ser Trp Gly Pro Leu Phe Gly Lys Leu Phe Phe Ala Phe Trp Val Ile Ile His Leu Tyr Pro Phe Leu Arg

              1005                1010                1015                1020                 1025

Gly Leu Met Gly Arg Gln Asn Arg Thr Pro Thr Ile Val Val Val Trp Ser Ile Leu Leu Ala Ser Ile Phe Ser

              1030                1035                1040                1045                 1050

Leu Leu Trp Val Arg Ala Asp Pro Phe Ile Thr Arg Val Arg Gly Pro Asp Thr Glu Gln Cys Gly Ile Asn Cys

              1055                1060                1065                1070                 1075