禾本科通用分子标记CNS-AFLP

摘要

本发明公开了禾本科通用型分子标记CNS－AFLP的建立方法和已开发的在禾本科作物中通用性好的引物序列。应用于基因组学、分子生物学和生物信息学领域。本发明以编码序列或EST为模板设计引物，引物设计以非编码保守序列(CNS)为模板设计引物，检测的多态性是两个CNS之间、CNS和Exon之间非编码区的碱基序列长度和酶切位点变异，包括CNS的发掘、引物设计、PCR扩增、扩增片段多态性检测和酶切片段多态性产生与分析等步骤。其特点是跨物种应用的范围较SSR标记、ILP标记和EST标记宽，设计的引物能在禾本科多个物种应用，从而提高研究效率。由于该方法是以PCR技术为基础的分子标记方法，设计的引物通用性强，能够跨物种广泛应用，对基因组研究相对落后的禾本科物种基因组研究和禾谷类作物比较遗传学有更多的促进作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA分子标记方法，应用于基因组学、分子生物学和生物信息学三大领域，具体说是涉及一种基于非编码保守序列(Conserved NoncodingSequences，CNS)为模板设计引物，进行被测物种PCR扩增，以扩增片段或扩增片段的酶切产物的多态性为标记的分析方法，以及应用此方法开发新型通用型分子标记和分析的技术。

背景技术

DNA分子标记是基因定位、克隆、功能研究和标记辅助选择育种的基础。自1980年人类遗传学家J.G.K.Botstein等首次提出DNA限制性片段长度多态性的分子标记技术以后，1986年第一张番茄RFLP图谱问世，特别是在PCR技术形成以后，使DNA标记技术成为遗传研究的热点，相继出现了以PCR为基础的分子标记技术如RAPD、SSR、AFLP等。目前DNA分子标记技术可分为三种类型：以DNA杂交为基础的技术、以PCR为基础的技术以及PCR技术和限制性酶切技术相结合的技术。

以DNA分子杂交为基础的技术主要是RFLP，由于RFLP技术具有大量的内切酶和探针组合，标记数量丰富，同时还具有共显性、信息完整、重复性和稳定性好等优点，最早被广泛应用。但RFLP技术分析所用探针的制备经费高、时间长，不同物种需制备不同的探针，还需要进行酶切、转膜、探针的同位素标记、分子杂交、放射自显影等繁琐过程，在以PCR为基础的技术出现后，RFLP技术应用逐渐减少。

以PCR技术为基础的标记方法分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记。随机引物PCR标记以RAPD技术为主，还包括DAF、AP-PCR技术等。RAPD所用的引物序列是随机的，揭示的是DNA扩增区段上引物结合位点的碱基序列变异，引物可商品化购买，简便易行，在研究品种资源系统进化和寻找未知多态性方面应用较多。RAPD的缺点是一般表现为显性遗传，提供的信息不完整、不深入，难以区别纯合体和杂合体；同时由于RAPD标记所用的引物短，反应易受条件影响，有时带型不稳定，重复性差，应用受到限制。

特异引物PCR标记包括SSR技术等，所用的引物是针对已知序列的编码DNA区段设计，引物长度一般为16～24个碱基，稳定性好，结果可靠。SSR的基本重复单元由几个碱基组成，由于不同基因型间基本单元的重复次数不同而形成多态性。由于SSR位点的两侧序列是保守的，根据两侧序列设计引物来特异扩增SSR序列，就可获得多态性。与RFLP标记相比，SSR检测的多态性频率高，结果稳定可靠，近年来正逐渐取代RFLP。但与RFLP技术类似，SSR操作复杂，尤其是开发SSR引物需要建立DNA文库、筛选微卫星克隆、测定这些微卫星的两端序列、设计引物等繁琐的工作，耗时耗财。虽然一般的实验室现在可通过Genebank、EMBL和DDBJ等公共数据库搜索SSR引物，但获得的信息量往往有限；而且SSR标记多是已编码区序列设计引物，物种的特异性强，跨物种应用率低，因而限制了该技术的应用。这对于研究基础相对缺乏的小作物更是严重，因此许多小作物没有SSR标记可用。

Zabeau1993年发明的AFLP方法将酶切和PCR技术相结合，通过对DNA酶切片段的选择性扩增来检测酶切片段长度的多态性。AFLP具有RFLP的可靠性和PCR的高效性，在图谱构建、资源多样性分析和基因定位等方面应用多。AFLP的不足是仍需使用同位素标记，污染大，相对较耗时耗财。Konieczny等人将特异扩增片段进行酶切而产生的CAPS标记，实质上是特异引物PCR标记的延伸，增加了发现多态性的机会。综合现有的分子标记方法，特异引物PCR标记(如SSR等)以及由此延伸的CAPS等，相对比较而言，由于其比较简便省事省钱，且结果稳定可靠，目前应用较多，也是未来的发展方向，特异引物PCR标记的关键是引物设计。

SSR标记设计引物的模板为简单重复序列两端的编码区保守序列，它们多是编码蛋白的单拷贝序列，虽然不同基因在禾本科不同物种间的保守程度不同，同源性一般为70％左右，它们的碱基序列只是保证功能性的保守，特异PCR扩增要求碱基严格配对，因而SSR引物在不同种属间的通用性就受到了限制，以一个物种基因组为模板设计的SSR引物，较难在其他物种中应用。如刁现民等用72对玉米的SSR引物对谷子等狗尾草属植物试验，仅有18对可扩增，不足总量1/3，稳定性不好，多态性也差，因而特异引物PCR标记的SSR引物在不同禾本科植物间的共用性上受到限制。

基因的碱基序列由编码区(exon)、顺式调控元件(cisregulatoryelements)、调控序列以及功能未知或无功能的序列(intron)组成。Hardison经过将人和小鼠的同源基因(或类似基因)进行序列比较，在非编码区发现了大量的保守序列(Conserved Noncoding Sequences)，将之命名为CNS，而其中一些CNS就是基因的顺式调控元件。这些CNS的长度变化在10bp到200bp之间，它们不仅碱基序列高度保守，不同CNS的排列顺序也表现保守(共线性好)；在基因的前导区和Intron区都有分布。Kaplinsky和Braun两人将Hardison的方法转移到植物上，通过比较水稻和玉米的ligulessl、wxl、adhl、lg3、osh6等基因，发现植物基因也存在CNS，只不过长度较动物基因的CNS短，频率也较低。植物CNS的碱基序列和不同CNS的排列顺序也表现保守，碱基的同源性在90％以上，甚至更高；而其同一基因编码区的碱基同源性为70％左右；说明非编码区的保守序列CNS的保守程度远高于编码序列，这为设计跨物种应用的标记引物打下了基础。而在两个CNS之间的非编码序列则表现很大的变异，这样就为出现多态性PCR扩增条带提供了基础。

特异引物PCR标记的发展趋势是引物的通用性，即设计一套引物可在不同物种、不同属、甚至不同科之间共用，共用的范围越宽，效率越高，为遗传研究带来的方便就越多；同时，提供的信息越系统、越深入，就越便于比较，这在比较遗传学研究中尤其突出。以禾本科植物为例，禾本科植物包括小麦、水稻、玉米、谷子、高粱和珍珠粟等重要粮食作物、牧草和主要农业杂草，其重要性不言自明。Gale等人1998年通过由水稻克隆的cDNA等为共同探针，比较小麦、水稻、玉米、谷子、高粱和甘蔗等植物的RFLP图谱，不仅肯定了它们起源于一个共同的祖先染色体组，而且发现在这些有6000万年进化差异的物种间，染色体片段和基因的排列顺序虽然经过一定的重排，但仍表现了很大的保守性或称共线性，所有10000多种禾本科植物的千差万别只不过是等位基因的差别，由此形成了一个新的学科——禾本科比较遗传学。在禾谷类比较遗传学诞生和其后的系统研究中，由水稻克隆的cDNA等探针能为玉米、高粱、谷子、小麦等植物所利用，既探针的共用性起到了决定性的作用。研究还发现水稻的cDNA探针在谷子上的可利用率为74％，在小麦上为50％左右，说明这些探针在不同物种间的可转换性是不同的。

分子的标记方法在专利文献中屡有报导，如中国专利ZL200510060852.0就公开过一种禾本科通用型分子标记方法IACGM，它包括利用已知物种的基因组序列数据，在已知一个物种A的内含子长度多态性、即ILP的基础上，借助生物信息学方法，将ILP所在的物种A与物种B的cDNA测序数据进行比对；然后在多态内含子两侧外显子的保守序列上设计PCR引物，并通过电子PCR和实际PCR进行检验。再如中国专利申请200710150329.6曾公开了一种保守序列扩增多态性分子标记及其分析方法的技术，是根据表达序列标签EST设计PCR引物，通过PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析检测而得到DNA多态性。上述两个专利方法均是以编码区设计引物，来检测非编码序列的多态性。

禾谷类比较遗传学形成初期所用的研究方法均采用以DNA杂交为基础的RFLP方法，虽然在禾本科不同物种间的通用性较好，但工作量很大，耗时耗财污染大，也对以后的更深入研究带来不便。SSR等以PCR为技术为基础的特异标记虽然操作简单，但跨物种应用的通用性差，难以在不同物种的比较遗传学中应用。如果能创造一套为禾谷类植物共用的特异引物PCR标记，必将极大地促进禾谷类作物图谱构建、基因克隆和功能研究，这对于研究基础相对缺乏的中小作物，如谷子、糜子、黑麦、燕麦等尤其重要。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是建立一种能够跨物种应用，在几种禾本科作物或植物通用的、以PCR技术为基础的特异DNA分子标记体系。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

禾本科通用型分子标记CNS—AFLP，包括PCR技术和限制性酶切技术，主要包括CNS的发掘、引物设计、PCR扩增、扩增片段多态性检测和酶切片段多态性产生与分析步骤；引物设计以非编码保守序列CNS为模板设计引物，检测的多态性是两个CNS之间或者CNS和Exon之间非编码区的碱基序列长度和酶切位点变异。由于本方法所检测的仍是扩增片段长度的多态性(Amplified FragmentLength Polymorphism，AFLP)，但其特异引物设计是以基因组已知序列的CNS为模板进行，所以称之为CNS-AFLP分子标记。

本发明的禾本科通用型CNS-AFLP分子标记的开发包括下列步骤：

步骤一、CNS的发掘和记录

从Genbank等公共数据库网站寻找已登录的禾本科基因序列，选择其中已经过编码区分析并包含完整编码区CDS(coding sequence)的序列，然后使用BLASTN或BLASTX工具寻找与被测序列同源的其他禾本科的序列，将同源序列以gb格式输入GEVO中，运算法则选择blastn，选择默认参数使MatchReward(-r)＝1，Mismatch Penalty(-q)＝-2，Gap Open Penalty(-G)＝5，GapExtension Penalty(-E)＝2，Word Size(-W)＝7，Filter query sequence(DUST/SEG)(-F)选No，Expectation value(-e)＝30，进行比对，发掘其中所包含的非编码保守序列CNS，分析这些CNS在不同物种基因组中共线性或者排列顺序，将结果输出并作图。

步骤二、引物设计和通用性检测

以特定基因的不同部位(如上游前导区或启动子区或中间内含子区)的非编码保守序列CNS为模板，运用引物设计软件Primer Premier 5.0软件设计CNS-CNS或CNS-Exon等不同组合模式的引物对，选取禾本科材料水稻、玉米、小麦等为模板进行所设计引物的特异PCR扩增，扩增条件依不同引物对的具体退火温度而定，用获得的结果分析不同引物组合在禾本科特定种属中的通用性，以及不同部位CNS引物产生多态性机会的大小，从中选出反应稳定、通用性高、多态性强的CNS-AFLP标记。

步骤三、获得CNS-AFLP标记多态性

由特定基因CNS设计的引物扩增出特异片段的多态性可能表现为两种情况：一是不同测试材料间的扩增片段本身就表现长度多态性，二是在不同测试材料间的扩增片段本身无多态性，或多态性不丰富。对在不同测试材料间表现长度多态性的扩增片段，PCR扩增后用电泳凝胶成像、记录结果即可；对在不同测试材料间无多态性或多态性不丰富的扩增片段，用MspI或者HaeIII四碱基高频内切酶单酶切或双酶切扩增片段，然后电泳检测酶切后产物的多态性。

本发明已开发并经检测的禾本科通用型CNS—AFLP分子标记的特异性引物包括下列引物对，它们的核苷酸序列为5′→3′：

上述的特异性引物的通用性广泛物种的测验，筛选出在扩增稳定性、多态性、适应物种的广泛性方面均表现突出的引物包括下列十二组：

由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步在于：

本发明以禾本科作物的CNS为模板设计引物，由于CNS的在禾本科的高度保守性，使得设计的引物能够在不同物种间跨物种引用，克服SSR标记因物种特异性导致的应用范围受所开发物种基因组保守性的限制而应用范围窄的问题；同时CNS的跨物种高度保守性还保证了这种方法以PCR为基础的特异扩增性和扩增稳定性，即这种标记是一种特异的稳定可靠的标记；第三，CNS位于非编码区，扩增片段的设计可以有CNS-CNS或CNS-Exon等组合方式，所扩增的片段是两个CNS之间或CNS和编码区之间的非编码非CNS序列，这样的序列由于不受功能选择的限制，在不同物种之间和同一物种的不同基因型之间存在相对大的变异，从而产生扩增产物的多态性。

本发明由于CNS的高保守性，得以在CNS基础上设计出能跨多个物种应用的特异引物，同时两个CNS之间以及CNS与编码区保守序列之间不受选择压力序列的变异又为多态性提供了基础，这样就建立了一套在禾本科植物中通用的引物序列。不仅使得建立禾谷类通用的、以PCR为基础的、稳定可靠的特异标记成为可能，能够促进禾本科比较遗传学和比较基因组发展，也增大了比较遗传学跨物种应用的效率，尤其是为遗传基础相对缺乏的物种利用水稻等模式物种基因组知识提供了一种新的方法，促进这些作物基因组研究水平的提升。水稻和高粱基因组测序已完成，玉米、谷子等基因组测序正在进行，在Genbank等公共数据库中已有大量的来自不同禾本科植物及其它动植物的已知基因序列，并正在迅猛增长，为寻找CNS序列和引物设计提供了条件，使得本发明CNS-AFLP标记更简便易行。本发明的方法不仅能够成为一种在禾本科中通用的分子标记，甚至能够扩展运用到其他动植物中，建立其它动植物的通用引物序列，成为构建高密图谱的标记，并像其他类型分子标记一样应用于多个方面的遗传研究，对同一个构图群体，CNS-AFLP可同时与其他分子标记同时应用，因而建立CNS-AFLP标记方法也是其他分子标记的丰富与补充，提高标记图谱的丰度。另外，CNS-AFLP由于是以已知基因序列为模板，它还与特定基因相联系，因而是一种功能性分子标记。

附图说明

图1.CNS-AFLP分子标记开发应用流程。

图2.供试129个基因中的CNS统计结果。

图3.不同类型基因的共线性表现。

图4.珍珠粟和玉米的tb1基因经GEVO软件CNS发掘的比对结果。

图5.引物tb1--cns7f/tb1-cns2r在禾本科10个物种中的扩增。其中M为扩增产物大小Marker，1到10分别为大麦、黍子、小麦、高粱、水稻、玉米、谷子、燕麦、珍珠粟和龙爪稷。

图6-1.引物lg2-cns8f/lg2-cns9r在禾本科10个物种中的扩增。其中M为Marker，1到10分别为水稻、大麦、小麦、燕麦、黍子、谷子、珍珠粟、高粱、玉米、龙爪稷。

图6-2.引物lg2-cns8f/lg2-cns9r在禾本科10个物种中的扩增产物经TaqI酶切的多态性表现。M为Marker，1到10分别为水稻、大麦、小麦、燕麦、黍子、谷子、珍珠粟、高粱、玉米、龙爪稷。

图6-3.引物lg2-cns8f/lg2-cns9r在禾本科10个物种中的扩增产物经MspI酶切的多态性表现。M为Marker，1到10分别为水稻、大麦、小麦、燕麦、黍子、谷子、珍珠粟、高粱、玉米、龙爪稷。

具体实施方式

本发明的CNS-AFLP分子标记开发应用流程如图1。下面通过对禾本科植物的通用CNS—AFLP开发与多态性检测的实施例对本发明做进一步详细说明：

实施例

1.材料准备

1.1 植物材料

本实施例选取10个禾本科不同属的代表作物检测引物的通用性及多态性表现，分别为水稻、大麦、小麦、燕麦、黍子、谷子、珍珠粟、高粱、玉米和龙爪稷。

1.2 主要试剂

DNA分子标记CNS-AFLP的引物由上海生物工程公司合成。PCR反应所用Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、100bp DNA ladder以及酶切反应所用的四碱基内切酶(MspI、HaeIII、HhaI、TaqI)均由大连宝生物工程有限公司生产。

十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate，SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、琼脂糖(Agrose)均由上海生工分装。

1.3 仪器设备

本实验所用PCR仪由Eppendorf公司生产；离心机由SIGMA公司生产。电泳系统：Power Pac HC、Power Pac1000型电泳仪；BIO-RAD universal HOOD II.凝胶成像系统由BIO-RAD生产。DYC^Z_P-310型电泳槽由北京市六一仪器厂生产。

2.标记的方法

2.1 禾本科作物CNS的发掘

本实施例采用http://synteny.cnr.berkeley.edu/CoGe/GEvo.p1网站提供的GEVO(Genome Evolution Analysis)软件来寻找CNS。从Genbank等公共数据库网站寻找已登录的禾本科基因序列，选择其中已经过分析并包含完整编码区(CDS，coding sequence)的序列。然后使用BLASTN或BLASTX等工具寻找与被测序列同源的其他禾本科的序列，将同源序列以gb格式输入GEVO中，运算法则选择blastn，选择默认参数(Match Reward(-r)＝1，MismatchPenalty(-q)＝-2，Gap Open Penalty(-G)＝5，Gap Extension Penalty(-E)＝2，WordSize(-W)＝7，Filter query sequence(DUST/SEG)(-F)选No，Expectationvalue(-e)＝30，进行比对，将结果输出并作图。由于设计引物的需要，每个CNS的长度不少于15bp，选择CNS共线性(synteny)较好的基因作为引物设计的模板基因。CNS共线性计算采用共线性百分率，如图3，CNS共线性百分率的计算为：共线的CNS的数量/总的CNS的数量。

2.2 CNS-AFLP标记引物设计

以位于特定基因不同部位(上游前导区、启动子区、中间内含子区等)的CNS序列为模板，使用引物设计软件Primer Premier 5.0软件(http://www.Bio-soft.net)设计引物，按照特异扩增的要求设计CNS-CNS和CNS-Exon等不同组合模式的引物对。

2.3 CNS-AFLP标记引物在禾谷类作物中的通用性检测

本发明选取的物种在禾本科中不同亚科内具有代表性，同时考虑所选物种的经济重要性，稻亚科(Oryzoideae)选取亚洲栽培稻；早熟禾亚科(Pooideae)选取小麦、燕麦和大麦；由于黍亚科(Panicoideae)涉及的作物种类较多，选取的代表也多，包括黍子、高粱、玉米、谷子和珍珠粟；画眉草亚科(Eragrostioideae)选取了龙爪稷。所有这些材料于2006和2007年种植在国家谷子改良中心的栾城试验站，用生长至6叶期的幼苗叶片进行液氮固定，并用CTAB方法提取这些材料的DNA。

2.3.1 DNA提取

(1)于冰箱中预冷研钵和研棒；

(2)将干燥的叶片和石英砂放入研钵中加液氮研磨成细粉后，迅速转入到装有800μl预热的CTAB抽提液(1.17M NaCl，0.0167M EDTA pH＝8.0，0.0835MTris-Hcl pH＝7.5，1.67％ CTAB，1％ β-巯基乙醇)的2ml离心管中，摇匀；

(3)将离心管于65℃温育45min，每10min上下颠倒一次；

(4)取出离心管，待冷却至室温后，加入等体积的氯仿/异戊醇(24/1)抽提裂解液，颠倒数次使之充分混匀，静置10min，至有机相由无色至绿色再至暗绿色为止；

(5)于4℃，12000rpm离心10min，用剪去尖部的tip头将上清液转移至另一离心管中，重复步骤4；

(6)取上清于1.5ml离心管中，加入2/3体积预冷异丙醇(约500ml)，于-20℃下沉淀30min；

(7)于4℃，12000rpm离心10min；

(8)弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次；

(9)吹干DNA，用100μl去离子水溶解DNA，置于4℃保存备用。

2.3.2 CNS-AFLP标记引物检测

PCR反应体系为20μL，反应混和液包括：2μL10倍反应缓冲液(Mg²⁺浓度为2.5mmol/L)，2μLdNTP(浓度分别是2.5mmol/L)，2μLPCR引物(10mol/L)，0.3μL DNA Taq酶(10U/μL；TaKaRa，大连产)，2μL模板DNA(50ng)，不足部分用双蒸水补足。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，35个循环(94℃变性1分钟，特异退火温度(Tm)退火1分钟，72℃延伸2分钟)；72℃延伸10分钟。PCR产物以1％琼脂糖进行凝胶电泳，电泳完毕后EB染色，在BIO-RAD凝胶成像系统中观察记录结果并照相。

2.4 扩增片段酶切的多态性表现：

电泳完成后，首先检测是否成功扩增、扩增片段大小、扩增片段本身在不同材料间是否具有多态性，记录结果；对于无多态性的扩增，进一步用四碱基内切酶酶切扩增片段，电泳检测酶切片段的多态性。

所用的酶包括MspI、HaeIII、HhaI、TaqI，酶切位点见图1，酶切反应体系为20μL，反应混合液包括0.5μL(10U/μL)四碱基内切酶，2μL10倍反应缓冲液，10μL PCR扩增产物，不足部分用双蒸水补足。反应混合液37℃酶切2小时。

3.结果与分析

3.1 禾本科作物CNS的发掘

采用软件B12Seq Viewer对禾本科的129个基因进行CNS发掘分析。129个基因中有111个基因来自于玉米，12个基因来自于小麦，3个基因来自高粱，1个基因(tb1)来自于珍珠粟，2个基因来自于水稻。其中编码酶的基因58个，编码调控蛋白的基因52个，其他类型基因19个。

特定基因CNS的数量、CNS的位置和在同源物种中的共线性是决定CNS-AFLP引物设计的关键。只用那些CNS数量多，共线性好且CNS之间及CNS与Exon之间距离适合PCR扩增的序列，才能被用来设计引物。因此首先进行了这些目标基因的CNS数量和共线性分析。供分析的129个基因中，共线性较好的有79个基因；37个为编码酶的基因，共线性百分率为50.64％；27个为编码结构蛋白的基因，共线性百分率为46.50％；15个为其他类型的基因，共线性百分率为70.11％。分析结果综合见图2和图3。

可以看出CNS数量最多的基因通常为调控基因，但它们的CNS共线性百分率却是这三类基因中最低的，并不适合CNS-AFLP引物设计；其它类型基因主要是编码结构蛋白的基因，虽然共线性百分率远高于另两类基因，但包含的CNS数量较少，登陆在数据库中的序列也有限，降低了其应用价值。因此，根据统计数据并结合具体实验结果，我们认为在编码酶和其他类型的基因中寻找到的CNS更适于设计CNS-AFLP引物。

在所分析的基因中，有111个基因是水稻序列和玉米序列比对，因为水稻基因组已测序，玉米的许多重要功能基因已克隆，并已完成了众多基因组区域的片段测序。其他18个基因有12来自小麦，3个来自高粱，2个来自水稻，1个来自珍珠粟等。

由于数据库中序列的庞杂，需要投入大量的时间进行序列的搜索。此外，水稻基因组只完成了测序，在基因结构和功能方面的研究还不深入；玉米中已经过详细分析的基因数量也有限，这些都限制了CNS-AFLP标记的应用。所以又从CoGe(http://synteny.cnr.berkeley.edu/CoGe/)上下载了包含16571对高粱和水稻同源序列的数据，利用GEvo发掘这些序列中的CNS，选取共线性较好的序列，以高粱为模板设计CNS-CNS引物。

3.2 CNS-AFLP标记引物设计

选取上述共线性较好的27个基因共设计了124对引物。按照植物种类划分以玉米序列为模板设计了44对引物，以珍珠粟序列为模板设计了6对引物，以小麦序列为模板设计了31对引物，以高梁为模板设计了43对引物。

由于PHYB、pgp1、tb1、lg2等基因CNS数量多且共线性好，通过CNS-CNS或CNS-EXON组合设计了较多的引物以便于筛选通用性较好的引物，其中以PHYB为模板设计了30对，以pgp1为模板设计了13对，以tb1为模板设计了6对，以lg2为模板设计了5对；其他基因多数设计了1～2对。表1为在tb1基因上设计的CNS-CNS以及CNS-Exon引物，这些引物在禾本科中都有较好的通用性，其中，引物tb1-cns7f/tb1-cns2r和引物tb1-cns7f/tb1-exon2r在10个禾本科物种中都通用。

表1.tb1基因上设计的引物序列及PCR产物

 

序号Code引物Primer序列5’to3’Sequence5’to3’产物(kb)Product扩增区域Amplified region1tb1-cns7ftb1-exon2rcactggtcctttgtttcgtgttggtaaagcggtaagt0.708intron+exon2tb1-cns7ftb1-exon1rcactggtcctttgtttcgctggatggcagacttgg1.163intron+exon3tb1-cns3ftb1-exon1rattcctgttgggtgtcgcatttccttggtggcttcg1.313intron+exon4tb1-cns1ftb1-exon1rtcacttgtagccaatagcgcttgtcgaagccgagcat0.941intron+exon5tb1-cns2ftb1-exon1rctgctcttagatgccaggaccgttgcatttgcatcttccctc1.05intron+exon6tb1-cns7ftb1-cns2rcactggtcctttgtttcggtcctggcatctaagagc0.65’UTR

所有本研究的引物设计的模板基因、引物类型如表2所示。

tb1是共线性较好的一个基因，经软件GEVO比对后的结果，见图4。该基因的CNS共线性比率为100％，而且，CNS都分布在基因的5’UTR区域。

3.3 CNS-AFLP标记引物在禾谷类作物中的通用性检测

按照设计的程序和每对引物特定的Tm值，对水稻、大麦、小麦、燕麦、黍子、谷子、珍珠粟、高粱、玉米和龙爪稷等10种代表禾本科不同亚科，且具有重要经济价值的作物进行PCR扩增，有的引物如tb1-cns7f/cns2r能够在所有10个物种中均扩增出目的条带(如图5所示)；更多的引物对则是能在这10种作物中的几种能扩增出目的条带。

表2.用于CNS-AFLP标记设计引物的基因及引物类型和数量

在所设计的124对引物中，有46对引物在禾本科中的通用性较好，占所有引物的37.1％。其中，在10种作物中均可扩增出目的条带的有6对，可以在9个物种中通用的有2对引物，可以在8个物种中通用的有2对引物，可以在7个物种中通用的有4对引物，可以在6个物种中通用的有4对引物，可以在5个物种中通用的有5对引物，可以在4个物种中通用的有10对引物，可以在3个物种中通用的有8对引物，可以在2个物种中通用的有5对引物。由此结果可以得出目前能在4个物种以上通用的引物共有33对，占总引物的26.6％。

从CoGe上下载的包含16571对高粱和水稻同源序列的数据，利用GEvo发掘这些序列中的CNS，选取共线性较好的序列，以高粱为模板设计了60对CNS-CNS引物，在这60对引物中，57对引物有扩增，可用率为95％。其中，在10种作物中均可扩增出目的条带的有3对，可以在9个物种中通用的有5对引物，可以在8个物种中通用的有4对引物，可以在7个物种中通用的有2对引物，可以在6个物种中通用的有4对引物，可以在5个物种中通用的有5对引物，可以在4个物种中通用的有5对引物，可以在3个物种中通用的有10对引物，可以在2个物种中通用的有9对引物。由此结果可以得出目前能在4个物种以上通用的引物共有28对，占总引物的46.7％。所有引物的通用性检测结果列于表3。

表3.CNS引物序列及其在禾本科10个物种中的通用性

3.4 扩增片段酶切的多态性表现：

lg2(liguleless2)与叶舌的形态建成有关，编码一种亮氨酸拉链蛋白，是一类调控基因。在该基因的5’UTR区设计了两对引物——lg2-cns13f/lg2-cns8r和lg2-cns8f/lg2-cns9r；在intron区设计了一对引物lg2-cns14f/lg2-cns16r；设计了两对CNS-EXON引物，分别为lg2-cns14f/lg2-exon3r和lg2-cns9f/lg2-exon4r。这五对引物在禾本科的10个物种中都有不同程度的通用性及多态性表现，图6-1至图6-3为引物lg2-cns8f/lg2-cns9r在禾本科10个物种中的扩增及扩增片段酶切的多态性表现。