可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌及筛选驯化方法

摘要

可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌及筛选驯化方法，它涉及细菌及筛选驯化方法。它解决了现有细菌不适用于处理微污染水源水和低温处理的问题。本发明细菌SRA10为鲁菲不动杆菌，属于不动杆菌属，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2889，保藏日期为2009年1月19日。筛选方法：一、分离纯化；二、制菌液；三、菌液筛选培养；四、取存活菌株的菌液筛选培养；五、重复步骤四1～2次后取存活菌株进行逐步低温驯化；六、取低温驯化后存活菌株的菌液，复筛后即得。本发明中筛选驯化所得细菌能在2～10℃的低温条件下处理微污染水源水。

说明书

技术领域

本发明涉及细菌及筛选驯化方法。

背景技术

氨氮(NH₃-N)以离子态氨(NH₄⁺)和非离子态氨(NH₃)两种形式存在于水中。饮用水中氯化了的氨超过0.2mg/L会引起嗅味的问题，还会降低消毒效果，氨在水管中，经亚硝化菌作用，生成亚硝酸盐，对人体健康带来危害。饮用水中的难降解有机物难降解、易于通过食物链生物富集而放大其危害。

随着对异养硝化-好氧反硝化方面的研究逐步深入，并分离出大量的异养型硝化菌，如Peseudomonas spp、Alcaligenes faecalis、Thiosphaera pantotropha、Thauera mechernichensis等。但以上菌株处理过程中会发生出水中亚硝酸盐和硝酸盐积累现象，对人体有危害，且会产生N₂O，对环境造成二次污染。名称为“脱氮不动杆菌及其降解废水中氨氮的方法(中国专利号：ZL200410019474.7，申请日：2004年06月04日，授权公告日：2006年07月26日)”的专利中公开了一株脱氮不动杆菌(Acinetobacter sp)YY-5，CGMCCNo.1154，降解废水中氨氮的方法，可在好氧条件下将废水中的氨氮直接氧化成氮气，但是该菌株应用时进水氨氮浓度均较高，最低时进水氨氮浓度也在50mg/L以上，不适用于处理氨氮浓度在5mg/L以下的微污染水源水，而且在降解氨氮时，控制温度为15～40℃，不适用于低温处理，如黑龙江省，年平均气温最高只有4.9℃，而松花江每年有6个月以上的时间，水温处于10℃以下，因此在北方地区冬季时期应用上述菌种是难以达到处理要求的。《中国环境科学》，2003；23(6)：644～647在研究低温下生物陶粒反应器去除水源水中氨氮时虽然在低温条件下有较好的氨氮去除效果，但却导致了亚硝酸盐的大量积累，对人体健康带来危害。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有细菌在去除水中有机物及氨氮时存在出水中亚硝酸盐和硝酸盐积累现象、产生N₂O对环境造成二次污染以及不适用于处理微污染水源水和低温处理的问题，而提供可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌及筛选驯化方法。

可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌SRA10为鲁菲不动杆菌Acinetobacter lwoffii，属于不动杆菌属(Acinetobacter)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2889，保藏日期为2009年1月19日；低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧菌，为球状或短杆状，长为1.5μm～2.5μm，宽为1.0μm～1.5μm，无芽孢和鞭毛，进行抽搐运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，菌落圆形，菌落表面隆起，光滑，菌落呈粘性并附着于培养基。

可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮细菌的筛选驯化方法按以下步骤实现：一、将微污染水源水在温度28～32℃、150～170r/min的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上，在28～32℃的条件下分离培养48h，然后挑取特征不同的单菌落，分别接种于LB固体培养基上纯化培养24h；二、将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，在28～32℃的条件下培养24h后，得菌液；三、取1ml菌液接种于筛选培养基中，在28～32℃的条件下培养48h；四、取存活菌株的菌液1ml转接于新鲜的筛选培养基中，在28～32℃的条件下培养48h；五、重复步骤四1～2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化，逐步低温驯化是在20℃的条件下培养48h，驯化3代后取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在15℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在8℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在6℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在2℃的条件下培养48h，驯化3代；六、取5ml2℃下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入1ml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2℃下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2℃、140r/min的条件下振荡8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液体培养基中，在2～10℃的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入1ml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2℃下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于微污染水源水中，在2℃、140r/min的条件下振荡8h，选取总有机碳降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由1.9g的Na₂HPO₄、2.0g的KH₂PO₄、0.01g的MgSO₄·7H₂O、0.005g的CaCl₂·2H₂O、5.0g的NH₄Cl和余量的水组成，pH值为6.0～8.0，所述余量的水为微污染水源水。

本发明中可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌，接触酶阳性、氧化酶阴性、甲基红试验阴性、不产生乙酰甲基甲醇、不产生H₂S、不水解淀粉、不液化明胶、产生吲哚、生长pH值为6～8，生长温度为2～30℃。

本发明中筛选驯化所得可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌能在2～10℃的低温条件下处理微污染水源水，氨氮降解率达90％以上，有机物去除率达60％～70％，且无硝酸盐和亚硝酸盐积累，不产生N₂O。

本发明中低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌SRA10为鲁菲不动杆菌Acinetobacter lwoffii，属于不动杆菌属(Acinetobacter)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2889，保藏日期为2009年1月19日。

附图说明

图1为具体实施方式六中低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮细菌的原子力显微镜观察图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌SRA10为鲁菲不动杆菌Acinetobacter lwoffii，属于不动杆菌属(Acinetobacter)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2889，保藏日期为2009年1月19日；可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧菌，为球状或短杆状，长为1.5μm～2.5μm，宽为1.0μm～1.5μm，无芽孢和鞭毛，进行抽搐运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，菌落圆形，菌落表面隆起，光滑，菌落呈粘性并附着于培养基。

本实施方式中可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌是根据《伯杰细菌鉴定手册》初步判定为不动杆菌属，然后经过SHERLOCK微生物系统鉴定为鲁非氏不动杆菌属(Acinetobacter lwoffii)。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式二不同的是可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌，接触酶阳性，氧化酶阴性；甲基红试验阴性，不产生乙酰甲基甲醇；不产生H₂S，不水解淀粉，不液化明胶；产生吲哚；生长pH值为6～8，生长温度为2～30℃。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式三：本实施方式可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮细菌的筛选驯化方法按以下步骤实现：一、将微污染水源水在温度28～32℃、150～170r/min的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上，在28～32℃的条件下分离培养48h，然后挑取特征不同的单菌落，分别接种于LB固体培养基上纯化培养24h；二、将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，在28～32℃的条件下培养24h后，得菌液；三、取1ml菌液接种于筛选培养基中，在28～32℃的条件下培养48h；四、取存活菌株的菌液1ml转接于新鲜的筛选培养基中，在28～32℃的条件下培养48h；五、重复步骤四1～2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化，逐步低温驯化是在20℃的条件下培养48h，驯化3代后取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在15℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在8℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在6℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在2℃的条件下培养48h，驯化3代；六、取5ml 2℃下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入1ml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2℃下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2℃、140r/min的条件下振荡8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液体培养基中，在2～10℃的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入1ml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2℃下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于微污染水源水中，在2℃、140r/min的条件下振荡8h，选取总有机碳降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由1.9g的Na₂HPO₄、2.0g的KH₂PO₄、0.01g的MgSO₄·7H₂O、0.005g的CaCl₂·2H₂O、5.0g的NH₄Cl和余量的水组成，pH值为6.0～8.0，所述余量的水为微污染水源水。

本实施方式步骤一中LB固体培养基在121℃下灭菌15～30min后使用。

本实施方式步骤二中LB液体培养基在121℃下灭菌15～30min后使用。

本实施方式步骤三中筛选培养基在121℃下灭菌15～30min后使用。

本实施方式步骤四、五和六中的存活菌株为使筛选培养基中出现浑浊的菌株。

本实施方式步骤六中含5g活性炭的50ml蒸馏水在121℃下灭菌20～30min后使用。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤一中LB固体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、10g NaCl的和余量的水组成，pH值为6.0～8.0。其它步骤及参数与具体实施方式三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是步骤二中LB液体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成，pH值为6.0～8.0。其它步骤及参数与具体实施方式四相同。

具体实施方式六：本实施方式可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮细菌的筛选方法按以下步骤实现：一、将6个微污染水源水样分别在温度30℃、160r/min的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上，在30℃的条件下分离培养48h，然后挑取特征不同的单菌落，分别接种于LB固体培养基上纯化培养24h；二、将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，在30℃的条件下培养24h后，得菌液；三、取1ml菌液接种于筛选培养基中，在30℃的条件下培养48h；四、取存活菌株的菌液1ml转接于新鲜的筛选培养基中，在30℃的条件下培养48h；五、重复步骤四2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化，逐步低温驯化是在20℃的条件下培养48h，驯化3代后取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在15℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在8℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在6℃的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液1ml接种于筛选培养基中在2℃的条件下培养48h，驯化3代；六、取5ml2℃下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入1ml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2℃下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2℃、140r/min的条件下振荡8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液体培养基中，在2℃的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入1ml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2℃下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于微污染水源水中，在2℃、140r/min的条件下振荡8h，选取总有机碳(TOC)降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由1.9g的Na₂HPO₄、2.0g的KH₂PO₄、0.01g的MgSO₄·7H₂O、0.005g的CaCl₂·2H₂O、5.0g的NH₄Cl和余量的水组成，pH值为6.0～8.0，所述余量的水为微污染水源水。

本实施方式步骤一中微污染水源水样为沿江(河)从上游至下游于江(河)中心处每隔10米分别取水，共取样6处。

本实施方式中筛选得到具体实施方式一中的低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌，如图1所示，无鞭毛；经检测，在2℃的条件下处理微污染水源水，氨氮降解率达92％，有机物去除率达70％，且无硝酸盐和亚硝酸盐积累，不产生N₂O。