具有抗炎作用的新型靶向融合蛋白及其应用

摘要

本发明公开了一种具有抗炎作用的靶向融合蛋白－抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv－Crry及其应用。其目的是提供一种具有特异靶向性的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv－Crry及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv－Crry是通过连接肽在抗P选择素单链抗体ScFv的氨基端连接补体抑制物Crry(1－319aa)得到的融合蛋白。实验证明，ScFv－Crry能显著提高抑制补体介导的细胞裂解效，并可在免疫损害部位高度聚集，能够明显抑制炎症的发生发展。因而其可制备成针对治疗炎症反应的靶向P选择素补体抑制物新型基因工程靶向蛋白药物。本发明将在医药学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于基因产品领域，特别是涉及一种具有特异靶向性的抗P选择素单链抗 体靶向补体抑制物ScFv-Crry及其在制备治疗机体炎症反应的药物中的应用。

背景技术

炎症是人类疾病中最常见而复杂的病例过程，可以发生于机体的任何部位和任何 组织。炎症反应是多种疾病如肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病及创伤 后共同的重要的病理过程。从局部的病理变化看来，它们都有很多共同点，即都是机 体对致炎因子的损伤作用所产生的一种过激反应。目前，大量的资料表明炎症的发生 与P选择素的高表达和补体的激活密切相关。

炎症反应始于炎症细胞黏附、迁移、浸润、活化以及炎症因子释放，白细胞与内 皮细胞的粘附是炎症的起始步骤，这一过程是由炎症细胞和血管内皮细胞表面的细胞 粘附分子所介导。粘附分子是由细胞合成的一种复合膜蛋白，存在于细胞膜或细胞外， 在炎症过程中对白细胞和内皮细胞间相互作用起着关键的作用。P选择素 (P-selectinectin，Ps)又称(GMP-140)，是一种分子量为140kD的I型膜糖蛋白， 主要分布于静息血小板的α颗粒和内皮细胞的Weibel palade小体中。P选择素作为血 小板/内皮细胞活化的标志和黏附受体，介导白细胞与活化内皮细胞等最初黏附，是 启动炎症反应并维持炎症状态的重要成分。当受炎性介质刺激后，P选择素快速转位 到细胞表面进行表达，与中性粒细胞、单核细胞上的抗原结合，介导白细胞在内皮上 黏附、滚动、聚集及活化并释放炎症递质，参与炎症反应。P选择素参与了肿瘤、心 血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相关的疾病(如关节炎、早老性痴呆 病、骨质疏松症等)等多种病理生理过程，其过度或持续表达已成为某些组织病变的 标志。正常情况下P选择素不表达或低表达，受到炎症、损伤等因素刺激后可显著表 达，且原先不表达的组织也出现表达。已有研究表明抗P选择素抗体、纯化游离P选择 素、抗sLe^X可抑制活化的血小板和单核细胞及中性粒细胞的连接，从而抑制炎症反应 产生。因此，抑制P选择素表达及其细胞黏附作用可为疾病的诊断和治疗提供了新的 策略。

补体既是生理性防御物质，又是造成病理性损伤的介质。补体系统能促进吞噬和 溶解靶细胞，是机体免疫防御机制的重要组成部分，对消除外来抗原的侵害，维护机 体内环境的平衡具有重要作用，但另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系 统活化又可产生炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞损伤。补 体激活过程中产生不同的蛋白水解片段，从而介导各种生物学效应调节作用、引起炎 症反应。另外，补体在细胞表面激活，由C5b-9组成MAC。MAC为大分子复合物，它形 成跨膜孑L道，使大分子物质和离子双向流动，导致细胞溶解；MAC还能促进释放细胞 因子、氧自由基和金属基质蛋白，加剧炎性反应。目前已证明，在肿瘤、心脑血管疾 病、糖尿病、自身免疫性疾病以及与年龄相关的如关节炎、早老性痴呆病、骨质疏松 症等多种的疾病的炎症反应均与补体的激活有关。

Crry是一种膜结合的补体调节蛋白。它是一个单链蛋白，有6或7个SCR，分子 量63—74kD。在经典途径和旁路途径上通过限制C3/C5转化酶的活性来阻断补体激活。 它是一种理想的补体抑制剂，可协同DAF及H因子加速C3转化酶解离及C3b、C4b的 裂解。Crry存在于细血管壁、上皮细胞和内皮细胞的细胞膜或胞质内，在C3水平阻 断补体级联反应而调节补体活化。有实验表明，在小鼠体内红细胞免受自发性补体攻 击的作用中，Crry是必不可少的。Li B等(Lihua Bao，Hanns M，Boackle AS，et al. Ttanagenic expression of a soluble complement inhibitor protects against renal disease and promotes survival in MRL/1pr mice[J].journal of immunology. 168(2)：3601-3607，2002.)的研究证明，在自发性狼疮性疾病的67只MRL/1Pr小鼠 模型中没有整合Crry基因的小鼠的肾损伤比例为42.5％，而87只整合有Crry转基 因小鼠的为16.4％，这说明了整合有Crry转基因的MRL/1Pr小鼠比没有转基因的小 鼠在肾部组织有更好的补体抑制作用，减轻了小鼠的肾损伤。并且由于可溶性蛋白 Crry在小鼠体内大量表达，有效地延长了MRL/1Pr小鼠的存活时间。另一方面，Crry 表达减少，对补体的抑制作用减弱，导致了补体过度激活，造成病理性损害。大量的 资料表明，增加体内Crry的表达量则可抑制补体过度激活所致的损害，而阻断Crry 表达则会加重炎症的发生发展。因此，Crry作为补体抑制剂可以减轻炎症反应所致的 病理学改变，作为潜在的抗炎因子具有自身免疫和炎症性疾病的治疗作用。

应用补体抑制剂抑制补体过度激活，能减轻机体造成的免疫损伤，从而应用于某 些疾病的治疗。目前，多种补体抑制物正在研制中，如美国已有CR1和C5a的单克隆 抗体进入二、三期临床。另外，抗MBLmAb，抗C5mAb和抗C9mAb、眼镜蛇毒因子、 N-乙酰肝素、蛋白抑制剂FUT-175等也有一定的抗补体作用。但这类系统性补体抑制 物虽然改善了炎症反应，由于补体系统是机体免疫防御机制的重要组成部分，同时全 身性的补体抑制，也会造成感染等潜在的副作用。因此，具有靶向特异性补体抑制剂 的研究越来越广泛和深人。靶向补体抑制疗法的特点是将补体抑制物特异性导向补体 活化位点和病理损伤部位，提高作用特异性，从而减少可能导致严重系统性补体抑制 的副作用。

发明内容

本发明提供了一种具有抗炎作用的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物 ScFv-Crry。

本发明所提供的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，是通过连接肽 在抗P选择素单链抗体ScFv的羧基端(C端)连接补体抑制物Crry得到的融合蛋白。

具体来讲，所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry，是下述氨基酸 残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失或添加并具有抗炎作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由569个氨基酸残基组成，自氨基端第251-569位氨 基酸残基为补体抑制物Crry，自氨基端第241-250位氨基酸残基为连接肽(Gly₄Ser)₂，自 氨基端第1-240位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自氨基端第1-122 位氨基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自氨基端第133-240位氨 基酸残基为抗P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。

编码上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的基因，是下述核苷酸 序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抗炎 作用的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸 序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在 65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1710个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1710 位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第 751-1710位碱基编码补体抑制物Crry，自5’端第721-750位碱基编码连接肽(Gly₄Ser)₂， 自5’端第1-720位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自5’端第1-336位 碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv的重链可变区，自5’端第397-720位碱基编码抗 P选择素单链抗体ScFv的轻链可变区。

含有本发明抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因的表达载体、转 基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry编码基因中任一片段的引物 对也在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了用于表达上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的 重组表达载体。

本发明所提供的用于表达上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的 重组表达载体，是含有抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因的重组表 达载体。

所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因可插入到重组表达载体 中。构建所述重组表达载体的出发载体，可为任意一种指本领域熟知的可进行外源基 因表达的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒(如腺病 毒、逆转录病毒或其它载体)。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒 和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制点、启动子、标记基因和 翻译控制元件。

所述原核表达载体可为pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或 pET-30a等；所述真核表达载体可为pEE14.1、pCMV5、pSilencel.0-U6(Ambion，Austin， TX，USA)、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(购于Promega公司)、pTEF1、pPICZd、 pAM82或pAAh5等。

其中，以pEE14.1为出发载体，构建的含有所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑 制物ScFv-Crry基因的重组表达载体为pEE14.1/ScFv-Crry。

可采用本领域技术人员熟知的方法构建含有所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑 制物ScFv-CD59基因的重组表达载体，如体外重组DNA技术，DNA合成技术和体内重 组技术等(Sambrook，et al Molecular cloing，a Laboratory Manual.Cold spring harbor laboratory.New York，1989)。所述抗P选择素单链抗体基因的DNA序列 可以有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。所述启动子可为： 大肠杆菌的lac或trp启动子、噬菌体启动子、反转录病毒和其它一些已知的可控制 基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。所述表达载体还包括翻译起始用的 核糖体结合位点和转录终止子。

此外，所述表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化 的宿主细胞的表型形状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因 以及绿色荧光蛋白(GFP)基因或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性基因等。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物 ScFv-Crry的方法。

本发明所提供的抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的表达方法，是 将所述用于表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的重组表达载体转化 或转导宿主细胞，培养宿主细胞，从培养基或细胞中分离纯化蛋白，得到抗P选择素 单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。

所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；低等真核细胞，如酵母细胞；高等 真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌；鼠伤寒沙门氏菌的 细菌细胞；真核细胞如酵母、植物细胞；果蝇S2或Sf9等昆虫细胞；CHO、COS、293 细胞或Bowes黑色素瘤细胞等动物细胞。所述宿主细胞优选为CHO细胞。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列，将 会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，长度通常为10-300个碱基对， 作用于启动子以增强基因的转录。如在复制起始点晚期一侧的长度约为100-270个碱 基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子或腺病毒增强子等。

可用本领域技术人员熟知的常规技术，将重组DNA转化宿主细胞，培养转化子， 诱导表达目的蛋白，并对重组蛋白进分离纯化。

培养含有本发明抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry编码基因的宿主 细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种治疗机体炎症反应的药物。

本发明所提供的治疗机体炎症反应的药物，它的活性成分为上述抗P选择素单链 抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry或其编码基因。

所述抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因可存在于真核表达载体 中。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载 体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。 上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为200μg抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物 ScFv-Crry/kg体重，每隔1天给药一次，疗程为14天；上述药物的用量一般为200 μg抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry基因/kg体重，每隔1天给药一 次，疗程为14天。剂量和疗程均可根据实际情况进行调整。

本发明提供了一种抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。该融合蛋白 是以P选择素作为“靶标”，抗P选择素单链抗体ScFv作为“载体”，补体抑制物 Crry作为“弹头”的针对治疗炎症反应的靶向P选择素补体抑制物。ScFv-Crry不仅 对炎症部位有靶向作用，还可对与炎症有关的两条激活途径(P选择素和补体)进行 抑制，不仅可达到治疗炎症的目的，同时降低用药剂量，降低副作用。实验证明， ScFv-Crry能显著提高抑制补体介导的细胞裂解效，并可在免疫损害部位高度聚集， 能够明显抑制炎症的发生发展，而且显著降低补体抑制物造成感染的副作用。因而可 以其为活性成分制备成针对治疗炎症反应的靶向P选择素补体抑制物新型基因工程靶 向蛋白药物。本发明将在医药学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为轻链和重链可变区基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图2为抗P选择素单链抗体基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图3为Crry基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图4为ScFv-Crry基因扩增产物的1.2％琼脂糖电泳检测结果

图5为抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的10％ SDS-PAGE检测结 果

图6为抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的Western Blot鉴定结 果

图7为补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果

图8为SPR检测结果

图9为生物学分布实验结果

图10为动物实验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的获得及其真核表达 载体的构建

一、抗P选择素单链抗体的获得

用下述方法筛选抗P选择素单链抗体，具体方法包括以下步骤：

1、细胞培养及鉴定：将分泌P选择素抗体的杂交瘤细胞(参照杂交瘤细胞和单克 隆抗体实验技术，许廷贵，1982.中的方法构建)(培养于含15％牛血清的完全 RPMI1640培养基中。培养箱含5％CO₂的混合气体，湿度为98％。用ELISA方法鉴定培养 上清中单抗的特异性和滴度，结果抗体滴度达到1∶3200，且有明显的种特异性。

2、mRNA的分离与纯化：用快速制备、纯化mRNA试剂盒(Promega)并参照试剂盒 说明书从大约2×10⁷个杂交瘤细胞中提取总RNA，并纯化mRNA，具体方法为：收集约 2×10⁷个细胞杂交瘤细胞，加入175μl裂解液裂解细胞，25℃ 13,000g离心10min， 收集上清，加入200μl 95％乙醇，转移到吸附柱中，13,000g离心1min，吸附RNA， 加入600μl RNA漂洗液，13,000g离心1min，加50μl DNase I，25℃孵育15min消 化DNA，再加入200μl Dnase终止液，13,000g离心1min，600μl RNA漂洗液漂洗一 次，250μl RNA漂洗液漂洗一次，100μl Nuclease-Free H20洗脱总RNA.取1.0mg总 RNA，加入RNase-Free Water至150μl，65℃孵育10min，加入3μl Biotinylated-Oligo(dT)Probe和13μl 20×SSC，冷却至室温，然后将RNA加入到 SA-PMPs中，室温孵育10min，用磁铁吸附SA-PMPs，弃上清，用300μl 0.1×SSC漂洗 4次，最后用100μl RNase-Free Water洗脱收集mRNA。

3、cDNA制备：以纯化的mRNA为模板，反转录合成cDNA，具体方法为：2μg mRNA， Random Primers 0.5mg/ml 2μl，加无核酸酶的水终体积为15μl，70℃加热8分钟，在 冰上冷却5min，短暂离心至管底部，加入5×Buffer 5μl， Ribonuclease Inhibitor 40u，37℃ 5min，再加入Sodium Pyrophosphate，40mM 2.5μl，AMV Reverse Transcriptase 30u，补加无核酸酶的水至总体积25μl，温和混匀，37℃ 60min，反 应结束后取出20μl作为模板，加入Second Strand 2.5×Buffer 40μl，Acetylated BSA， 1mg/ml 5μl，DNA Polymerase I 23u，RNase H0.8u，无核酸酶的水终体积为100μl， 14℃孵育2小时，加入10μl 200mM EDTA终止反应，即得到cDNA。

4、抗体可变区基因的扩增：用PCR方法，以反转录合成的cDNA为模板，在PCR反 应体系中分别加入一套抗P选择素单链抗体的轻链可变区(V_L)引物(引物序列为 GACATCCAGATGACCCAGTCT和CCGTTTTATTTCCAACTTTGT)或重链可变区(V_H)引物(引物 序列为GTGCAGCTGCAGGAGTCT和TCCTGAGGAGACGGTGACCGT)(Pharmacia)，10×PCR缓 冲液5μl，dNTP终浓度为2.5mM，混匀后经100℃变性5min，加入2单位Taq DNA聚合酶。 总反应体积为50μl。混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每个循环条件是：94℃ 变性30s。55℃退火90s，72℃延伸90s，反应进行到最后一个循环后在72℃保温10min。 反应结束后，分别从轻链和重链可变区基因扩增产物中取出3μl进行1.2％的琼脂糖 电泳检测，检测结果如图1所示，经PCR扩增获得了324bp的轻链可变区基因和366bp的 重链可变区基因，与预期结果相符，其余的用Sephagels^TMmBandprep Kit(Pharmacia) 回收纯化。

5、单链抗体基因的连接：将回收的轻链和重链可变区基因与连接引物(引物序 列为ACCGTCTCCTCAGGAGGCGGTGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCT和 GGTCATCTGGATGTCAGAGCCGCCGCCACCCGAGCCGCCTC CGCC，编码(Gly₄Ser)₂的DNA序列) 在等摩尔浓度的条件下，加入2.5mM的dNTP和3个单位的Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲 液5μl，反应体积为50μl。用液体石蜡油封闭后进行7个退火循环，每个循环的反应 条件为94℃变性30s，64℃退火4min。

6、单链抗体基因的扩增：以单链抗体基因为模板，在上述反应体系中，加入一 对5’端含有Sfi 1，3’端含有Not1酶切位点的引物(引物序列为 TCAGGCCATTATGGCCATGGTGCAGCTGCAGGAG和TCAGCGGCCGCTAACCGTTTTATTTCAAC)，进行 30次PCR循环，每个循环条件为94℃变性1min，55℃退火2min，72℃延伸2min，反应 进行到最后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后从PCR扩增产物中取出3μl 1.2 ％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图2所示，经PCR扩增获得了720bp的单链抗体基因， 与预期结果相符，其余的用SephagelsTM Bandprep Kit回收纯化。

7、单链抗体文库的构建及表达：将表达载体pCANTAB5E(Pharmacia)和回收后 的单链抗体基因分别经Sfi 1和Not1双酶切，在T4连接酶的作用下，将pCANTAB5E表 达载体和单链抗体基因16℃连接过夜。将重组质粒转化大肠杆菌TG1感受态细胞，并 把转化的细胞涂布在含100μg/mL氨苄青霉素LB培养板上，于37℃培养过夜。把生长 在平板上的转化菌全部收集下来，用2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖) 稀释细胞悬液至OD₆₀₀＝0.2，37℃培养培养至对数生长期(约OD₆₀₀＝0.4)，加入2×10⁹pfu M13K07辅助噬菌体，37℃培养1小时，离心。用10mL2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉 素和50μg/mL卡那霉素的2×YT)重悬沉淀细胞，37℃振荡培养过夜，离心后收集含 有重组噬菌体的上清，即为单链抗体噬菌体表达文库。

8、重组噬菌体抗体的筛选：用P选择素抗原(购自上海史瑞克生物科技有限公司) 包被聚乙烯培养皿，将含有重组噬菌体的上清与该培养皿中37℃孵育2小时。用PBS洗 平皿20次，再用PBST(含0.05％ Tween 20的PBS)洗平皿20次，弃PBST。加入10mL处 于对数生长期TG1细胞，37℃培养1小时。离心，收集上清，进行下一轮筛选。重复“吸 附-洗脱-繁殖”的筛选过程2次。再以M13K07辅助噬菌体(购自Pharmacia)超感染， 就可以生成富集克隆的噬菌体表面呈现文库。

9、单克隆重组噬菌体的筛选与鉴定：第三轮筛选后，用2×YT将TG1菌液做倍数 稀释(原液、1:10、1:100、1:1000)，然后涂布在SOBAG固体培养基(分子克隆，第 三版，黄培堂等译)上，30℃培养过夜。从平板上随机挑取94个单菌落，分别接种于 100μl 2×YTAG(含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖)培养液中，30℃培养过夜。 取20μl培养液，转接于200μl含5×10⁸pfu/mL M13K07的2×YTAG培养液中，37℃培养 2小时。离心，用200μl 2×YTAK(含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的 2×YT)重悬沉淀细胞，30℃培养过夜。离心、收集上清，即为单克隆重组噬菌体。

用P选择素抗原包被酶联板，用0.5％BSA作为阴性对照，用羊抗M13噬菌体抗体作 为阳性对照。1％BSA的37℃封闭1小时。把100μl重组噬菌体抗体上清和封闭液的等 体积混合物加入到酶联板中，对照孔中加入M13噬菌体。37℃孵育1小时，PBST(含0.05 ％ Tween 20的PBS)洗板3次，PBS洗板3次。每孔加入100μl羊抗M13噬菌体抗体 IgG-HRP(1:2000)，37℃孵育1小时。PBST和PBS一次各洗板3次，加入新鲜配制的底物 H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处检测每孔的光吸收 值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出与P选择素结合活性 最强的阳性克隆。

10、阳性克隆重组质粒的DNA序列分析：用T7DNA序列TAATACGACTCACTATAGGG 测定该阳性重组质粒上抗P选择素单链抗体的DNA序列，结果该基因具有序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列，由720个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-720位碱基， 编码具有序列表中SEQ ID NO：4的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’端第1-366 位碱基编码重链可变区，自5’端第397-720位碱基编码轻链可变区，将该抗体命名 为ScFv(亦称V_L-Linker-V_H)。

二、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的获得

1、Crry基因的克隆：用RNA提取试剂盒(Promega)并参照试剂盒说明书提取小 鼠淋巴瘤细胞(协和细胞中心：CCC0235)组织的总RNA，并反转录成cDNA。用PCR 方法，以此cDNA为模板，在PCR反应体系中加入Crry(1-319aa)的上、下游引物(引 物序列为CTCACATGCTACCACTGT和ACTTTTGTTACACAAGTT)，10×PCR缓冲液5μl，dNTP 终浓度为2.5mM，2单位Taq DNA聚合酶，混匀后加矿物油。进行30个循环反应，每 个循环条件是：94℃变性30s。55℃退火30s，72℃延伸40s，反应进行到最后一个循 环后在72℃保温5min。从扩增产物中取出3μl进行1.2％琼脂糖电泳检测，检测结 果如图3所示，经PCR扩增获得了960bp的Crry基因，与预期结果相符，其余的用 SephagelsTM Bandprep Kit(Pharmacia)回收纯化。

2、ScFv-Crry基因的扩增：将抗P选择素单链抗体ScFv基因和回收的Crry (1-319aa)基因与连接引物(引物序列为 TTGGAAATAAAACGGGGCGGAGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCT和 GTGGTAGCATGTGAGAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCTCCGCC，编码(Gly4Ser)2的DNA序列) 在等摩尔浓度的条件下，加入2.5mM的dNTP和3个单位的Taq DNA聚合酶，10×PCR 缓冲液5μl，反应体积为50μl。用液体石蜡油封闭后进行7个退火循环，每个循环 的反应条件为94℃变性30s，64℃退火4min。再在上述反应体系中，加入一对5’端 含有Hind III，3’端含有Sma I酶切位点的引物(引物序列为 TACAAGCTTGTGCAGCTGCAGGAGTCT和TACCCCGGGACTTTTCTTACACAAGTT)，进行30次PCR 循环，每个循环条件为94℃变性50s，55℃退火60s，72℃延伸70s，反应进行到最 后一个循环后在72℃保温10min。反应结束后从PCR扩增产物中取出3μl进行1.2 ％的琼脂糖电泳检测，检测结果如图4所示，经PCR扩增获得了1710bp的DNA片段， 与预期结果相符，其余的用SephagelsTM Bandprep Kit(Pharmacia)回收纯化。

3、ScFv-Crry真核表达载体的构建：将纯化的目的基因经Hind III和Sma I双酶 切，与经同样双酶切的真核表达载体pEE14.1连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到携带抗P选择素单链抗体靶向补体抑制 物—ScFv与Crry融合基因的重组表达载体，命名为pEE14.1/ScFv-Crry。将阳性克 隆重组质粒进行DNA测序分析，由1710个碱基组成，自5’端第751-1710位碱基编 码补体抑制物Crry，自5’端第721-750位碱基编码连接肽(Gly₄Ser)₂，自5’端第1-720 位碱基编码抗P选择素单链抗体ScFv，其中，自5’端第1-336位碱基编码抗P选择 素单链抗体ScFv的重链可变区，自5’端第397-720位碱基编码抗P选择素单链抗体 ScFv的轻链可变区。将此抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物命名为ScFv-Crry(亦 称V_L-Linker-V_H-Linker-Crry)。

实施例2、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry高效表达细胞株的筛选 及抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的纯化

一、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry高效表达细胞株的筛选

为了得到在分子结构、理化特性和生物学功能方面更接近于天然的高等生物蛋白 质分子，利用脂质体将实施例1获得的重组真核表达质粒pEE14.1/ScFv-Crry转染至中 国仓鼠卵巢细胞CHO中。转染24小时后，吸去培养基，加入10mL新鲜的选择性培养基 DMEM+10％FCS+25μm MSX。在含5％CO₂的混合气体，湿度为98％的37℃培养箱中培养。 2周后，出现大约1-2mm的克隆，用克隆环将出现的克隆转接至24孔板中，每孔加入1mL 选择性培养基DMEM+10％FCS+25μm MSX继续培养。转化子生长至5天后，吸取上清。 将该上清100μl加入到用P选择素抗原包被的酶联板中，37℃孵育1小时，PBS洗板3次。 每孔加入100μl HRP标记的二抗抗体IgG(1:2000)，37℃孵育1小时。PBS洗板3次，加 入新鲜配制的底物H₂O₂-OPD，室温反应20min，加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在A₄₉₀处 检测每孔的光吸收值。光吸收值为阴性对照的2.1倍以上的为阳性克隆，从中挑选出 与P选择素结合活性最强的阳性克隆，即为高效表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制 物ScFv-Crry的CHO细胞株。

二、抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry的纯化

将高效表达抗P选择素单链抗体靶向补体抑制物ScFv-CCrry的CHO细胞株放大培 养，收获上清。将上清缓慢加入HiTrap N-hydroxysuccinimide column(Amersham Biosciences)中，纯化单链抗体。用0.01mol/L pH 7.4的PBS洗脱，流速为1mL/min， 至洗出液OD₂₈₀<0.02为止。加入0.1mol/L pH 2.4的甘氨酸-HCl缓冲液，流速为1mL/min， 收集吸附下来的成分，立即以1mol/L碳酸钠中和，以免蛋白变性。经SDS-PAGE和 Western Blot鉴定，结果如图5和图6所示，经表达获得了63KD的目的蛋白，且该蛋白 可与Crry和P选择素特异结合，与预期结果相符，表明获得了纯度很高的抗P选择素单 链抗体靶向补体抑制物ScFv-Crry。

实施例3、体内外生物学活性鉴定和动物实验

一、补体裂解抑制实验

为测定对补体的抑制活性，60％～80％融合的CHO细胞用乙二胺四乙酸分开，用 DMEM洗2次，然后重悬于DMEM中，使其终浓度为10⁹/L。在细胞悬液中加入100mL/L兔抗 CHO细胞膜抗血清，4℃作用30min，使细胞致敏。然后弃抗血清，细胞重悬于用DMEM 稀释的NHS中，终体积为50μL或100μL。37℃作用60min，最后用胎盘兰染色排除法 测量细胞成活力(活细胞与死细胞均计数)。融合蛋白ScFv-Crry用DEME稀释后先加入 到NHS中，再加入至CHO细胞悬液。终浓度以100g/L NHS可导致大约90％抗体致敏的对 照CHO细胞溶解为准。补体介导的红细胞溶解抑制实验用抗体致敏的羊红细胞(EAs)进 行测定。溶血试验在明胶佛罗那缓冲液(GVB⁺⁺)中进行，终体积为300μL，包含有2.5 ×10⁷Eas，NHS按照1∶300稀释。反应混合物在37℃孵育60min，最后加入300μL含 10mmol/L EDTA-PBS溶液终止反应。离心，取上清，在413nm波长下用光谱成像仪对 上清中的血红素进行定量检测。补体介导的CHO细胞和红细胞溶解实验结果如图7所 示，靶向补体抑制物ScFv-Crry比相应的非靶向补体抑制物的抑制效果明显。

二、生物传感器亲和力分析

ScFv-Crry融合蛋白与生物素标记的P选择素(P选择素-生物素)相互作用的动力 学分析用表面细胞质基因组共振(SPR)检测系统进行检测(BIAcore 3000仪器)。按照 每个流动细胞平均50mg/L的量，将P选择素-生物素以2μL/min的速度注射到BIAcore 抗生物素蛋白链菌素传感器芯片上，作用20min，缓冲液是0.5×PBS(pH7.4)(含有 0.5g/L Tween20)。从捕获的P选择素上获取的SPR信号产生BIAcore反应单位(范围是 250到500)。以不加融合蛋白组作为对照。25℃，以25μL/min的流速，用0.5× PBST(0.5g/L Tween20)洗涤后，通过检测ScFv-Crry融合蛋白浓度(500nmol～1μm/L) 来评估其亲和力。SPR检测结果如图8显示，融合蛋白ScFv-Crry与P选择素-生物素有 较高的结合与解离速，表明了ScFv-Crry与P选择素亲具有较高的亲和力。

三、生物学分布实验

采用Iodogen法将ScFv-Crry融合蛋白标记¹²⁵I，在涂布有200μg Iodogen的EP 管中，依次加入现配制的50mmlo/L PBS(pH7.4)150μl、含1mg BSA溶解的ScFv-Crry 100μl(100μg)、Na¹²⁵I溶液15μl(185MBq)，室温下间断轻微摇动标记管15min。 SEP-PAK C18柱分别用甲醇、双蒸水和0.1％三氟乙酸(TFA)各5ml依次洗涤使其活化； 标记混合物上柱，0.1％TFA淋洗；60％的乙腈溶液洗脱，收集前1.5ml洗脱液。经冷 冻干燥后，用含1mg/mlBSA的PBS溶液稀释、分装，-80℃冰箱贮存备用。雄性DBA/1J 小鼠尾根部皮下注射0.1ml胶原II和完全弗氏佐剂(均购于美国Sigma公司)，第 21天加强一次建立类风湿关节炎(CIA)小鼠模型。试验和分组方法如下：①对照组 尾静脉注射¹²⁵I-ScFv-Crry(2ug)，分别在24h、48h后断头处死，收集血液，取出 组织器官，称重并测定其放射性(Bq)，结果换算为ID％/g组织。②关节炎组尾静脉 注射¹²⁵I-ScFv-Crry(2ug)，分别在24h、48h、72h、96h后，采取同上处理、检测。 ③关节炎治疗组，尾静脉注射一次¹²⁵I-ScFv-Crry(0.25ug)，24h后，采取同上处理、 检测。④关节炎治疗组，每天尾静脉注射一次¹²⁵I-ScFv-Crry(0.25ug)，连续7天、 24h后，采取同上处理、检测。结果分析如图9所示，表明ScFv-Crry可在关节炎部 位高度聚集。

四、动物实验

利用类风湿关节炎(CIA)小鼠模型(同上)，从第21天开始试验，分组如下： ①注射50μl PBS对照组。②ScFv-Crry治疗组，每天注射一次ScFv-Crry(0.25)mg， 共注射7次。③ScFv-Crry治疗组，每天注射一次ScFv-Crry(0.25)mg，共注射4次。 ④ScFv-Crry治疗组，注射一次ScFv-Crry(0.25)mg。第23天开始临床评分，按一下 标准对动物关节炎程度计分：0分，无关节炎；1分，轻微炎症和爪部发红；2分，严 重红斑和肿胀，影响爪部功能；3分，爪部或关节变形、僵硬，失去功能。每只小鼠 四肢最高总分为12分。结果如图10所示，从第23天开始ScFv-Crry三个治疗组的关节 炎严重程度明显低于PBS组。

以上实验结果表明ScFv-Crry融合蛋白与非靶向补体抑制物相比，抑制补体介导 的细胞裂解效能显著提高；靶向补体抑制物ScFv-Crry可在免疫损害部位高度聚集， 能够明显抑制炎症的发生发展。

序列表

<160>4

<210>1

<211>569

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

<210>2

<211>1710

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

<210>3

<211>720

<212>DNA

<213>噬菌体

<400>3

<210>4

<211>240

<212>PRT

<213>噬菌体

<400>4