丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法，包括：酶标板，能与HCV E2蛋白特异性结合的三种多肽，生物素标记的能与HCV E2蛋白特异性结合的三种多肽，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。一种夹心法试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，步骤是首先包被多肽，再加入待测病人血清，第三是加入生物素标记的多肽，第四是加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，第五是加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。多肽及其标记物作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。可广泛应用于医学等相关领域。

说明书

技术领域

本发明属于丙型肝炎检测技术领域。更具体涉及一种与丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒，同时，本发明还涉及一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒检测丙型肝炎病毒的方法，以及多肽和包括生物素等标记的多肽在作为检测丙型肝炎病毒表面包膜抗原夹心法试剂盒中的应用，可广泛应用于医学等相关领域。

背景技术

丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎)是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)引起的肝脏炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布，主要通过血液传播。据世界卫生组织统计，全球HCV感染率约为3％，估计有1.7亿人感染HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万。我国血清流行病学调查资料显示，一般人群抗HCV阳性率为3.2％，各地区感染率有一定差异。急性HCV感染者约80％发展为慢性丙型肝炎(CHC)，在20年间约20％可发展为肝硬化，每年约有1％～4％肝硬化患者发展为肝癌。CHC已成为不可忽视的重要疾病，及早发现和治疗CHC患者已受到重视。CHC治疗目的包括根除或长期抑制病毒复制，减轻肝内炎症和纤维化，最终阻止进展为肝硬化、肝癌和肝功能衰竭，并提高患者的生活质量。

HCV病毒颗粒直径30～60nm，含类脂外膜，属于黄病毒科，是一种单股正链RNA病毒，全长约9500bp，HCV整个基因组只有一个可读框(ORF)，位于基因组中央。在基因组的5’和3’末端各有一段非编码序列。5’末端有一个长度和序列非常稳定的非编码区(URT)，可以说是整个基因组最为保守的区域，长度是341个核苷酸。3’末端非编码区由三部分组成，从编码病毒前体蛋白的可读框的第一个终止密码之后是30～40个核苷酸的非编码变异序列，然后是polyU(或polyA)结构，最后面有98个核苷酸的高保守序列。中间是几乎跨越了整个基因组的大的ORF，由9 033个核苷酸组成，能编码约3 010～3 033aa的病毒前体多聚肽，经过蛋白酶切割修饰后，前体多肽产生2种结构蛋白，即核心蛋白(C区)和膜蛋白(E区)，5种非结构区蛋白：NS₁、NS₂、NS₃、NS₄和NS₅。HCV的复制是利用RNA指导的RNA多聚酶，又称RDRP，并无阅读保护酶来修正复制中的错误，因而HCV的变异较大，尤其在结构基因的E区的3’末端和非结构基因的NS1区的5’末端之间是一个高度可变区，在结构基因的C区和非结构基因的NS₃、NS₄和NS₅区则保守性较高。

目前，临床上检测HCV感染的方法大致包括：(1)ELISA法检测抗-HCV抗体，包括重组免疫印迹(RIBA)；(2)PCR检测HCV的RNA，包括荧光PCR、免疫PCR法(PCR-ELISA)、及用于定量的bDNA和NASBA技术；(3)基因型芯片检测技术。酶联免疫吸附法检测抗HCV的特异性好，灵敏度高，操作简便，目前已成为采供血机构检测抗-HCV的常规方法。然而抗-HCV样本的浓度介于试剂盒临界范围时，由于受到各种不确定因素如试剂盒的敏感度、操作人员技术熟练程度及其责任心、实验室温度、加样器等影响，很可能造成假阳性或假阴性的结果。文献曾报道用ELISA法检测抗-HCV灰带区血样经重复检测有12.6％(11/87)的假阴性率。对落在灰区范围内的随机抽样样本进行的PCR检测中，HCVRNA的阳性率为18％(3/17)，表明灰区内样本确实存在着病毒复制。如果没有设置灰区，一年之内就可能有5份抗-HCV阳性的样本输入到无辜的患者体内。为提高抗-HCV的检出率，最大限度地防止漏检，提高输血的安全性，笔者认为灰区的设置有着重要的意义。至于灰区的范围应该多大才合适，还须做进一步的研究。对于落在灰区内的样本应进行重复检验。有条件的单位应予行PCR检测，以提高检验的准确性。PCR检测HCV的RNA，特别是支链DNA(bDNA)技术的最大特点是不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，用于HCV RNA的动态水平研究结果准确。但bDNA技术的局限性也显而易见，即放大倍数少、敏感性低、检测范围窄、不适用于HCVRNA的低水平检测。基因芯片技术适用于研究HCV的流行病学、变异趋势、传播途径，对丙型肝炎患者判断病情、指导治疗、预测疗效及预后有重要意义，但其成本高，易出现假阳性。

由于现有的临床检测HCV感染的方法的各种局限性，临床工作者迫切希望出现一种新型的临床检测HCV的方法，该方法应具有特异性高，成本低廉，操作简便，诊断迅速的特点。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒，能快速、灵敏、准确的检测丙型肝炎病毒。

本发明另一个目的是在于提供了一种丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒的检测方法，该方法特异性高，成本低廉，检测速度快，操作方便，省时效率高。

本发明的丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒在快速检测HCV感染中可广泛应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：

一种丙型肝炎病毒表膜抗原夹心法试剂盒，它包括：

a、酶标板(CellStar@，购自武汉大风生物科技有限公司)；

b、生物素标记的能与HCV E2蛋白特异性结合的12肽；

c、多肽为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的序列；

d、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；e、辣根过氧化物酶的底物；

f、酶联免疫检测仪(购自南京华东电子集团医疗装备有限公司)；

g、E2蛋白作为标准阳性孔。

核糖体文库筛选技术是将编码随机肽的DNA文库在体外转录、翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成mRNA一核糖体一蛋白质三聚体结构，此三聚体形式将蛋白和mRNA信息连接在一起，使基因型和表型得到统一。利用固相化抗原或受体的特异性的单克隆抗体亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA一核糖体一多肽复合物，通过降低Mg²⁺浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA，PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过几轮筛选，能找到与抗体特异性结合的多肽。近年来，应用核糖体展示技术已进行了许多研究，如筛选配体或受体，筛选抗体或确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物。

一种与丙肝病毒包膜抗原高度特异结合的多肽具体制备步骤如下：

一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下：

A.挑取含有pGEX-KG-E2(见参考文献Li，et al.，Engineering ofN-glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances Tcell responses for DNA immunization，Vaccine.2007.25：1544-1551.)的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司)接种于3ml含有氨节青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表达载体，购自Amersham Biosciences公司)的大肠杆菌BL21DE3，37℃培养12～16小时。

B.将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37℃培养到OD600为1～2。

C.加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1mM，30℃诱导4～5小时。

D.将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4℃，7700g，5min离心，弃上清。

E.沉淀物用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4℃，7700g，5min离心，弃上清。

F.将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF：17.42mg PMSF溶于1ml异丙醇中，-20℃保存)的PBS中。

G.将菌液放置冰中，超声碎菌，加入20％曲通X-100(Triton X-100：1mlTritonX-100溶于4ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1％，4℃，轻混30分钟。

H.每EP管中加入1ml超声降解的菌液，4℃，12000g，10min离心，取上清。

I.4℃，12000g，离心10min，再取上清。

J.各EP管加入20μl琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B：购自AmershamBiosciences公司，美国)，混匀，室温20～25℃孵育30min。4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清。

K.每个EP管中各加入100μl 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose 4B的悬浊液收集于一管，4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清，共洗涤3次。

L.加入与Sepharose 4B等量的谷光苷肽洗脱缓冲液(Glutathione ElutionBuffer：0.0154g谷光苷肽溶解于0.25ml pH 8.0的1M过滤除菌，分装，4℃保存)，室温20～25℃轻轻混匀10min，4℃，5000rpm，5min，取上清。

M.重复步骤L两次。收集的上清则为E2-GST融合蛋白。

二、制备随机DNA文库的步骤如下：

A.寡核昔酸为3’-CCT CTA TAT AGG TAC CGA TCG(NNM)₁₂AGG CCG GTAGTA GTA GTA GTA GTA CCTAGG CCA-5’(90bp)(划线部分分别为SD序列、启始密码子、His Tag、斜体部分为BamHI酶切位点)(N代表A，C，T或G，M代表A或C)

B.第一轮PCR的上游引物U1为5′-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACAACG GAA GGA GAT ATA TCC ATG-3′(43bp)(划线部分为5’端茎环和斜体部分为核糖体结合位点：RBS)，下游引物D1为3′-GTA GTA CCTAGGCCA TCA CCT TCACCA TCA CCG AGT GGA AGT TCA CAT ACGG-5’(52bp)(划线部分分别为BamHI酶切位点、Gly-Ser序列和3’端茎环)

C.第二轮PCR的上游引物U2为5′-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AATCAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3′(42bp)，(划线部分分别为PstI酶切位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。

D.以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为：

10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg²⁺)   5μl

dNTP mix(10mM)                          1μl

引物U1(20μM)                            1μl

引物D1(20μM)                            1μl

寡核苷酸(0.05μg/μl)            1μl

双蒸水                         40μl

Tag DNA聚合酶                  1μl

总体积                         50μl

反应程序：

a.95℃，2分钟

b.95℃，36秒；63℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。

c.72℃，5分钟

E.PCR产物经2％的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20ml1×TAE溶液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit，美国promega公司)回收。

F.经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为：

10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg²⁺)     5μl

dNTP mix(10mM)                            1μl

引物U1(20μM)                              1μl

引物D1(20μM)                              1μl

第一轮PCR产物                             4μl

双蒸水                                    37μl

Tag DNA聚合酶                             1μl

总体积                                    50μl

反应程序：

a.95℃，2分钟

b.95℃，36秒；62℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。

c.72℃，5分钟

G.步骤F所得得PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段即可用于体外转录翻译

三、制备核糖体文库的步骤如下：

A.核糖体文库构建及筛选流程如图2所示：将编码10¹⁴个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，从而形成一个稳定的mRNA-核糖体-新生多肽复合体结构。利用连接有Sepharose 4B(sigma公司)的E2-GST融合蛋白(E2-GST-Sepharose 4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体—多肽复合物，通过降低Mg²⁺浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过六轮筛选，能找到与E2蛋白特异性结合的多肽。

B.反应体系：

DNA模板(0.3mg/ml)                    10μl

S30 Premix without Amino Acids       20μl

氨基酸混合液(无甲硫氨酸)             2.5μl

氨基酸混合液(无亮氨酸)               2.5μl

S30 Extract，linear                  15μl

总体积                               50μl

轻轻混匀EP管中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部。

C.30℃孵育2.5小时。

D.EP管冰上放置5分钟中止反应，EP管中物质即为核糖体展示文库。

四、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下：

A.在100μl体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10×DNase I缓冲液(Promega公司，美国)6μl，37℃温育30min。然后加6μl中止缓冲液，65℃，10min灭活DNase。

B.取60μl E2-GST-Sepharose 4B，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清。

C.沉淀用500μl洗脱缓冲液：(washing buffer：50mM pH 7.5的Tris-醋酸，150mM氯化钠NaCl，0.1％ Tween-20，50mM醋酸镁)洗涤3次。

D.将100μl体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时。

E.4℃，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用washing buffer洗涤3次。

F.沉淀中加入100μl elution buffer，4℃摇动10min使mRNA与核糖体解离，4℃，5000rpm，5min离心，取上清。

G.用RNaid Kit(购自bio101公司，美国)回收mRNA，具体方法如下：

a.上清中加入3倍体积的RNA Binding Salt(RNaid Kit成份)混匀。

b.再加入10μl RNA MATRIX(RNaid Kit成份)，室温放置5min。

c.13000rpm，1min离心，弃上清。

d.用RNA wash(RNaid Kit成份)洗涤2次，(RNA wash:乙醇＝1:1)。

e.加入10μl无RNase的H₂O，45～55℃温育5min。

f.13000rpm，2min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。

H.RT-PCR，其反应体系为

AMV/Tfl 5×Reaction buffer          10μl

dNTP mix混合物                      1μl

引物U1(20mM)                        1μl

引物D1(20mM)                        1μl

MgSO₄(25mM)                         2μl

AMV Reverse Transcription           1μl

Tfl DNA Polymerase                  1μl

RNA模板                             1μl

无酶水                              29μl

总体积                              50μl

反应程序为：48℃，45分钟；94℃，2分钟；94℃，30秒；63℃，1分钟，72℃，2分钟；共31个循环；72℃，7分钟

I.2％琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。

J.回收分子量大小为155bp的RT PCR产物。

K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物。

L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19(购自美国Invitrogen公司)上，具体步骤为：

a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为

10×Y⁺Buffer       2μl

BamHI              1μl

PstI               1μl

ddH₂O              17μl

总体积             20μl

37℃水浴2小时

M.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit，美国promega公司)回收。

a.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为：

DNA                    4μl

pUC 19                 2μl

10×Buffer             2μl

T4连接酶               2μl

双蒸水                 10μl

总体积                 20μl

16℃孵育20小时

b.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α。取连接产物10μl，加入100μl DH5α感受肽细胞，冰浴30分钟，42℃ 90秒，再冰浴5分钟，加入800μl LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37℃，225rpm振摇40～50分钟。取200μl菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Amp^r)抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，37℃培养过夜。

c.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基(含氨苄青霉50μg/ml)培养过夜。

d.提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。

e.PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为：

10×Taq DNA polymerase buffer       5μl

dNTP mix混合物(10mM)                1μl

引物U2(20mM)                        1μl

引物D1(20mM)                        1μl

质粒DNA                             1μl

双蒸水                              40μl

Taq DNA Polymerase                  1μl

总体积                              50μl

反应程序为：95℃，2分钟；95℃，30秒；62℃，1分钟，72℃，1分钟24秒；共25个循环；72℃，5分钟

f.将步骤g所得产物经BamHI和PstI鉴定，正确的克隆送至上海华诺公司测序。

根据测序结果，请西安美联公司合成的，得到了4条一种分离的多肽，其氨基酸序列分别为：

PE2A(SEQ ID NO：1)：GFGRYRRHGSPW

PE2B(SEQ ID NO：2)：MAIGPYPACGSG

PE2C(SEQ ID NO：3)：LSVLVISMFNAV

PE2D(SEQ ID NO：4)：MARHRNWPLVMV

五、利用丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒检测丙肝病毒颗粒的步骤如下：

A.96孔酶标板在紫外灯下照射2小时。每孔加入100μl 0.05％戊二醛，室温(26℃)孵育1小时。每孔加入100μl20～50mg/L的多肽，室温(26℃)孵育1小时，或4℃过夜。PBS洗涤3遍，甩干。

B.每孔加入100μl封闭液乙醇胺封闭过夜，4℃孵育过夜。

C.洗涤液洗涤五次次后，分别加入2μg～8μg的生物素标记的多肽(包括bio-PE2D，bio-PE2A，bio-PE2B等不同组合)到96孔板中，每孔体积为100μl，37℃孵育1h。

D.洗涤五次后，加入100μl稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。

E.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。显示生物素标记的多肽能与丙肝病毒颗粒直接结合。

结果显示分离得到的多肽能特异性结合丙肝病毒E2糖蛋白，并能与丙肝病人血清里的病毒直接结合，其OD值大于与正常人血清结合的OD值的2～3倍以上。可达到直接检测病人血样里病毒含量的效果。

六、利用丙型肝炎病毒包膜抗原试剂盒检测丙肝病毒颗粒的步骤如下：

F.96孔板里每孔加入18μl丙肝病毒颗粒(3×10⁵个病毒)和162μl碳酸氢钠缓冲液(0.05M pH9.6)，混合，4℃孵育7小时。

G.洗涤液(0.1％ Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。

H.每孔加入100μl封闭液(1％BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4℃孵育过夜。

I.洗涤液洗涤五次次后，分别加入2μg～8μg的生物素标记的多肽到96孔板中，每孔体积为100μl，37℃孵育1h。

J.洗涤五次后，加入100μl稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。

K.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD450nm下读取OD值。显示生物素标记的多肽能与丙肝病毒颗粒直接结合。

该实验证明分离得到的生物素标记的多肽能特异性结合丙肝病毒颗粒(HCVcc)的E2糖蛋白，结合能力呈剂量依赖性。

本发明的优点

本实验首次应用核糖体文库筛选了与丙肝病毒包膜E2蛋白结合的多肽。筛选到的三种多肽(ZD，ZA，ZB)与丙肝病毒表面包膜E2蛋白蛋白具有高亲和力，本实验首次用多肽和生物素标记的多肽，双夹心法检测丙肝病人血清中的丙肝病毒包膜抗原，本发明所提供的针对丙肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽(12肽)分子量小，易于合成。与同类产品相比：灵敏度高于传统检测HCV抗体方法，接近传统HCVRNA检测方法，成本较传统检测HCVRNA检测方法低，不需要PCR仪。

附图说明

图1.随机DNA文库的构建流程图。

RBS表示核糖体结合位点，N代表A，C，T或G，M代表A或C

图2.核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的构建流程图。

图3.SPR检测多肽PE2A、多肽PE2B、多肽PE2C、多肽PE2D与E2蛋白的亲和力，它们结合的亲合力大小是：多肽PE2D>多肽PE2B>多肽PE2A>多肽PE2C。

图4A多肽抑制HCVE2蛋白与人肝细胞Huh7.5细胞结合

图4B多肽抑制HCVE2蛋白与DC-SIGN+靶细胞结合

(A)流式细胞仪检测多肽A、多肽B、多肽D分别抑制HCVE2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力(图4A)；多肽分别抑制HCVE2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力的剂量依赖性(图4A)。(B)流式细胞仪检测多肽A、多肽B、多肽D分别抑制E2蛋白结合DC-SIGN⁺-NIH3T3细胞的能力(图4B)；多肽分别抑制E2蛋白结合人肝癌细胞DC-SIGN⁺-NIH3T3的能力的剂量依赖性(图4B)。

图5.多肽PE2D能竞争性抑制E2与HCV的受体CD81，和肝素的结合。

图6.多肽PE2D能特异性抑制丙肝假病毒(HCVpp)感染靶细胞，且多肽PE2D抑制能力呈剂量的依赖性。图4A是假病毒的构建步骤，图4B是假病毒在293细胞里表达E1、E2蛋白，图4C是PE2D(SEQ ID NO：4)阻止假病毒感染Huh7.5细胞，并呈剂量依赖性。

图7.ELISA检测不同浓度PE2D与HCV病毒颗粒(HCVcc)结合的能力呈剂量依赖性。

图8.ELISA检测不同浓度的PE2D能抑制HCVcc与Huh7.5结合的能力不同，剂量越大，抑制能力越强。

图9.HCV包膜抗原诊断夹心法试剂盒检测方法：包被多肽，加样品，再加生物素表记的多肽，以及辣根过养化物酶标记的链霉亲和素检测HCV抗体阳性或HCVRNA检测阳性的丙肝病人血清中的病毒。正常人血清作为对照。

具体实施方式

实施例1

丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒的配置：

a、酶标板(CellStar@，购自武汉大风生物科技有限公司；

b、生物素标记的能与HCV E2蛋白特异性结合的12肽；

c、多肽为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示的序列；

d、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素；

e、辣根过氧化物酶；

f、酶联免疫检测仪(购自南京华东电子集团医疗装备有限公司)；

g、E2蛋白作为标准阳性对照。

一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下：

A.挑取含有pGEX-KG-E2(见参考文献Engineering of N-glycosylation ofHepatitis C Virus Envelope Protein E2 Enhances T cell responses for DNAimmunization，Vaccine.2007.25：1544-1551.)的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司)培养于3ml含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表达载体，购自Amersham Biosciences公司)，37℃培养12～16小时。

B.将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37℃培养到OD600为1～2。

C.加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1mM，30℃诱导4～5小时。

D.将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4℃，7700g，5min离心，弃上清。

E.沉淀用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4℃，7700g，5min离心，弃上清。

F.将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF：17.42mg PMSF溶于1ml异丙醇中，-20℃保存)的PBS中。

G.将菌液放置冰中，超声碎菌后加入20％曲通X-100(20％Triton X-100：1ml TritonX-100溶于4ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1％，4℃，轻混30分钟。

H.每EP管中加入1ml超声降解的菌液，4℃，12000g，10min离心，取上清。

I.上清再次离心，4℃，12000g，10min，再取上清。

J.各EP管加入20μl琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B：购自AmershamBiosciences公司)，室温(20-25℃，以下相同)轻混30min。4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清。

K.每个EP管各加入100μl 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose 4B的悬浊液收集于一管，4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清，共洗涤3次。

L.加入与Sepharose 4B等量的Glutathione Elution Buffer(0.0154g谷光苷肽溶解于0.25ml pH 8.0的1M PBS过滤除菌，分装，4℃保存)，室温轻混10min，4℃，5000rpm，5min，取上清。

M.重复步骤L两次。收集的上清则为所需E2-GST融合蛋白。

二、制备随机DNA文库的步骤如下(见图1)：

A.寡核昔酸为3’-CCT CTA TAT AGG TAC CGA TCG(NNM)₁₂AGG CCG GTAGTA GTA GTA GTA GTA CCTAGG CCA-5’(90bp)(划线部分分别为SD序列、启始密码子、His Tag、斜体部分为BamHI酶切位点)(N代表A，C，T或G，M代表A或C)

B.第一轮PCR的上游引物U1为5′-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACAACG GAA GGA GAT ATA TCC ATG-3′(43bp)(划线部分为5’端茎环和斜体部分为核糖体结合位点：RBS)，下游引物D1为3′-GTA GTA CCTAGG CCA TCA CCT TCA CCA TCA CCG AGT GGA AGT TCA CAT ACGG-5’(52bp)(划线部分分别为BamHI酶切位点、Gly-Ser序列和3’端茎环)

C.第二轮PCR的上游引物U2为5′-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AATCAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3′(42bp)，(划线部分分别为PstI酶切位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。

D.以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为：

10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg²⁺)         5μl

dNTP mix(10mM)                                1μl

引物U1(20μM)                                  1μl

引物D1(20μM)                                  1μl

寡核苷酸(0.05μg/μl)                           1μl

双蒸水                                        40μl

Tag DNA聚合酶                                 1μl

总体积                                        50μl

反应程序：

a.95℃，2分钟

b.95℃，36秒；63℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。

c.72℃，5分钟

E.PCR产物经2％的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20ml1×TAE溶液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit，美国promega公司)回收。

F.经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为：

10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg²⁺)      5μl

dNTPmix(10mM)                              1μl

引物U1(20μM)                               1μl

引物D1(20μM)                               1μl

第一轮PCR产物                              4μl

双蒸水                                     37μl

Tag DNA聚合酶                              1μl

总体积                                     50μl

反应程序：

a.95℃，2分钟

b.95℃，36秒；62℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。

c.72℃，5分钟

G.步骤F所得得PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA模板。

三、制备核糖体展示文库的步骤如下：

A.核糖体文库(见参考文献Wu，et al.，Peptides 2005，26(11)：2057-2063.)，构建及筛选流程如图2所示：将编码10¹⁴个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳定的复合体结构。利用连接有Sepharose 4B的E2-GST蛋白(E2-GST—Sepharose 4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体—多肽复合物，通过降低Mg²⁺浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经连接有Sepharose 4B的GST蛋白(GST—Sepharose4B)反筛以去除非特异性结合的多肽，E2-GST—Sepharose 4B正筛，经过六轮筛选，筛选到与E2蛋白特异性结合的多肽。

B.反应体系：

DNA模板(0.3mg/ml)                       10μl

S30 Premix without Amino Acids          20μl

氨基酸混合液(无甲硫氨酸)                2.5μl

氨基酸混合液(无亮氨酸)                  2.5μl

E.coli S30 Extract                      15μl

总体积                                  50μl

轻轻混匀步骤B中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部。

C.30℃孵育2.5小时。

D.EP管冰上放置5分钟中止反应。即得到核糖体展示文库。

四、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下(见图2)：

A.在100μl体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10×DNase I缓冲液(Promega公司，美国)6μl，37℃温育30min。然后加6μl中止缓冲液，65℃，10min灭活DNase。

B.取60μl E2-GST-Sepharose 4B，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清。

C.沉淀用500μl washing buffer(50mM pH 7.5的Tris-醋酸，150mM NaCl，0.1％ Tween-20，50mM醋酸镁)洗涤3次。

D.将100μl体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时。

E.4℃，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用洗脱缓冲液洗涤3次。

F.沉淀中加入100μl elution buffer，4℃摇动10min使mRNA与核糖体解离，4℃，5000rpm，5min离心，取上清。

G.用RNaid Kit(购自bio101公司，美国)回收mRNA，具体方法如下：

g.上清中加入3倍体积的RNA Binding Salt(RNaid Kit成份)混匀。

h.再加入10μl RNA MATRIX(RNaid Kit成份)，室温放置5min。

i.13000rpm，1min离心，弃上清。

j.用RNA wash(RNaid Kit成份)洗涤2次，(RNAwash:乙醇＝1:1)。

k.加入10μl无RNase的H₂O，55℃温育5min。

l.13000rpm，2min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。

H.RT-PCR，其反应体系为

AMV/Tfl 5×Reaction buffer         10μl

dNTP mix混合物                     1μl

引物U1(20mM)                       1μl

引物D1(20mM)                       1μl

硫酸镁(25mM)                       2μl

AMV Reverse Transcription          1μl

Tfl DNA聚合酶                      1μl

RNA模板                            1μl

无酶水                29μl

总体积                50μl

反应程序为：48℃，45分钟；94℃，2分钟；94℃，30秒；63℃，1分钟，72℃，2分钟；共31个循环；72℃，7分钟

I.2％琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。

J.回收分子量大小为155bp的RT PCR产物。

K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物。

L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19(购自美国invitrogen公司)上，具体步骤为：

a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为

10×Y⁺Buffer            2μl

BamHI                   1μl

PstI                    1μl

ddH₂O                   17μl

总体积                  20μl

37℃水浴2小时

b.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断(回收方法同上)。

c.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为：

DNA                         4μl

pUC 19                      2μl

10×Buffer                  2μl

T4连接酶                    2μl

双蒸水                      10μl

总体积                      20μl

16℃孵育20小时

d.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α。取连接产物10μl，加入100μl DH5α感受肽细胞，冰浴30分钟，42℃ 90秒，再冰浴5分钟，加入800μl LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37℃，225rpm振摇40～50分钟。取200μl菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Amp^r)抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，37℃培养过夜。

e.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基(含氨苄青霉50μg/ml)培养过夜。

f.提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。

g.PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为：

10×Taq DNA polymerase buffer           5μl

dNTP mix混合物(10mM)                    1μl

引物U2(20mM)                            1μl

引物D1(20mM)                            1μl

质粒DNA                                 1μl

双蒸水                                  40μl

Taq DNA Polymerase                      1μl

总体积                                  50μl

反应程序为：95℃，2分钟；95℃，30秒；62℃，1分钟，72℃，1分钟24秒；共25个循环；72℃，5分钟

h.将步骤g所得产物经BamHI和PstI鉴定，正确的克隆送至上海华诺公司测序。

M.根据测序结果，请西安美联公司合成12肽，见表1。

表1 筛选出的与E2蛋白结合的多肽序列

 

分离的肽氨基酸序列PE2AGFGRYRRHGSPWSEQIDNO：1PE2BMAIGPYPACGSGSEQIDNO：2PE2CLSVLVISMFNAVSEQIDNO：3PE2DMARHRNWPLVMVSEQIDNO：4

实施例2

表面等离子共振技术(SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的步骤如下：

A.让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。

B.注射40μl氨基偶联试剂(含0.02M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))，活化CM5传感片上的羧基。

C.用pH值为5.0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5mg/ml，注射该溶液40μl。

D.上机检测，流速为20μl/min。

E.将多肽PE2A、PE2B、PE2C、PE2D稀释为不同浓度，以2μl/min上机与CM5传感片上的E2蛋白作用7分钟。

F.以2μl/min的流速注射10μl的HCl再生液使基线恢复，实时采集响应信号。

G.用BIACORE的专用软件进行数据分析，我们发现分析PE2D与E2蛋白的亲和力最高，结果见图3，其亲和力有关参数见表2。

表2 多肽与E2蛋白相互结合作用的动力学数据

 

多肽ka/M^-1s^-1(×10⁴)kd/s^-1(×10^-3)k_A/M^-1(×10⁷)PE2A3.221.392.32PE2B2.561.222.10PE2CnononoPE2D7.511.455.18

实施例3

流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下：

A.培养人肝癌细胞Huh7.5(见参考文献Zhong，et al.，Robust hepatitis C virusinfection in vitro，2005，PNAS，102：9294-9299)和DC-SIGN⁺-NIH3T3(表面有DC-Sign分子的小鼠的成纤维细胞)细胞(见参考文献Wu，et al.，Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGNinteractions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virustype I transmission.J.virol.2002，76：5905-5914)。培养条件均为10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司购买)，培养于37℃，含5％二氧化碳的培养箱中。

B.将多肽PE2A、PE2B、PE2D分别与E2-GST蛋白混合(对照管加入GST蛋白)，总体积为50μl，其中多肽的浓度均为500μM，E2-GST蛋白和GST蛋白的浓度均为20μg/ml，37℃孵育30分钟。

C.将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和DC-SIGN⁺-NIH3T3细胞混合，总体积为100μl，其中细胞个数为2×10⁶个。37℃孵育30分钟。

D.每管加入1ml PBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用80μl重悬细胞。

E.加入20μl 1：500的E2-GST抗体，37℃孵育30分钟。

F.重复D步骤一次。

G.加入1μl PE标记的羊抗兔的二抗，37℃孵育30分钟。

H.每管加入1ml PBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用500μl重悬细胞。

I.经上机检测，申请人发现PE2A，安PE2B，PE2D分别与E2-GST蛋白作用后，能显著抑制E2蛋白结合到Huh7.5细胞(图4)及DC-SIGN⁺-NIH3T3细胞(图5)，且成剂量依赖关系，多肽剂量愈大，其与E2的亲合力愈强，抑制HCVE2侵袭靶细胞能力愈强(图4A和图4B)。

实施例4

多肽D能部分竞争性抑制E2与HCV的受体CD81，和肝素的结合(图5)。

实施例5

PE2D能抑制HCVppv假病毒(图6A，6B)侵袭人靶细胞(图6C).HCVppv假病毒的构建见图图6A，6B，PE2D抑制HCVppv假病毒侵袭人靶细胞的能力呈剂量依赖性，多肽D浓度愈大，其抑制能力愈强(图6C)。

实施例6

检测多肽PE2D与丙肝病毒颗粒(HCVcc)结合的步骤如下：

A.96孔板里每孔加入18μl丙肝病毒颗粒(3×10⁵个病毒)和162μl碳酸氢钠缓冲液(0.05M pH9.6)，混合，4℃孵育7小时。

B.洗涤液(0.1％Tween-20的PBS磷酸盐缓冲液)洗涤五次。

C.每孔加入100μl封闭液(1％BSA的PBS磷酸盐缓冲液)，4℃孵育过夜。

D.洗涤液洗涤五次次后，分别加入0μg，2μg，4μg，8μg的bio-PE2D到96孔板中，每孔体积为100μl，37℃孵育1h。

E.洗涤五次后，加入100μl稀释度为1:1000的辣根过养化物酶标记的链霉亲和素(HRP-advin，购自晶美公司)。

F.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值。显示bio-PE2D能与丙肝病毒颗粒直接结合。

该实验证明分离得到的多肽能特异性结合丙肝病毒颗粒(HCVcc)，结合能力呈剂量依赖性(图7)。

实施例7

检测多肽PE2D抑制丙肝病毒颗粒(HCVcc)感染人肝细胞Huh7.5细胞的步骤如下

A.培养人肝癌细胞Huh7.5于24孔板中，置于37℃，含5％二氧化碳的培养箱中，培养条件为10％胎牛血清的DMEM培养基，。

B.每孔加入PE2D和3×10⁵个丙肝病毒颗粒，PE2D的浓度分为200μM，400μM。

C.37℃孵育5小时，洗涤细胞后，加入培养基培养3天。

D.加入荧光标记的HCV-E2抗体(购自上海巴斯德研究所)与细胞孵育30分钟

E.荧光显微镜下计数每孔红色荧光点数(ffu/well，58nm)。

该实验证明分离得到的多肽PE2D能特异性抑制丙肝病毒颗粒(HCVcc感染人肝细胞，且剂量越大，抑制能力越强，呈剂量依赖性(图8)。

实施例8

一种夹心法试剂盒在制备检测丙型肝炎病毒包膜抗原的方法，利用该试剂盒检测150例丙型肝炎病人血清里的丙肝病毒(该病毒是从湖北.武汉有关医院收集到丙型肝炎病毒人血清里的丙肝病毒)，150例正常人血清作为对照(体检收集到正常人血清为参考物)，步骤如下：

A.96孔酶标板在紫外灯下照射2小时。每孔加入100μl 0.05％戊二醛，室温(26℃)孵育1小时。每孔加入100μl 30mg/L的多肽，室温(26℃)孵育1小时，或4℃过夜。PBS洗涤3遍，甩干。

B.封被：每孔加入100μl封闭液乙醇胺封闭过夜，4℃孵育过夜。

C.重复B步骤一次。

D.每孔加入100μl丙肝病人血清或健康人血清，37℃孵育1～2小时。

E.重复B步骤一次。

F.每孔加入100μl 10mg/L的生物素标记的多肽(北京华大基因公司合成)37℃孵育1～2小时。

G.重复B步骤一次。

H.每孔加入100μl 1辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(稀释度为1：1000)，37℃孵育30分钟。

I.加入邻苯二氨显色，酶标仪OD492nm下读取OD值(见图9)。结果显示生物素标记的多肽能特异性与丙肝病人血清里的病毒直接结合，其OD值大于与正常人血清结合的OD值的2～3倍以上。可达到直接检测病人血样里病毒含量的效果

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法

<130>丙型肝炎病毒包膜抗原夹心法试剂盒及检测方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

<210>2

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<212>PRT

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