白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法

摘要

本发明涉及一种白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶和显色剂；其中的反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5－CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT－ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT－3、下游内引物5－TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT－CTTTCTATCATC CAAATCGTAGA－3、上游外引物5－ACCGTTGATTT CCAATTCG－3、下游外引物5－TTAACTTGAGCCA TGGAGAT－3和甜菜碱；检测白色念珠菌的方法包括真菌DNA的提取、白色念珠菌的环介导等温扩增、显色检测。本发明的特点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方法，具体是一种白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法。

背景技术

白色念珠菌(Canidia Albicans)属于真菌界半知菌亚门—芽孢菌纲—隐球酵母目—隐球酵母科，是双相型单细胞酵母菌。在人体中，无症状时常表现为酵母细胞型；侵犯组织和出现症状时常表现菌丝型。白色念珠菌是一种腐物寄生菌，广泛存在于自然界，是人体正常菌群之一，平时生存于人体的皮肤、粘膜、消化道及其他脏器中，当机体抵抗力降低时，白色念珠菌就会繁殖，达到一定量时，人体就会发病，所以白色念珠菌是一种条件致病菌。妇女阴道上皮细胞糖原增加，酸性增强时，白色念珠菌会繁殖引起阴道炎，故本病常见于孕妇、糖尿病患者及接受雌激素治疗的患者。白色念珠菌可侵犯人体许多部位，引起：(1)皮肤念珠菌病，好发于皮肤皱褶处(腑窝、腹股沟，乳房下，肛门周围及甲沟，指间)，皮肤潮红、潮湿、发亮，有时盖上一层白色或呈破裂状物，病变周围有小水泡。(2)粘膜念珠菌病，以鹅口疮、口角炎、阴道炎最多见，在粘膜表面盖有凝乳大小不等的白色薄膜，剥除后，留下潮红基底，并产生裂隙及浅表溃疡。(3)内脏及中枢神经念珠菌病，可由粘膜皮肤等处病菌播散引起，有肺炎、肠胃炎、心内膜炎、脑膜炎、脑炎等，偶而也可发生败血症。

现有的白色念珠菌的检测方法有芽管法、NGL酶法、显色培养法、普通PCR、荧光定量PCR和直接免疫荧光法等，其中芽管法和NGL酶法均易出现假阳性，特异性不高；PCR灵敏却有高成本。环介导等温扩增方法可弥补这些不足，目前尚未见用环介导等温扩增方法检测白色念珠菌的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法，以克服现有技术的缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。

本发明的主要原理为：(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA；(3)内引物以原始茎环DNA做模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA；(4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。

本发明涉及的白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法中，包括的试剂如下(1)-(4)：

(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液：

其中包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—10mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；

上游内引物：

5-CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT-3、

下游内引物：

5-TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT-CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA-3、

上游外引物：5-ACCGTTGATTTCCAATTCG-3、

下游外引物：5-TTAACTTGAGCCATGGAGAT-3、

其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。

其中所述的10×Thermopol反应缓冲液中含有200mmol pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸(Tris—HCl)、100mmol/L氯化钾(KCl)、100mmol/L硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、20mmol/L硫酸镁(MgSO₄)和1％曲拉通X—100(Triton X—100)；

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；

(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。

上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22μL，其最佳组成为：2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、4.0μL10μmol/L上游内引物(FIP)、4.0μL10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL10μmol/L下游外引物(B3)、2μL100mmol/LMgSO₄、5μL5M甜菜碱和2.1μLddH₂O(灭菌双蒸水)。

使用上述方法检测白色念珠菌，依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检样品或真菌DNA的提取：

提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.6-2.0范围内，浓度在10-100ng/μL范围内。

(2)进行白色念珠菌的环介导等温扩增反应：

A.在装有22μLLAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置3—5min，立即置于冰上1—3min；

B.在反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65℃扩增反应45—90min；

C.将水浴调到80—85℃终止反应，3—5min后取出待检；

(3)显色检测

在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品含有或为白色念珠菌。

本发明是根据白色念珠菌SAP基因的六个序列设计了两个特异性内引物和两个特异性外引物，该基因序列为白色念珠菌各不同菌株型所共有，以保证检测不同来源的白色念珠菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适用于基层医疗机构。

具体实施方式

下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。

实施例1

按下列配方制作白色念珠菌的环介导等温扩增反应液：

(1)LAMP反应液：

含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、4.0μL 10μmol/L上游内引物(FIP)、4.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL 10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、2μL 100mmol/L MgSO₄、5μL 5M甜菜碱和2.1μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的上游内引物：

5-CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT-3、

下游内引物：

5-TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT-CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA-3、

上游外引物：5-ACCGTTGATTTCCAATTCG-3、

下游外引物：5-TTAACTTGAGCCATGGAGAT-3

其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；

(4)显色剂：为10％的荧光染料SYBR GREEN I。

按照以下(1)-(3)程序进行检测：

(1)样品DNA的提取

检测菌种白色念珠菌(Canidia Albicans)，菌种来源美国典型培养物保藏中心，编号ATCC10261。

使用北京天根生物工程公司的酵母质粒提取试剂盒提取样品DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。

(2)进行白色念珠菌的环介导等温扩增反应：

A.在装有22μLLAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；

B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1小时；

C.将水浴调到80℃终止反应，3min后取出待检；

(3)显色检测

在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检样品为白色念珠菌。

实施例2

按下列配方制作白色念珠菌的环介导等温扩增反应液：

(1)LAMP反应液：

含有2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、1.4μL 25mmol/L dNTP、4.0μL10μmol/L上游内引物(FIP)、4.0μL 10μmol/L下游内引物(BIP)、0.5μL 10μmol/L上游外引物(F3)、0.5μL 10μmol/L下游外引物(B3)、2μL 100mmol/L MgSO₄、5μL 5mol/L甜菜碱和2.1μL ddH₂O(灭菌双蒸水)。

其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。

上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP＝2:1:1:1。

(2)UNG酶：1U/μL；

(3)Bst DNA聚合酶：8U/μL；

(4)显色剂：为10％的荧光染料DNAGreen。

按照以下(1)-(3)程序进行检测：

(1)样品DNA的提取

检测菌种白色念珠菌(canidia Albicans)，菌种来源美国典型培养物保藏中心，编号ATCC14053。

使用大连宝生物工程公司的基因组DNA小量抽提试剂盒提取样品DNA，DNAOD260/OD280能够达到1.8，浓度达到20ng/μL。

(2)进行白色念珠菌的环介导等温扩增反应：

A.在装有22μLLAMP反应液的反应管中加入2μL待检模板DNA，和0.5μL的UNG酶，于恒温水浴上50℃放置3min，95℃放置5min，立即置于冰上1min；

B.在各反应管中加入1μL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65℃扩增反应1h；

C.将水浴调到80℃终止反应，3min后取出待检；

(3)显色检测

在待检的每个反应管中加入1μL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，则待检样品也为白色念珠菌。

核苷酸序列表

<110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>白色念珠菌环介导等温扩增快速检测方法

<160>4

<210>1

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)...(47)

<400>1

CACATTTTGGATAAGGTTCACCATT-ATAGAAACCTCAAGATTTCCGT  47

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)...(48)

<400>2

TCGTGTTCGTGAAAGTGAAGATAAT-CTTTCTATCATCCAAATCGTAGA  48

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)...(19)

<400>3

ACCGTTGATTTCCAATTCG  19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<221>prim_bind

<222>(1)...(20)

<400>4

TTAACTTGAGCCATGGAGAT  20