一种抗虫转基因水稻多重PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明提供了一种抗虫转基因水稻多重PCR检测试剂盒及检测方法。所述转基因水稻多重PCR检测试剂盒主要包括下列引物序列：CaMV－F：GCTCCTACAAATGCCATCA；CaMV－R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；Nos－F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；Nos－R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；Bt－F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；Bt－R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT。本发明的有益效果主要体现在：仅一次PCR可快速、准确检测当前国内抗虫转基因水稻，灵敏度可达0.1％，且成本低、准确率高，假阳性率低。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种可同时检测3～4种抗虫外源基因的转基因水稻多重PCR检测试剂盒及检测方法。

(二)背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一。自第一批水稻转基因植株在1988年问世以来，中国、日本、泰国、德国、菲律宾、瑞士、英国、美国、加拿大等国家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，许多转基因水稻品种已进入田间实验，并不断向实用化方向发展。我国转基因技术发展很快，其中，水稻转基因技术是我国少数几个具有国际竞争力的转基因技术之一，且倍受关注，已有多份转基因水稻材料获准环境释放，其中4份抗虫转基因水稻和1份抗病转基因水稻已开始申请安全证书。然而，近年来我国相继涌现的“湖北转基因抗虫水稻非法种植”、“亨氏婴儿营养米粉混入转基因成分”等事件，给我国转基因水稻的安全监管提出了十分迫切的要求。为此，开展我国自主开发的主要转基因水稻的检测方法将对我国转基因水稻安全监管具有重要意义。

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是利用一对与目标序列互补的引物，在DNA聚合酶的作用下达到扩增目标靶序列的技术，可用于基因检测。国内外已有多篇关于利用PCR方法对转基因产品进行定性检测的文献报道，但大都是针对一个外源基因进行扩增，即采用单一的一对寡核苷酸引物扩增一个目标靶序列，这一方法通常只针对某种转基因或其产物，只能满足一种或少数几个转基因品种的检测需要，检测方法繁琐，工作程序重复且耗费大量时间，不适合大批量样品的检测，已不能满足当前工作中快速通关的要求。多重PCR(Multiplex Polymerase ChainReaction，MPCR)也称复合PCR，是一种特殊的PCR技术，比单一PCR反应更快捷、更经济，只需1次PCR反应，就能同时检测多个靶标基因。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。目前这项技术在动物病毒性传染病和人类疾病检测中应用较多。邵碧英(2002)等应用多重PCR研究了转基因花卉中几种转基因成分(外源花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、胭脂碱合成酶Nos终止子，新霉素磷酸转移酶基因Npt II)的检测；王媛(2004)、徐景升(2005)、张平平(2007)等采用复合PCR对转基因大豆中转基因成分(CaMV35S启动子、Nos终止子，抗草甘膦的EPSPS基因)进行了研究；吴影等(2006)也对转基因大豆(CaMV35S启动子、Nos终止子，凝集素lectin基因)进行了检测。

应用多重PCR检测转基因的也有报道，但是都有缺点。吴影等(2006)研究了转基因水稻中CaMV35S、NPT II和潮霉素磷酸转移酶基因Hpt的三重PCR分析方法。该报道中只检测了外源启动子和筛选标记基因，忽略了对目标基因的检测。随着转基因技术的发展，目前已获得安全证书的转基因水稻都已剔除了筛选标记基因。因此，该技术从转基因水稻检测的实用角度来看等同于单引物CaMV35s的扩增。李伟丰(2007)等应用多重PCR技术建立了检测水稻种子中CaMV35S启动子、NoS终止子、Hpt、Bt毒蛋白基因CrylAb和GUS等外源基因成分的方法。该方法中不同引物所用浓度不同，跨度从0.2～1.5uM，PCR结果利用6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术来分析结果，实际操作繁琐且只能检测Bt毒蛋白基因中Cry l Ab这一种外源抗虫基因。

针对目前转基因水稻研发的进展，多种Bt基因以及其他抗虫基因已经应用到了水稻转基因研究中，结合我国转基因水稻研发和市场化发展的趋势，开发一种能同时检测转基因水稻中普遍存在的CaMV35S启动子、Nos终止子、Hpt、Bt毒蛋白基因(Cry l Ab，Cry l Ac或两者的融合基因)以及缸豆胰蛋白酶抑制剂基因Cpti等外源基因成分的方法就显得非常有必要。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、快速、简便、省时省力的抗虫转基因水稻检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种转基因水稻多重PCR检测试剂盒，主要包括下列引物序列：

CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT。

进一步，所述试剂盒为四重PCR试剂盒，引物序列如下：

CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT；

Hpt-F：TAG GAG GGC GTG GATATG TC；

Hpt-R：TAC ACA GCC ATC GGT CCA GA。

或者，引物序列为：

CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT；

Cpti-F：AAA ATG AAGAGC ACC ATC TTC；

Cpti-R：TCTAGA GTTCATCTTTCTCATCAT C。

本发明通过选用Bt毒蛋白基因的通用引物和Cpti基因引物扩大了检测抗虫转基因水稻中外源目的基因的范围，一次PCR反应即可检测Cry lAb、Cry l Ac及其融合基因和Cpti基因等4种目的基因和转基因水稻常用的CaMV35s启动子和Nos终止子。同时本发明选用引物是在各引物浓度为0.2uM的等摩尔条件下进行扩增，扩增产物通过一次普通的琼脂糖凝胶电泳即可有效的分开，方法简单易行。本发明所建立的方法只通过一次PCR反应就能同时检测目前抗虫转基因水稻中普遍存在的CaMV35S启动子、Nos终止子，Hpt基因、Bt毒蛋白基因(Cry l Ab，Cry l Ac或两者的融合基因)或Cpti基因等外源基因成分，基本包括了国内抗虫转基因水稻所有的外源转基因成分，且灵敏度达到0.1％的水平，优越性非常明显。

本发明还涉及一种转基因水稻多重PCR检测方法，包括：

(1)选取引物序列主要包括：

CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT；

(2)提取待检测水稻DNA，以待测水稻DNA为模板，在包括步骤

(1)所述引物序列的PCR反应体系中进行PCR反应；

所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液          终浓度为1.5×或2×

dNTPs              0.2mM

引物序列各         0.2μM

模板DNA            1.0uL

Taq DNA聚合酶      0.02U/uL

溶剂为ddH₂O；

PCR反应条件为：

94℃5min；94℃30s，退火温度58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min；

(3)取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测水稻是否含有相应外源基因。

PCR Buffer终浓度为1×，是指反应体系中PCR Buffer各组分含量与1×PCR Buffer中各组分浓度相同，PCR Buffer终浓度为2×，则是指反应体系中PCR Buffer各组分浓度为1×PCR Buffer中各组分浓度的2倍，以此类推；实际应用时，可取一定体积的10×PCR Buffer，按照各组分在反应体系中的浓度进行稀释，比如要求PCR Buffer终浓度为2×，则取反应体系总体积的1/5体积的10×PCR Buffer即可。10×PCR Buffer成分为：100mM Tris-HCl pH8.3，500mM KCl，15mM MgCl₂。

所述PCR为四重PCR时，所述方法如下：

(1)选取引物序列如下：

CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT；

Hpt-F：TAG GAG GGC GTG GATATG TC；

Hpt-R：TAC ACA GCC ATC GGT CCA GA；

(2)提取待检测水稻DNA，以待测水稻DNA为模板，在包括步骤(1)所述引物序列的PCR反应体系中进行PCR反应；

所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液              终浓度为1.5×

dNTPs                  0.2mM

引物序列各             0.2μM

模板DNA                1.0uL

Taq DNA聚合酶          0.02U/uL

溶剂为ddH₂O；

PCR反应条件为：

94℃5min；94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min；

(3)取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测水稻是否含有相应外源基因。

或者，所述方法如下：

a)选取引物序列如下：

CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA；

CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA；

Nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG；

Nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC；

Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC；

Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT；

Cpti-F：AAA ATG AAGAGC ACC ATC TTC；

Cpti-R：TCTAGA GTTCATCTTTCTCATCAT C；

b)提取待检测水稻DNA，以待测水稻DNA为模板，在包括步骤(1)所述引物序列的PCR反应体系中进行PCR反应；

所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液                终浓度为2×

dNTPs                    0.2mM

引物序列                 各0.2μM

模板DNA                  8.0ng/uL

Taq DNA聚合酶          0.02U/uL

溶剂为去离子H₂O；

PCR反应条件为：

94℃5min；94℃30s，退火温度60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min；

c)取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测水稻是否含有相应外源基因。

转基因抗虫水稻定性PCR检测中常规PCR选用的PCR反应体系通常为1×PCR缓冲液、0.2mM dNTPs、0.5uM单引物、0.1uL Taq DNA聚合酶(5U/uL)，PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，退火温度55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min。本发明在此基础上通过选用不同引物的组合、不同PCR缓冲液的浓度和引物浓度来建立和优化检测抗虫转基因水稻的多重PCR技术体系。

转基因产品检测中所用引物扩增的目标片段都是小于500bp的短片段，因为从加工后的转基因产品提取的DNA大部分是已经降解的片段。在多重PCR反应中，短片段扩增产物的引物在高盐浓度下扩增结果更好，高盐浓度会使长片段扩增产物难于变性解链，难以得到有效的扩增。本发明三重PCR检测CaMV35s、Nos和Bt和四重PCR检测CaMV35s、Nos、Bt和Cpti时使用PCR缓冲液浓度为2.0×，引物浓度0.2Um，退火温度60℃即可以保证各引物的有效扩增，又减少了引物二聚体的干扰和非特异带的产生。四重PCR检测CaMV35s、Nos、Bt和hpt时选择缓冲液浓度为1.5x，引物浓度0.2uM，退火温度60℃即可以保证hpt和其他引物的有效扩增，又减少了引物二聚体的产生。

本发明所检测的水稻几种外源基因是我国当前进入安全性生产阶段的转基因抗虫水稻常用的成分，因此本发明具有实用性；其次，本发明的方法可以缩短检测时间，单个样品从样品制备到结果检出只需1天时间；本发明检测所用方法为常规定性PCR和普通琼脂糖凝胶电泳检测，只需目前常规的分子生物学试剂，成本低；另外本发明检测灵敏度高，能达到国家标准制定的0.1％水平，同时相比于单引物PCR检测，本发明准确率高，假阳性比率低。通过不同的PCR仪对比检测以及不同的检测人员操作比对均能得到稳定的检测结果。

本发明的有益效果主要体现在：仅一次PCR可快速、准确检测当前国内抗虫转基因水稻，灵敏度可达0.1％，且成本低、准确率高，假阳性率低。

(四)附图说明

图1为不同PCR缓冲液浓度和引物浓度下一次三重PCR扩增结果对比；

图2为不同PCR缓冲液浓度下一次四重PCR扩增结果对比；

图3为一次四重PCR反应检测转基因水稻的4个外源基因(CaMV35s，Nos，Bt，Cpti)；

图4为不同模板浓度的多重PCR检测结果；

图5为不同转基因成分含量的多重PCR检测结果；

图6为不同的抗虫基因的多重PCR检测结果。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1、PCR引物的合成：

根据农业部953号公告-6-2007提供的CaMV 35s、Bt引物序列、国标GB/T19495.4-2004提供的Nos引物序列，何龙飞等(2007)提供的Cpti引物序列和NCBI数据库上登录的潮霉素抗性Hpt基因122～966位区域的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表1：

表1

  引物  名称  序列(5’-3’)  目标片断大小  bp  CaMV  35s  CaMV-F：GCTCCTACAAATGCCATCA  CaMV-R：GATAGTGGGATTGTGCGTCA  195  Nos  nos-F：CATGACGTTATTTATGAGATGGG  nos-R：GACACCGCGCGCGATAATTTATCC  118  Bt  Bt-F：GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC  Bt-R：CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT  301  Cpti  Cpti-F：AAA ATG AAGAGC ACC ATC TTC  Cpti-R：TCTAGA GTTCATCTTTCTCATCAT C  415  Hpt  Hpt-F：TAG GAG GGC GTG GATATG TC  Hpt-R：TAC ACA GCC ATC GGT CCA GA  845

2、样品DNA的小量提取：

水稻种子DNA的提取依据国家农业部953号公告-6-2007，具体为：

抽提液：

6.93％葡萄糖，2.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)，0.1％DIECA(diethyldithiocarbamic acid)

0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)5mmol/L EDTA(pH8.0)，使用时加入0.2％(V/V)的3-巯基乙醇。

裂解液：

1.4M氯化钠，2.0％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2.0％聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)，0.1％gDIECA，0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5)，1mmol/LEDTA(pH8.0)使用时加入0.2％(V/V)的β-巯基乙醇。

将福建农科院研发的转基因水稻II优科丰6号及其受体II优明86的稻谷分别磨成粉末，在1.5mL离心管中分别称取200mg(其中转基因水稻称取2份作为平行样，阴性对照称取1份)加入1mL预冷至4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5min，4℃条件下10000g离心15min，弃上清液。加入600μL预热到65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在65℃恒温保持40min，期间颠倒混匀5次。室温条件下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中。分别用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液和氯仿∶异戊醇溶液各抽提一次。室温条件下，10000g离心10min，取上清液转至另一新离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10体积3mol/L乙酸钠溶液(pH 5.6)，在4℃条件下，10000g离心15min，弃上清液，用70％乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加入50μL TE(pH8.0)溶解沉淀，加入2.0μL RNase A，37℃恒温保持30min。所得溶液即为样品DNA溶液。

将DNA溶液适当稀释后测定并记录其在260nm和280nm的紫外光吸收率，根据OD260值计算DNA浓度。

3、多重PCR扩增

3.1三重PCR：

将所提DNA稀释为浓度200ng/uL，PCR反应体系组成为：PCR缓冲液终浓度为0.4×、0.8×、1×、1.5×、2.0×或2.5×，0.2mM dNTPs，引物Camv35s、nos、bt各0.2uM或0.4uM，模板DNA1.0uL，0.1uL Taq DNA聚合酶(5U/uL)，补充ddH₂O至体积调整为25ul。

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，退火温度58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min。结果见附图1。

图1为不同PCR缓冲液浓度和引物浓度下一次三重PCR扩增结果对比；可检测转基因水稻的3个外源基因(Camv35s，nos，bt)，泳道1为阴性对照，2、3为在PTC-100型PCR仪上2次重复所提转基因水稻样品DNA；4和5为在PTC-200型PCR仪上2次重复所提转基因水稻样品DNA；其中a和b中引物浓度为0.2uM；c中引物浓度为0.4uM。

3.2四重PCR：

3.2.1将所提DNA稀释为浓度200ng/uL，PCR反应体系为：PCR缓冲液终浓度为1.0×、1.5×或2.0×，0.2mM dNTPs，引物Camv35s、Nos、Bt、Hpt引物各0.2uM，模板DNA1.0uL，0.1uL Taq DNA聚合酶(5U/uL)，补充ddH₂O至体积调整为25ul。

PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，退火温度55℃或60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min。结果见附图2。

图2为不同PCR缓冲液浓度下一次四重PCR扩增结果对比；可检测转基因水稻的4个外源基因(Camv35s，nos，bt，hpt)，其中图a中泳道1，2为水稻II优科丰6号2次DNA在PCR仪型号为PTC-100上的扩增结果，泳道3，4为水稻II优科丰6号2次DNA在PCR仪型号为PTC-200上的扩增结果；泳道5为阴性对照II优明86；M为100bp的DNA ladder；图b中泳道1为阴性对照II优明86，泳道2，3为水稻II优科丰6号2次DNA在PCR仪型号为PTC-100上的扩增结果，泳道4，5为水稻II优科丰6号2次DNA在PCR仪型号为PTC-200上的扩增结果；泳道；M为100bp的DNA ladder；图c中泳道1，2为水稻II优科丰6号2次DNA在PCR仪型号为PTC-100上的扩增结果，泳道3，4为水稻II优科丰6号2次DNA在PCR仪型号为PTC-200上的扩增结果；泳道5为阴性对照II优明86；M为100bp的DNA ladder。

3.2.2将所提DNA稀释为浓度200ng/uL，PCR反应体系为：PCR缓冲液终浓度为2×，0.2mMdNTPs，其中Camv35s，nos，bt，cpti引物各0.2uM引物，模板DNA1.0uL，0.1uL Taq DNA聚合酶(5U/uL)，补充ddH₂O至体积调整为25ul。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，退火温度55℃或60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃3min。

退火温度为60℃时，结果见附图3，其中泳道1、2为在PTC-100上2次重复所提转基因水稻样品DNA；3、4为在PTC-200上2次重复所提转基因水稻样品DNA；泳道5为另一试验者检测阳性转基因水稻的结果。以上实验在不同型号PCR仪上由不同的操作人员重复进行2次。

4、检测结果判定

PCR产物用2.0％的琼脂糖凝胶，染色剂溴化已锭浓度为0.5ug/mL，取PCR扩增产物7.0uL，在4V/cm条件下电泳1h，用Gel Doc凝胶成像系统进行结果分析。检测结果见附图。

由附图可见，本发明中扩增845bp的Hpt基因引物在2.0×PCR buffer浓度下，未能检测到扩增带。短片段118bp的nos引物扩增产物在1.5～2.0×PCR buffer浓度下扩增效率稳定。在2.0×buffer浓度下camv35s引物在500bp的一条非特异条带消失。在0.4×Buffer浓度时3引物没有任何扩增，在0.8倍的浓度下Bt引物没有得到扩增。三种引物浓度在0.2和0.5uM时，未见明显的扩增效率的差异，只是在0.5uM时引物二聚体明显，干扰了短片段扩增产物的分析。

实施例2：利用多重PCR技术检测不同模板浓度的转基因抗虫水稻

1、按照实施例1方法所述合成引物和提取转基因水稻II优科丰6号及其受体II优明86的DNA，测定DNA浓度为400ng/uL；

2、用TE缓冲液将所提样品DNA按比例稀释为200、100、50、25ng/uL；

3、按实施例1步骤3.1进行3重PCR反应，PCR缓冲液浓度为2.0×，引物浓度0.2uM；

4、按步骤4进行电泳和分析，电泳结果见图4。

注：泳道1～5分别为模板DNA浓度400，200，100，50，25ng/uL；泳道6为阴性对照。

结论：由图片4得出三重PCR可以检测到的最低模板浓度为1ng/uL。

实施例3：利用多重PCR技术检测不同转基因成分含量

1、按照实施例1方法所述合成引物和分别提取转基因含量为1.0％和0.1％的转基因水稻II优科丰6号及其受体II优明86的DNA，测定DNA浓度并用TE缓冲液将所提样品DNA稀释为200ng/uL。

2、按实施例1步骤3.1进行3重PCR反应，PCR缓冲液浓度为2.0×，引物浓度0.2uM，模板DNA分别加入2.0uL和5.0uL；

3、按步骤4进行电泳和分析，结果见图5。注：泳道12为转基因水稻含量1.0％的样品，模板加入量2.0uL；泳道13为转基因水稻含量为0.1％的样品，模板加入量2.0uL；泳道14为转基因水稻含量1.0％的样品，模板加入量5.0uL；泳道15为转基因水稻含量为0.1％的样品，模板加入量5.0uL。

结论：由图5得出三重PCR能够检测到转基因水稻含量为0.1％的混合样品。

实施例4：利用多重PCR技术检测不同的抗虫转基因水稻

1、按照实施例1方法所述合成引物和分别提取转基因水稻华恢1号及其受体明恢63，转基因水稻东龙及其受体籼优10号，测定DNA浓度并用TE缓冲液将所提样品DNA稀释为200ng/uL。

2、按实施例1步骤3.1进行3重PCR反应，PCR缓冲液浓度为2.0×，引物浓度0.2uM；

3、按步骤4进行电泳和分析，结果见图6。

图6，泳道1为转基因水稻华恢1号；泳道2为明恢63；泳道3为转基因水稻东龙；泳道4为籼优10号；泳道5为提取空白对照；M为100bp DNALadder。

结论：由图6得出三重PCR能够检测不同的抗虫转基因水稻华恢1号(含终止子Nos和目的基因CrylAc和CrylAb融合基因)和东龙(含启动子Camv35s，终止子Nos，目的基因CrylAb)。

序列表_ST25

SEQUENCE LISTING

<110>中国水稻研究所

<120>一种抗虫转基因水稻多重PCR检测试剂盒及检测方法

<130>

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>1

gctcctacaa atgccatca          19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

gatagtggga ttgtgcgtca         20

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

catgacgtta tttatgagat ggg     23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>4

gacaccgcgc gcgataattt atcc    24

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>5

gaaggtttga gcaatctcta c       21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>6

cgatcagcct agtaaggtcg t        21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>7

aaaatgaaga gcaccatctt c        21

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>8

tctagagttc atctttctca tcatc    25

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>9

taggagggcg tggatatgtc          20

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<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>10

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