具有增加的赖氨酸的转基因植物种子

摘要

本文中公开了具有新的外源DNA构建体的转基因植物，其中所述的外源DNA构建体表达二氢吡啶二羧酸合酶和赖氨酸酮戊二酸还原酶的基因抑制分子，其活性导致植物种子中增加的赖氨酸。

说明书

优先权声明

本申请要求在本文中通过援引而完整引用的2005年10月3日提交 的美国临时申请系列号60/723,178的优先权。

发明背景

1.发明领域

本文中公开了用于产生具有以下部分的转基因植物的DNA构建 体，其中所述的部分具有增加的赖氨酸含量，和使用此类DNA构建体 以产生转基因植物及种子的方法，来自所述植物的收获材料和从此类收 获材料制备的粗粉和食物产品。此类DNA构建体用于产生具有因种子 中赖氨酸积累增加而得到的改良营养益处的转基因植物。还公开用于 产生在其种子中具有增加的赖氨酸含量的转基因植物的多核苷酸分子 和方法。

2.相关技术的描述

通常称作玉蜀黍(maize)或玉米(corn)的Zea mays是广泛用作动物饲 料和人食物的一种谷物。谷粒，在本文中称作种仁或种子，是众多低等 动物(包括猪、肉牛和奶牛、鱼和家禽)的蛋白质、淀粉和油的来源。在 一些国家如墨西哥，超过70％的收获玉米用于人消费，并且玉米及玉米 衍生产品如hominy和tortillas是主食(dietary staples)。在种仁中，大部 分的氨基酸组成由多肽内所含氨基酸的量和类型决定。种仁中仅有相对 小部分(至多到10％)的可获得的氨基酸作为游离氨基酸汇集物存在；其 余部分在多种蛋白质中包含。在玉米，种仁内找到的大部分多肽是种子 贮藏蛋白或玉米醇溶蛋白(zeins)。这些种子贮藏蛋白在种仁发育时合 成并在种仁萌发和开始生长时作为能量源使用。然而，种子贮藏蛋白含 有少量赖氨酸，乃至不含赖氨酸。在混合谷物饲料内认定的十种必需氨 基酸(精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸或半胱氨 酸、苯丙氨酸或酪氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)中，玉米尤其缺乏赖 氨酸和苏氨酸及甲硫氨酸。这些必需氨基酸的缺乏，尤其赖氨酸的缺乏， 需要饲用玉米应当以这些营养物补充，这经常通过添加大豆粗粉或合成 赖氨酸提供。有益于现有技术的是增加玉米种子中赖氨酸水平从而使种 子作为食物或饲用谷物更有营养。若谷粒需要很少或不需要用额外赖氨 酸补充，则实现额外的益处。

在人营养中，穷人倾向于消费这样的饮食，其中廉价淀粉食物的量 相对高而高品质蛋白质的量相对低。恶性营养不良病是在中等至优异的 能量(总热量)摄入存在下因摄入品质不够好的蛋白质所致的营养不良形 式。早期症状是很一般性的，并且包括疲劳、易怒和嗜睡。随着蛋白质 缺乏继续，出现生长不足、肌肉质量损失、广泛肿胀(浮肿)和免疫力下 降。常见大而突起的腹部。皮肤病(如皮炎、色素沉着改变、头发稀薄和 白癜风)频繁见到。晕厥和昏迷进展至死亡。一份政府评估表明在美国疗 养所中的50％老人患有蛋白质-热量营养不良。因此，因更高赖氨酸水 平而具有改良蛋白质品质的玉米产品不仅将明显改善饮食的营养质量， 也明显改善整体一般健康水平。

增加赖氨酸水平的植物分子生物学方法涉及鉴定并向玉米导入基 因以影响种仁中的赖氨酸水平，而未不利地影响农艺特性。赖氨酸衍生 自天冬氨酸，其代谢与涉及苏氨酸、甲硫氨酸和异亮氨酸的途径交汇。 赖氨酸本身作为终产物起到修饰和调节赖氨酸自身产生途径中酶的作 用。赖氨酸代谢中所涉及的关键酶是天冬氨酸激酶(AK)和二氢吡啶二羧 酸合酶(DHDPS)，而赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR，又称作酵母氨酸脱 氢酶SDH的双功能酶)似乎在赖氨酸异化中发挥重要作用。AK和 DHDPS受赖氨酸反馈调节；当赖氨酸水平增加时，该氨基酸下调这些 酶的活性。

因此，为了增加赖氨酸水平，有益的是拥有AK或DHDPS的反馈 不敏感性形式。已经描述细菌AK基因的赖氨酸不敏感性变体以及来自 植物的几种变体(见Falco等，美国专利号5,773,691，在本文中通过援引 并入)。已经从大麦(barley)、玉米和烟草(tobacco)中鉴定几种AK的赖氨 酸不敏感性形式。从大肠杆菌(E.coli)中分离的细菌DHDPS基因已经证 实对赖氨酸水平增加的敏感性降低为至少20分之一(Glassman等，美国 专利号5,258,300；Galili等，美国专利号5,367,110)。

Falco等(美国专利号5,773,691和6,459,019、美国专利申请公开号 U.S.2003/0056242)和Dizigan等(美国专利申请公开号2005/0132437)描 述了分离并使用来自大肠杆菌的赖氨酸反馈不敏感性天冬氨酸激酶 (AK，基因称作lysC)、来自大肠杆菌的DHDPS和来自棒状杆菌 (Corynebacterium)的DHDPS(本文中称作CORgl.dapA)以产生在种子中 具有增加的赖氨酸水平的转基因油菜(rapeseed)、烟草、玉米和大豆植物， 其中所述每一文献均完整地通过援引并入。

本发明提供这样的DNA构建体，其在植物细胞中表达时提供植物 种子中增加的植物产物营养成分，尤其增加的赖氨酸。

发明简述

本文中提供DNA构建体，当其在转基因植的物基因组内生效时赋 予植物种子中增加的赖氨酸水平。收获的高赖氨酸种子用于产生食物和 饲料产品，如需要少量或不需要赖氨酸补充的玉米粉(也称作″masa harina″)、玉米粗粉和粗粉产品。优选地，转基因植物及种子是作物植物 及种子，优选地是单子叶植物及种子并且最优选地是玉米植物及种子。

本发明提供包含DNA构建体并具有种子中增加的赖氨酸水平的转 基因植物及种子。本发明的DNA构建体包含在玉米细胞中表达时抑制 赖氨酸降解多肽产生的分子和在玉米细胞中表达时提供赖氨酸不敏感 性二氢吡啶二羧酸合酶多肽或赖氨酸不敏感性天冬氨酸激酶产生的分 子。

收获的谷物，即便在无活性并且因此不用作种子时，仍提供由本发 明实现的较高赖氨酸水平和较高蛋白质品质。此类收获的谷物能够以常 规谷物那样的相同方式加工。因此，在另一个实施方案中，本发明提供 通过培育本发明的转基因植物并收获含有高赖氨酸的种子，或通过加工 本发明的种子或其部分而制备的高赖氨酸动物饲料产品。在又一个实施 方案，本发明提供通过培育本发明的转基因植物并收获含有高赖氨酸的 种子，或通过加工本发明的种子或其部分而制备的粗粉或粗粉产品。

在本发明的一个实施方案，DNA构建体包含针对在植物细胞、尤 其玉米细胞中表达而增强的新颖多核苷酸组合物。一种新颖多核苷酸 (SEQ ID NO：5)编码二氢吡啶二羧酸合酶多肽并且另一种新多核苷酸 (SEQ ID NO：9)与赖氨酸酮戊二酸还原酶的多核苷酸编码序列的一部分 同源及互补。在植物细胞、尤其是玉米植物细胞并且优选在玉米种子细 胞中表达时，该DNA构建体引起玉米种子中赖氨酸增加。该DNA构建 体包含多核苷酸例如编码赖氨酸不敏感性二氢吡啶二羧酸合酶的序列 如SEQ ID NO：1，和编码赖氨酸酮戊二酸还原酶的序列如SEQ ID NO：2， 其中所述序列用作模板以设计抑制性RNA，或编码天冬氨酸激酶的序列 如SEQ ID NO：3。DNA构建体优选地包含得到增强以指导玉米种子中可 操作连接的多核苷酸转录的启动子分子。此外，新DNA分子(SEQ ID NO：10)包含具有赖氨酸酮戊二酸还原酶基因靶的基因抑制分子，其中基 因抑制分子镶嵌在DNA构建体的内含子内。

在另一种实施方案，本发明提供通过使近交亲代杂交以提供杂交种 子而产生高赖氨酸玉米种子的方法，其中每种亲代在其基因组中含有本 发明DNA构建体的一种或多种植物表达盒并且该表达盒在每种亲代中 彼此相异并且两个亲代均不含有全部三种植物表达盒，并且收获了比两 种亲代中的任一亲代具有更高赖氨酸含量的种子。

在另一种实施方案，本发明提供产生高赖氨酸性人食物或动物饲料 产品的方法，包括步骤：加工来自具有如此基因组的转基因植物的种子 或其部分，其中所述的基因组包含外源性DNA构建体或本发明构建体 集合。另外，本发明提供产生高赖氨酸性人食物或动物饲料产品的方法， 包括培育转基因植物以产生种子和收获种子的步骤，其中所述种子具有 包含本发明的外源性DNA构建体的基因组。

附图简述

图1.显示pMON66649的质粒图

图2.显示pMON80003的质粒图

图3.显示pMON79465的质粒图

图4.显示pMON93092的质粒图

图5.显示pMON93093的质粒图

图6.显示pMON80378的质粒图

图7.来自包含pMON93092的事件中R2种仁的游离赖氨酸含量

图8.来自包含pMON93093的事件中R2种仁的游离赖氨酸含量

发明详述

显示期望性状(例如本发明增加的赖氨酸)的转基因植物或种子包含 插入该转基因植物基因组的给予所述期望性状的特定外源性DNA。性状 表现为在对照植物(例如，缺乏这种特定外源性DNA的基因型基本上相 同的植物或种子)中相对于天然存在性状的可测量变化。优选地，变化通 过比较具有同期望性状相关的特定外源性DNA的转基因植物或种子中 该性状的表现与对照植物或种子中相同性状的表现而测量。″高赖氨酸 玉蜀黍″因此是在任何植物部分、优选在种子中具有增加的赖氨酸的玉 米(玉蜀黍)植物，其中所述的种子也可以在本文中称作种仁或作为集合 物称为谷粒。本发明提供在其基因组中含有本发明DNA构建体的至少 一种植物表达盒的DNA构建体和种子，其中所述的种子比不含该构建 体的种子具有更高赖氨酸含量。

增加的赖氨酸可以由植物通过在种仁中增加量的氨基酸积累而表 现，并且可以通过任何合适方法如对已适度提取组织的质谱法(mass spectrophotometry)或高效液相色谱而测量。具有增加的赖氨酸的本发明 转基因玉米种仁尤其可用作饲料或食物产品、粗粉或粗粉产品、纯化的 玉米蛋白质产品的来源或从种仁中加工出来的其它产品的来源，其中所 述的种仁比相似品种的非转基因种仁具有更高的赖氨酸含量。

含有总赖氨酸水平大约4000份每百万份(ppm)的玉米谷粒具有充 足量的赖氨酸以至于从这种谷粒中产生的家畜饲料或食物产品不需要 来自其它氨基酸源的补充。本发明的高赖氨酸玉米实现了玉米种仁中这 种水平的赖氨酸产生和积累。本发明是胜过先前所述用于增加玉米种仁 中赖氨酸的方法和组合物(例如，美国专利号5,773,691)的巨大改进。

增加转基因植物中氨基酸水平的努力包括表达这样的重组DNA分 子，其编码比天然基因更高水平的氨基酸合成途径中的蛋白质。用于在 玉米中产生提高的赖氨酸水平的一种方法是通过表达如美国专利 5,288,300、6,459,019和美国专利公开2003/0056242 A1中公开的细菌二 氢吡啶二羧酸合酶(DHDPS)并抑制内源性LKR(美国专利公开 2005/0193444)，其中所述每份文献均在本文中完整地通过援引并入。

本发明的任何植物或其部分可以得到加工以产生饲料、粉、粗粉， 蛋白质或油制品。特别优选用于这个目的的植物部分是种子。在一个优 选的实施方案中，饲料、粉、粗粉、蛋白质或油制品设计用于饲养农畜 (家畜)。产生饲料、粉、粗粉、蛋白质和油制品的方法是现有技术例如 美国专利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669 和6,156,227中已知的，其中所述文献在本文中完整地通过援引并入。 在优选的实施方案中，蛋白质制品是高含量蛋白质制品，如浓缩物或分 离物。高含量蛋白质制品优选地具有大于5％w/v的蛋白质含量、更优 选地是10％w/v并且甚至更优选地是15％w/v。

在又一个实施方案中，本发明的粗粉可以与其它粗粉混合。在优选 的实施方案中，从本发明的植物或种子中产生或通过本发明方法生成的 粗粉构成任何产品中大于约0.5％、约1％、约5％、约10％、约25％、 约50％、约75％或约90％体积或重量的粗粉成分。在另一种实施方案， 粗粉制品可以加以混合并且可以构成混合物大于约10％、约25％、约 35％、约50％或约75％的体积。本发明还提供增强人或低等动物生长的 方法，包括供给人或低等动物这样的饮食，其中该饮食的至少一部分是 包含本发明的一种或多种植物表达盒的高赖氨酸玉米。如本文中所用， 术语″低等动物″意图包括饲养鸟和鱼以及哺乳动物。

重组DNA构建体

本发明提供DNA构建体，其包含有效在玉米种仁中赋予增加的赖 氨酸的可操作连接的多核苷酸。术语″DNA构建体″包括，但不限于指导 植物细胞中已连接的多核苷酸分子转录的多核苷酸分子。在转化植物细 胞的方法中使用本发明DNA构建体的至少一部分，即稳定插入细胞基 因组的部分。该部分提供玉米种仁或从这些种仁中产生的粗粉中的高赖 氨酸表型，并且是本发明的一方面。Monsanto Technology LLC的DNA 构建体pMON93092和pMON09093的保藏物已经根据布达佩斯条约在 美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏，登录号分别是PTA-6733和 PTA-6734。这些保藏物形成本发明公开内容的一部分，并且尽管相信在 本发明中以书面内容提供的序列是精确的，包含调节元件、编码分子和 非编码分子的DNA分子的多核苷酸序列可以根据需要从保藏物中测定 并且用于校正本文中所公开的那些序列。

重组DNA构建体中的多核苷酸分子使用本领域普通技术人员已知 的方法连接。用于构建DNA构建体的有用技术实例是GATEWAY^TM克 隆技术(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，California)，其中所述的克 隆技术使用来自噬菌体λ的整合酶/att系统的位点特异性重组酶LR克隆 反应用于载体构建替代限制性内切核酸酶和连接酶。由Invitrogen提供 的GATEWAY^TM克隆技术说明手册也提供简洁描述以常规地克隆任何 期望的多核苷酸至包含可操作(operable)植物表达元件的载体中。其它方 法在Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版第1、2和3卷.J.F. Sambrook、D.W.Russell和N.Irwin，Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2000(本文中称作Sambrook等)中公开。

如本文中所用″外源性DNA或分离的DNA″指通常不存在于宿主细 胞基因组中的DNA分子，或通常不存在于宿主基因组中相同环境下的 DNA，或在正常或天然情况下彼此不接近的任何彼此靠近的两个序列。 外源性DNA可以包括对宿主基因组为天然的DNA或RNA多核苷酸分 子或可以包含因添加或缺失一个或多个多核苷酸或对相关的多核苷酸 调节元件或如本文中讨论的其它多核苷酸序列的修饰而改变的天然多 核苷酸。除了调节元件外，外源性DNA可以含有编码蛋白质或多肽的 编码序列或产生非蛋白质产物(如影响另一种DNA序列的转录或翻译的 RNA分子)的非编码序列。本发明DNA构建体包含编码序列和非编码序 列。

用于转化植物细胞的外源性DNA构建体将包含感兴趣编码序列和 通常包含如本文中讨论的其它调节元件，例如但不限于启动子、内含子、 5′和3′非翻译区、前导序列、定位和运输序列和增强子、本文中称作异 源植物表达盒的在植物细胞中表达RNA的这些调节元件的可操作连接。 在表1中所列的DNA构建体显示出调节元件在表达编码序列和非编码 序列的表达盒中的连接，以及在包含每种构建体的转基因玉蜀黍种子中 所测量的平均赖氨酸水平。本发明外源性DNA构建体的启动子DNA分 子由种子增强性或种子特异性启动子示例，包括例如用于单子叶作物植 物中的那些启动子，如玉蜀黍L3启动子(在本文中通过援引并入的美国 专利6,433,252或其同源物，并且在本发明中称作P-Zm.L3)、玉蜀黍B32 启动子(SEQ ID NO：4或其同源物，本文中称作P-Zm.B32)、玉蜀黍γ薏 苡醇溶蛋白启动子(maize gamma coixin promoter本文中通过援引并入的 美国专利6,635,806或其同源物，本文中称作P-Zm.Gcx)，或者将用于本 发明DNA构建体中的任一启动子或提供玉米种子中增强转录的其它已 知启动子在本文中称作P-Zm.种子。在种子中有功能的其它启动子的实 例包括但不限于驱动种子贮藏蛋白(如稻的麦谷蛋白和麦(Triticeae)物种 的谷醇溶蛋白)表达的启动子，以及控制参与种子中淀粉合成的酶的表达 的启动子，如驱动单子叶植物ADP葡萄糖淀粉糖基转移酶表达的启动 子。所选择的种子启动子与DHDPS编码区(例如，SEQ ID NO：1，本文中 称作CORgl.dapA)或天冬氨酸激酶编码区(例如，SEQ ID NO：3)可操作连 接。其它的种子增强性和种子特异性启动子是现有技术中已知的并且可 以通过本发明中所述的方法或植物分子生物学领域技术人员已知的相 似方法在与本发明的DNA编码分子和非编码分子可操作连接的情况下 选择并试验。种子增强性启动子主要在种子的全部或部分中表达，不过 该启动子可以次要地在植物的其它植物细胞、组织或器官中表达。种子 的部分包括但不限于胚、胚乳、种衣、胚芽鞘、子叶、下胚轴、粉糊层、 果皮或小盾片。在DNA构建体中提供的其它调节区可以包括，但不限 于内含子(I-)、运输信号(TS-)、5′非翻译前导序列(L-)、3′多腺苷酸化区(T-) 或非编码反义区。也可以包括选择性或可计分的标记表达盒以辅助选择 或鉴定已转化的植物细胞和组织。本发明的构建体任选地含有向玉米植 物提供草甘膦耐受性并且可以用作选择标记的表达盒。如本文中所用， ″转基因″意指并入宿主基因组中或能够在宿主细胞中自主复制并能够引 起一种或多种细胞产物表达的外源性DNA。示例性转基因将为宿主细 胞、从宿主细胞中再生的植物或这些植物的部分提供相对于对应的非转 化细胞或植物的新表型，例如玉米种仁中增加的赖氨酸。转基因可以通 过遗传转化直接导入植物，并且优选地是稳定及可遗传的以至于它们可 以从用该外源性DNA转化的任何先前世代的植物中继承。

如本文中所用，″基因″或″编码序列″意指从其中转录RNA分子的 DNA分子。DNA分子为编码蛋白质产物的mRNA或为发挥基因抑制分 子作用的RNA或结构性RNA分子如tRNA、rRNA、snRNA或其它RNA 提供编码区(CR-)。如本文中所用，″表达″指胞内过程的组合，包括转录 和翻译，其中DNA分子如基因通过所述过程产生多肽或RNA分子。 示例性编码序列是用于产生具有增加的赖氨酸的玉米种仁的棒状杆菌 (Corynebacterium)二氢吡啶二羧酸合酶基因(DHDPS；Bonnassie等，1990； Richaud等，1986)。受到转化以含有并表达棒状杆菌DHDPS基因或含 有并表达导致种仁组织中赖氨酸增加的任何其它基因的玉米植物也称 作高赖氨酸玉米植物。本发明的棒状杆菌DHDPS编码区额外地受到修 饰以便在植物细胞、优选在单子叶植物细胞并且最优选在玉米细胞中提 供增强的表达。用于本发明中的修饰棒状杆菌DHDPS编码区公开为 SEQ ID NO：5，本文中称作CORgl.dapA.nno。

如本文中所用，″启动子″意指启动RNA从DNA中转录的DNA序 列区域。启动子位于待转录DNA的上游，具有起到RNA聚合酶结合位 点作用的区域(canonical regions)，并且具有与其它因子一起工作以促 进RNA转录的区域。更具体地，植物中的基础启动子包含与转录启动 相关的正则区域，如CAAT盒和TATA盒。在本发明中，优选的启动子 分子和5′UTR分子允许在种子细胞或组织中的转录处在比植物其它细 胞和组织中更高的速率或水平上。启动子分子可以从本领域已知的启动 子中选择，例如所述启动子在美国专利6,437,217(玉蜀黍RS81启动子)、 美国专利5,641,876(稻肌动蛋白启动子)、美国专利6,426,446(玉蜀黍 RS324启动子)、美国专利6,429,362(玉蜀黍PR-1启动子)、美国专利 6,232,526(玉蜀黍A3启动子)、美国专利6,177,611(组成型玉蜀黍启动 子)、美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,196(35S启动子)、 美国专利6,433,252(玉蜀黍L3油质蛋白启动子，P-Zm.L3)、美国专利 6,429,357(稻肌动蛋白2启动子以及稻肌动蛋白2内含子)、美国专利 5,837,848(根特异性启动子)、美国专利6,294,714(光诱导型启动子)、美 国专利6,140,078(盐诱导型启动子)、美国专利6,252,138(病原体诱导型 启动子)、美国专利6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)、美国专利 6,635,806(γ-薏苡醇溶蛋白启动子，PCl.Gcx)和美国专利申请系列号 09/757,089(玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子)中描述，全部文献均通过援引并 入。此外，可以构建这样的嵌合启动子分子，其具有进一步增强用于本 发明中的启动子表达情况的衍生自异质来源的顺式元件。例如，已经证 实植物病毒启动子元件在可操作连接时对植物启动子元件提供增强(美 国专利6,660,911，在本文中完整地通过援引并入)。

用在转化植物中的DNA构建体典型地除了启动子之外还包含其他 调节元件，例如，但不限于3′非翻译区(含有聚腺苷酸化位点)，用于将蛋 白质靶向至植物细胞的细胞器、尤其叶绿体、白色体或其它质体细胞器 中的运输或信号肽。

本领域技术人员会知道在设计有效植物表达载体中有用的多种内 含子、增强子、运输肽、靶向信号序列、5′和3′非翻译区(UTRs)，如在 例如美国专利公开2003/01403641(在本文中通过援引并入)中公开的那 些。

作为翻译前导序列发挥作用的5′UTR是位于基因启动子序列与编 码序列之间的DNA遗传元件。翻译前导序列在充分加工的mRNA中的 翻译起始序列上游存在。翻译前导序列可以影响初级转录物至mRNA的 加工，或它可以影响mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例包 括玉蜀黍和矮牵牛(petunia)热休克蛋白前导序列(美国专利号 5,362,865)、植物病毒衣壳蛋白前导序列、植物Rubisco前导序列，不一 而足(Turner和Foster，1995)。在天然环境下与本发明中所述启动子分子 连接的前导分子包括例如玉蜀黍B32前导序列(L-Zm.B32)、稻肌动蛋白 1前导序列(L-Os.Act1)、γ薏苡醇溶蛋白前导序列(L-Cl.Gcx)。

3′非翻译区(3′UTR)或3′多腺苷酸化区意指与结构性多核苷酸分子连 接并位于该结构性多核苷酸分子下游的DNA分子，并且包括提供聚腺 苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的其它调节信号的 多核苷酸。聚腺苷酸化信号在植物中发挥作用以引起聚腺苷酸核苷酸添 加至mRNA前体的3′末端。聚腺苷酸化序列可以从天然基因、从多种植 物基因或从农杆菌T-DNA基因中衍生。3′UTR区的实例是胭脂碱合酶 3′区(nos 3′；Fraley等、1983)、小麦hsp17(T-Ta.Hsp17)和T-Ps.RbcS2： E9(豌豆rubisco小亚基)，在WO0011200A2中公开的那些3′UTR和现 有技术中已知的其它3′UTR可以进行测试并与DHDPS或AK编码区组 合地使用，本文中称作T-3’UTR。

运输信号通常指与目的蛋白连接时指导该蛋白质至特定组织、细 胞、亚细胞位置或细胞器内的肽分子。实例包括，但不限于叶绿体运输 肽、核靶向信号和液泡信号。质体运输肽在本发明中特别用于指导 DHDPS酶在种子的质体中的表达。叶绿体运输肽(CTP)可以加以工程化 以与待引导至植物叶绿体内的蛋白质的氨基末端融合。众多位于叶绿体 的蛋白质从核基因中表达作为前体并且通过CTP导向叶绿体，其中所述 的CTP在输出步骤期间被除去。叶绿体蛋白质的实例包括核酮糖-1，5-二 磷酸羧化酶小亚基(RbcS2)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光 复合体蛋白质I和蛋白质II和硫氧还蛋白F。已经在体内和体外证实非 叶绿体蛋白质可以通过使用与CTP形成的蛋白质融合物而导向叶绿体 并且CTP足以将蛋白质导向叶绿体。合适的叶绿体运输肽如拟南芥 (Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(Klee等，1987)和矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，1986)的引入已经证实在转基因植 物中将异源蛋白质导向叶绿体。本发明的玉米DapA CTP(SEQ ID NO：6， 本文中称作TS-Zm.DapA)具有提供指导连接的DHDPS多肽至种子质体 中的用途。本领域技术人员将认识到可以产生多种嵌合构建体，其利用 特定CTP的功能以输出异源DHDPS多肽至植物细胞质体内。对于叶绿 体运输肽的用途描述，见通过援引并入的美国专利5,188,642。

表1显示与LKR基因抑制分子及DHDPS编码分子可操作连接的启 动子和其它调节元件的组合以及它们对玉米植物和种仁中赖氨酸水平 所产生的作用。本领域技术人员将知道具有相似功能的外源性DNA分 子可以用表1中所示的那些外源性DNA分子进行替换并在本文中所述 的方法或在用于评价植物组织、种仁或加工产品内赖氨酸水平的相关方 法中测试。

本发明的DNA构建体可以任选地含有选择性或可计分的标记分 子。特别重要的是还提供有价值的农艺性状例如除草剂耐受性的选择标 记分子。已对其证实转基因植物耐受性并且可以适用本发明方法的除草 剂包括，但不限于：草甘膦、草胺磷、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈、 茅草枯、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和异噁唑草酮(isoxaflutole) 除草剂。编码参与除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是现有技术中 已知的，并且包括但不限于编码用于草甘膦耐受性的5-烯醇式丙酮酰莽 草酸3-磷酸合酶(EPSPS，在美国专利号5,627,061；5,633,435；6,040,497； Padgette等，1996；和Penaloza-Vazquez等，1995中描述)和aroA(美国 专利号5,094,945)；用于溴苯腈耐受性的溴苯腈腈水解酶(Bxn)(美国专利 号4,810,648)；八氢番茄红素去饱和酶(crtI，Misawa等，1993和1994)； 用于氟草敏耐受性的乙酰羟酸合酶(AHAS，akaALS，Sathasiivan等，1990) 和用于草胺磷和双丙氨磷耐受性的bar基因(DeBlock等，1987)的多核苷 酸分子。

除草剂耐受性是作物植物所期望的表型。本发明的DNA构建体优 选地含有在转化的玉米植物中提供草甘膦耐受性的表达盒。此外，表达 盒允许在含有草甘膦的培养基上选择转化的玉米细胞。表达盒优选地含 有指导基因转录的启动子，其中所述的基因在转化植物的全部细胞中编 码草甘膦抵抗的(enzyme resistance)EPSPS。尤其，本发明的草甘膦耐 受表达盒包含与编码叶绿体运输肽的多核苷酸和编码草甘膦抵抗性 EPSPS的多核苷酸可操作连接的稻肌动蛋白1启动子和内含子 (P-Os.Act1，IOs.Act1，美国专利5,641,876，在本文中通过援引并入)，其 中所述的草甘膦抵抗性EPSPS从农杆菌菌株CP4中分离(本文中称作 aroA：CP4 EPSPS，美国专利5,633,435，在本文中通过援引并入)。N-膦酰 基甲基甘氨酸，也称作草甘膦，是对广泛类型植物物种有活性的众所周 知的除草剂。草甘膦是在环境中具有理想短半衰期的一种安全除草剂 除草剂(Monsanto Co.，St.Louis，MO)的活性成分。当施加至植 物表面时，草甘膦分布至植物全身。草甘膦因阻断提供芳族氨基酸合成 前体的莽草酸途径而对植物有毒。具体而言，草甘膦通过抑制5-烯醇式 丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶(下文称作EPSP合酶或EPSPS)而影响磷酸烯 醇丙酮酸与3-磷代莽草酸(3-phosphoshikimic acid)转化成5-烯醇式丙酮 酰莽草酸3-磷酸。为本发明目的，术语″草甘膦″应当认为包括N-膦酰基 甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何有除草剂有效形式和导致在植物中 产生草甘膦阴离子的其它形式。草甘膦如N-膦酰基甲基甘氨酸及其盐用 作合成培养基的成分以选择细菌和植物对草甘膦的耐受性或用来在体 外生物化学分析中确定酶抵抗性(enzyme resistance)。草甘膦商业制剂 的实例包括而不限于由孟山都公司在除草剂商标ULTRA、ULTRAMAX、CT、 EXTRA、BIACTIVE、BIOFORCE、和除草剂下 出售的那些商业制剂，这些商业制剂均含有作为其异丙基铵盐的草甘 膦；由孟山都公司作为DRY和除草剂出售的那些 商业制剂，含有作为铵盐的草甘膦；由孟山都公司作为GEOFORCE出售的商业制剂，含有作为钠盐的草甘膦；由孟山都公司 作为WEATHERMAX出售的商业制剂，含有作为钾盐的草 甘膦；由Zeneca Limited作为除草剂出售的商业制剂， 含有作为三甲基锍盐(trimethylsulfonium)的草甘膦。草甘膦除草剂制 剂可以安全地以低至8盎司/英亩并至多到64盎司/英亩的比率在草甘膦 耐受作物的顶部施用以控制田间杂草。实验中，草甘膦已经以低至4盎 司/英亩并至多到或超过128盎司/英亩的比率施用于草甘膦耐受作物， 而不明显损害作物植物。选择形成生物有效剂量的草甘膦制剂施用比率 处在普通农业技术人员的技术能力范围内。为说明产生具有除草剂抗性 的转基因植物是本领域普通技术人员的能力，参考美国专利申请公开 2003/0106096A1和2002/0112260A1和美国专利5,034,322；6,107,549和 6,376,754，全部文献均通过援引并入。本发明提供具有增加的赖氨酸的 玉米植物并且任选地是草甘膦耐受的。

在转化期间，外源性DNA可以随机地即在非特异性位置上导入植 物基因组中。在一些情况下，例如为了替换基因组中现存的基因序列或 区域，定向插入外源性DNA以便实现位点特异性整合可能是有用的。 在另一些情况下，在预定的位点处使外源性DNA定向整合至基因组可 能是有用的，其中已知在所述的位点存在基因表达。存在已知在植物中 有功能的几个位点特异性重组系统，包括如美国专利4,959,317中公开 的Cre/lox和如美国专利5,527,695中公开的FLP/FRT，这两份文献均通 过援引并入。

有用的选择标记基因包括赋予对抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素 (nptII)、潮霉素B(aphIV)和庆大霉素(aac3和aacC4)抗性的那些选择标记 基因，或如美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中所 述的选择标记基因，全部文献在本文中通过援引并入。也可以使用提供 目视鉴定转化体的能力的可筛选标记，例如表达有色蛋白质或荧光蛋白 如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因或表达已知有多种生色底物的 β-葡糖醛酸酶或uidA基因(GUS)的基因。

基因抑制

本发明的DNA构建体提供对转基因植物细胞中内源性LKR基因 (赖氨酸-酮戊二酸还原酶(LKR，植物中的一种双功能酶，也称作酵母氨 酸脱氢酶(saccharopine dehydrogenase)，SDH)特异的反义RNA基因抑 制分子的表达。这种DNA构建体包含在作为酶抑制靶标的组织中有活 性的启动子和具有如此序列的可转录DNA元件，其中所述的序列与作 为抑制靶标的LKR基因的多核苷酸序列互补。为用于基因抑制构建体 中的可转录DNA而拷贝的靶定基因元件可以是启动子元件、内含子元 件、外显子元件、5′UTR元件或3′UTR元件。虽然从作为抑制靶标的基 因的序列中拷贝的DNA最小尺度据信是约21或23个核苷酸；优选更 大的核苷酸节段，例如至多到靶向基因的全长。DNA元件可以包含基因 的多个部分，例如与连续或间断的基因元件UTR、外显子和内含子互补 的核苷酸。此类构建体也可以根据需要包含其它调节元件、编码运输肽、 信号肽、选择标记和可筛选标记的DNA。为形成反义方向的RNA环， 互补DNA元件方便地不超过反义方向DNA元件的约一半长度，常常不 超过所述反义方向DNA元件的三分之一长度，例如不超过所述反义方 向DNA元件的四分之一长度。合并的DNA元件的总长度可以变化。例 如反义方向的DNA元件可以由500-5000个核苷酸构成，并且互补性 DNA元件可以由50-500个核苷酸构成。

可以设计反义转录单位以抑制多个基因或基因家族成员，其中DNA 与来自作为抑制靶标的不同基因中的两个或多个反义方向元件排列在 一起，随后是互补性有义方向元件，例如与最5′端反义元件的至少一部 分互补。

基因抑制包括用于抑制基因转录或与该基因相对应的mRNA积累 因而阻止转录物翻译成蛋白质的众所周知的任何方法。转录后基因抑制 由已整合重组DNA的转录介导，以形成与作为抑制靶标的基因具有同 源性的双链RNA(dsRNA)。这种dsRNA的形成最常见因靶基因整合的倒 置重复的转录而产生，并且是称作反义抑制、共抑制和RNA干扰(RNAi) 的基因抑制方法的共同特征。转录性抑制可以由转录的dsRNA介导， 其中所述转录的dsRNA与实施所谓启动子反式抑制的启动子DNA序列 具有同源性。

更具体地，在美国专利5,107,065(Shewmaker等)和美国专利 5,759,829(Shewmaker等)中公开了通过插入具有反义方向DNA的重组 DNA构建体以便调节植物细胞中基因表达的转录后基因抑制。使用抑制 基因的这类反义方向DNA构建体所转化的转基因植物可以包含排列作 为倒置重复的整合DNA，其中所述的倒置重复因DNA构建体通过农杆 菌介导的转化而插入植物中产生，如由Redenbaugh等(1992)公开。倒置 重复插入物可以包含T-DNA构建体的部分或全部，例如，完整转录单 位的倒置重复或转录终止子序列的倒置重复。筛选包含倒置重复元件的 插入DNA可以改进鉴定有效发生基因沉默的转化事件的效率，鉴定转 化构建体是否为必须以多重拷贝进行插入的简单反义DNA构建体或是 可以作为单个拷贝进行插入的复杂倒置重复DNA构建体(例如RNAi构 建体)。本发明DNA构建体可以含有插入调节元件(例如内含子)中的倒 置重复序列。倒置重复序列包含与宿主植物细胞的内源性LKR基因同 源和互补的DNA分子。在本发明中，DNA分子(SEQ ID NO：9，dsSDH bfx， 也称作LKR dsRNA bfx)与编码玉米LKR/SDH(SEQ ID NO：2)的DNA的 部分同源，并且用来抑制玉米天然LKRISDH基因的表达。注释Bfx指 用于基因抑制的通过分析靶分子并排除在某些其它生物中找到的相关 靶序列而特异性选择的dsRNA分子序列。在本文中所述的一些构建体， LKR dsRNA bfx片段嵌入内含子中(I-Zm.DnaK嵌入Zm.LKR dsRNA bfx， SEQ ID NO：10)。可以选择与玉米LKR基因序列同源和互补的其它多核 苷酸以便用于本发明中。

因通过转座元件产生的插入突变而实现的抑制也可以阻止基因功 能。例如在众多双子叶植物中，可以便利地实现由农杆菌T-DNA所致 的转化并且可以迅速得到大量的转化植物。另外，一些物种如玉米存在 具有有效转座元件的品系，其中所述的有效转座元件可以高效地用于产 生大量的插入突变，而某些其它物种缺少这类选择余地。可以使用本发 明的多核苷酸鉴定由农杆菌或转座子诱变产生并且具有目的多肽的变 异表达的突变植物。例如，可以用编码目的多肽的多核苷酸筛选突变植 物的巨大群体以检测在编码目的多肽的基因中具有插入的突变植物。

蛋白质分子

本发明的蛋白质代表给予蛋白质重要(relevant)生物学活性(例如转 基因玉蜀黍种仁中增加的赖氨酸含量)的完整蛋白质或完整蛋白质的至 少足够部分。术语″蛋白质″也包括由一条或多条多肽链构成的分子。因 此，本发明中有用的蛋白质可以构成提供本发明农艺性状(即增加的赖 氨酸)的完整基因产物或天然蛋白质的一个或多个功能部分。

本发明蛋白质的同源物可以如此鉴定，即通过例如手工比较或通过 使用已知基于同源性的搜索算法如通常已知并称作BLAST、FASTA和 Smith-Waterman的那些算法，比较DHDPS(SEQ ID NO：7)或天冬氨酸激 酶(SEQ ID NO：8)蛋白质的氨基酸序列与来自相同或不同植物或细菌源 的蛋白质的氨基酸序列。

本发明的又一个方面提供编码功能性同源蛋白质的编码序列，其中 所述的编码序列与本文中提供的DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白质的编码 序列相差一个或多个氨基酸，这因一个或多个众所周知的保守性氨基酸 置换而产生，例如缬氨酸是亮氨酸的保守性置换物而苏氨酸是丝氨酸的 保守性置换物。当这种同源蛋白质在转基因植物中表达时，同源蛋白质 将以基本上如DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白质那样的相同方式影响转基 因植物。

对天然蛋白质序列中氨基酸的保守性置换可以从天然存在性氨基 酸所属的类别的另一个成员中选择。在这些多个类别中的代表性氨基酸 包括，但不限于：(1)酸性(带负电荷)氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；(2) 碱性(带正电荷)氨基酸如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸 如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺； 和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸如亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。对天然蛋白质序列中氨基酸的 保守性置换可以从天然存在性氨基酸所属的类别的另一个成员中选择。 例如、具有脂族侧链的氨基酸组是甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和 异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰 胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是氨酸、精氨酸 和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保 守性氨基酸置换基团是：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸酪 氨酸、赖氨酸-精氨酸、亮氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸和天冬酰胺谷 氨酰胺。

本发明的又一个方面包含这样的蛋白质，其与具有如所述DHDPS 或天冬氨酸激酶蛋白质序列的那些蛋白质相差一个或多个氨基酸，这因 天然序列中缺失或插入一个或多个氨基酸而产生。当这种同源蛋白质在 转基因植物中表达时，同源蛋白质将以基本上如DHDPS或天冬氨酸激 酶蛋白质那样的相同方式影响转基因植物，例如导致玉蜀黍种仁中增加 的赖氨酸含量。

作为本文中所提供蛋白质的变体的本发明蛋白质通常将显示与本 文中所提供蛋白质的显著同一性，如与DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白质 的至少50％或更高，例如至少60％或70％同一性。有用的蛋白质也包括 与DHDPS或天冬氨酸激酶蛋白质的蛋白质节段中的氨基酸具有更高同 一性百分数例如80％、90％、95％、98％或至多到99％同一性的那些蛋 白质。

转化方法和植物

如本文中所用，术语″玉蜀黍″意指玉米，也称作玉米，并且包括可 以与玉蜀黍配种的全部植物品种，包括野生玉蜀黍种。

在实施本发明中用于通过导入外源性DNA至植物基因组而使植物 转化的方法和组合物可以包括众所周知并证实的任何方法。植物转化的 优选方法是如美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208； 6,399,861和6,403,865中所示的微粒轰击法和如在美国专利5,635,055； 5,824,877；5,591,616；5,981,840和6,384,301和美国专利公开 20030196219中所示的农杆菌介导转化法，全部所述文献均通过援引并 入。微粒介导的转化指送递包被在微粒上的DNA，其中所述的微粒通过 几种方法推动至靶组织内。农杆菌介导的转化通过使用属于农杆菌属的 基因工程化土壤细菌而实现。几种农杆菌种介导称作″T-DNA″的特定 DNA质粒的转移，其中所述的DNA质粒可以加以遗传工程化以携带任 何所需的DNA片段至多种植物物种。

如本文中所用，″转基因″生物是其基因组包含外源性DNA或分离 的DNA的生物。转基因生物可以是植物、动物、昆虫、真菌、细菌或 病毒。如本文中所用″转基因植物″意指稳定转化的植物或源自其中的任 何后续世代的子代植物，其中植物或其子代的DNA含有外源性DNA。

转基因植物可以额外地含有对所转化的植物为天然的序列，但是其 中已经变更外源性DNA以改变基因表达的水平或模式。

如本文中所用，″稳定″转化的植物是其中外源性DNA可遗传的植 物。外源性DNA可以作为维持于植物细胞中并且不插入宿主基因组内 的DNA片段而可遗传。优选地，稳定转化的植物包含在细胞核、线粒 体或叶绿体的染色体DNA中插入、最优选在细胞核的染色体DNA插入 的外源性DNA。

如本文中所用″R0转基因植物″是已经用外源性DNA直接转化的或 已经从已用外源性DNA转化的细胞、愈伤组织或细胞团中再生出的植 物。如本文中所用，″子代″意指从特定的亲代植物或成组亲代植物中衍 生的任何后继世代，包括来自它们的种子和植物；得到的子代可以是高 度杂合的或是基本上纯合的，这取决于系谱。本发明转基因植物的子代 可以例如自我授粉、与另一种转基因植物杂交、与非转基因植物杂交和 /或与祖先回交。

本发明植物的种子可以从能育转基因植物中收获并且可以用来培 育本发明植物的子世代，包括在其基因组中含有如本发明表1中所列的 外源性DNA构建体的杂种植物系，这提供在玉蜀黍种仁中赖氨酸增加 的益处和任选地提供草甘膦除草剂耐受性。

转基因″事件″通过如此方式产生，即用外源性DNA构建体转化植 物细胞，再生由于外源性DNA特异性插入至植物基因组内而产生的植 物并且选择以事件DNA为特征的特定植物。每一事件因此是因本发明 外源性DNA构建体的特定基因组插入位置而可区别于其它事件的独特 个体。事件DNA的检测通过现有技术中已知的任何数目的DNA检测方 法进行，并且可以在含有DNA的事件的植物组织、种子和加工产品上 实施。一般，转化大量的植物细胞，每个植物细胞潜在地代表不同的整 合事件，产生从中选择出特定植物的植物群体。由于整合的位置通常经 历重复的植物再生循环是稳定的，因此术语″事件″指初始R₀转化体和转 化体的子代，其中所述的转化体包括插入基因组的特殊和独特位置内的 外源性DNA，即事件DNA。子代通过有性远交、自交或重复回交而产 生，其中在育种中所用的植物的至少一种是来自初始R₀转化体的在任 何世代上的后代，含有相同的事件DNA。

在加工本发明的种子和谷物以产生饲料和食物产物中，正常的植物 组织会被摧毁，植物细胞可以被破坏并且天然DNA及外源性植物表达 盒可能不是充分完整的，尤其当使用高温、提取溶剂等时。然而，因实 施本发明而能够得到的独特加工产品可以便利地因包含天然DNA的片 段和外源性植物表达盒的片段而得到鉴定。″片段″意指至少20碱基对长 度的可分离或可扩增DNA节。此类片段可以进行测序或限制性作图以 证实与原材料的天然DNA或外源性表达盒的序列同一性。

实施例

包括以下实施例以显示本发明优选实施方案的实例。本领域技术人 员应当理解以下实施例中所公开的技术代表本发明人已经发现在实施 本发明中起到良好作用的方法，并且因此可以视为构成本发明实施的优 选模式的实例。然而，本领域技术人员在考虑本公开内容的情况下应当 理解，众多变化可以在公开的具体实施方案中产生并仍然得到可能或相 似的结果而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1

DNA构建体和植物转化

本发明的DNA构建体包含与目的DNA可操作连接的调节分子。尤 其，DNA构建体包含启动子、内含子、5′前导序列、编码分子或非编码 分子和3′非翻译区。本发明的DNA构建体使用多种分子方法和工具(如 在Sambrook等中所述那些分子方法和工具)制备，并且可以实施DNA 操作领域的技术人员已知的这些方法的变体以产生基本上相似的构建 体。方法如PCR扩增、克隆和亚克隆方法用来以可操作构型可操作地连 接如表1中所列并在图1-6中所示的启动子、前导序列、内含子、运输 肽、编码分子、非编码分子和3′非翻译区。将DNA构建体克隆至适用 于农杆菌介导的玉蜀黍细胞转化中的一种或多种质粒主链中，尽管可以 选择其它质粒主链，例如，旨在分离DNA片段用于粒子枪介导转化的 高拷贝数质粒，或与其它细菌宿主兼容的质粒。产生表1中列出的35 种构建体来测试表达策略的组合以便表达赖氨酸反馈抗性的DHDPS多 肽(SEQ ID NO：7)和通过对玉蜀黍内源性LKR/SDH基因(SEQ ID NO：2) 的基因抑制或表达天冬氨酸激酶(SEQ ID NO：8)而阻遏赖氨酸异化。例 如，这些策略包括：1)在胚中表达LKR-dsRNA；2)在胚中表达DHDPS 多肽和LKR-dsRNA；3)在胚乳中表达DHDPS多肽和LKR-dsRNA；4) 在胚乳中表达DHDPS多肽并在胚中表达LKR-dsRNA；5)表达DHDPS 多肽和天冬氨酸激酶并且表达LKR-dsRNA。

转基因植物的制备

分离包含不成熟胚或愈伤组织的玉米组织(LH198或LH244近交系) 用于转化，并且本发明的DNA构建体使用农杆菌介导的转化方法(例如 美国专利5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840和6,384,301，全 部文献均通过援引并入)插入玉米基因组。在玉米组织上接种被转化以包 含表1中所列DNA构建体的农杆菌。在暴露于转化细菌后，使用补充 草甘膦除草剂的培养基，利用标准转化方案来增殖并选择转化的玉米细 胞。在选择暴露于草甘膦除草剂而存活的细胞后，再生R₀转基因植物 至成熟。种子从能育转基因植物中收集，此后自交或与第二种玉米植物 远交。实施分子分析以表征转基因的插入。使用PCR、Southern印迹、 测定或分子生物学领域技术人员已知的其它方法来鉴定包含 单个的完整DNA构建体插入的事件或接合性分析。将子代种子种植并 且培育子代植物用于组织和子代种子的赖氨酸分析。

实施例2

测定玉蜀黍组织和种子的赖氨酸含量

多种方法用于测定植物组织、种子和加工产品的赖氨酸含量，例如 在本发明中，使用液相色谱-质谱/质谱(LC-MS-MS)以分析用如表1内所 列DNA构建体转化时所鉴定的多个事件的玉米种仁中的游离赖氨酸(份 每百万份，ppm)，并且这种分析的结果在表1和表2中描述。每一事件 的单个成熟玉米种仁样品首先称重、研磨成精细均匀的粉末并用包含甲 醇、水和甲酸的提取溶剂提取。在其中种仁形成大块的情况下，使用大 约30mg研磨粉末。使用液相色谱和多重反应监测(MRM)质谱技术以分 离样品提取物中的赖氨酸。在分离后，赖氨酸使用其质谱峰面积针对使 用氘化d₄-赖氨酸内标(IS)制备的相应标准校正曲线而定量。

在另一种方法中，玉米种仁的赖氨酸含量以通过高效液相色谱 (HPLC)评估游离氨基酸为基础。每一事件的单个种仁或种仁汇集物如所 述研磨成精细均匀的粉末，并且在本例子中，大约30mg粉末用于分析。 氨基酸用5％三氯乙酸提取并且通过用邻苯二醛(OPA)的柱前伯胺衍生 化进行氨基酸检测。使用反向色谱，通过位于每个氨基酸上的R基团的 疏水性实现分离。为帮助稳定荧光团，添加硫醇，如2-巯基乙醇 (SHCH₂CH₂OH)或3-巯基丙酸(SHCH₂CH₂COOH)。

在通过用每种构建体转化而产生的转基因事件中测量的游离赖氨 酸水平(ppm)进行平均化并在表1中总结。还鉴定了已分析种子的世代 (F1、F2、F3和F4)。含有pMON80378的转基因玉米事件的R1种子的 游离赖氨酸水平量值示于表2。在分析的6个事件中5个事件的赖氨酸 水平令人惊讶地高。可以通过繁育含有表1中所述植物表达盒的多种组 合的玉米事件而进一步调整赖氨酸水平，以至于含有一种或多种表达盒 的杂交亲代的杂交种子具有所期望的赖氨酸水平。例如含有CordapA和 大肠杆菌lysC(野生型或Ec.lysC.mut，SEQ ID NO：11，编码在四个位置 S2A、C58G、T352I和A401G被修饰的蛋白质的DNA分子)表达盒的近 交亲代可以与具有LKR dsRNA表达盒的亲代配种以产生具有如此赖氨 酸水平的杂合子代种子，其中所述的赖氨酸水平比两种亲代种子的赖氨 酸水平的加和更高。其它组合如含有CordapA和LKR dsRNA的亲代可 以与LysC亲代交配，或LysC和LKR dsRNA亲代可以与CordapA亲代 交配以提供杂交种子中的出乎预料的高赖氨酸水平。

表1.从温室和多种田间试验所分析的每个世代的赖氨酸(ppm)平均值

表2.在用pMON80378转化的R1事件中测量的赖氨酸水平

  玉米事件  游离赖氨酸水平(ppm)   Zm M118682   16379   Zm M118685   15092   Zm M118686   17878   Zm M118699   18815   Zm M118700   22719   Zm M118702   1832

来自包含pMON93092的事件的种仁的游离赖氨酸含量也通过串联 质谱(LC MS-MS)对每穗大约20粒种仁的已研磨及提取样品进行测量。 在图7和图8中显示来自大量转化事件的R2种仁的游离赖氨酸的每百 万份(ppm)量。对于如所示包含pMON93092的事件，游离赖氨酸的水平 是大约3500-5500ppm，而对于如所示包含pMON93093的事件，游离赖 氨酸的水平是大约1700-6500ppm。在大多数情况下，独立地测量每事 件两个或更多穗并且显示标准差。在比较中，野生型玉米的赖氨酸水平 平均为50-100ppm。

对以上公开并在权利要求书中提及的Monsanto Technology LLC的 pMON93092和pMON93093已经根据布达佩斯条约在美国典型培养物 保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110进行 了保藏。ATCC登录号分别是PTA-6733和PTA-6734。保藏物将在保藏 状态下保持30年时间，或在最后要求后保持5年，或持续至专利的有 效期，以更长的为准，并且如果必要将在这个期间内进行替换。

全部出版物、专利和专利申请在本文中通过援引并入，其程度如同 将每个单独的出版物或专利申请具体地以及个别地被指明通过援引并 入一样。

参考文献

将以下所列参考文献通过援引并入至如此程度以至于它们补充、解 释、提供背景用于，或教授本文中所用的方法、技术和/或组合物。

美国专利4,810,648；美国专利4,957,748；美国专利4,959,317；美 国专利5,015,580；美国专利5,034,322；美国专利5,094,945；美国专利 5,100,679；美国专利5,107,065；美国专利5,188,642；美国专利5,219,596； 美国专利5,258,300；美国专利5,288,300；美国专利5,322,938；美国专 利5,352,605；美国专利5,359,142；美国专利5,362,865；美国专利 5,367,110；美国专利5,527,695；美国专利5,530,196；美国专利5,538,880； 美国专利5,550,318；美国专利5,591,616；美国专利5,627,061；美国专 利5,633,435；美国专利5,635,055；美国专利5,641,876；美国专利 5,759,829；美国专利5,773,691；美国专利5,780,708；美国专利5,824,877； 美国专利5,837,848；美国专利5,936,069；美国专利5,981,840；美国专 利6,005,076；美国专利6,040,497；美国专利6,107,549；美国专利 6,118,047；美国专利6,140,078；美国专利6,146,669；美国专利6,156,227； 美国专利6,160,208；美国专利6,175,060；美国专利6,177,611；美国专 利6,232,526；美国专利6,252,138；美国专利6,294,714；美国专利 6,376,754；美国专利6,384,301；美国专利6,399,861；美国专利6,403,865； 美国专利6,426,446；美国专利6,429,357；美国专利6,429,362；美国专 利6,433,252；美国专利6,437,217；美国专利6,459,019；美国专利 6,635,806；美国专利6,660,911；美国专利申请2002/0112260；美国专利 申请2003/0056242；美国专利申请2003/0106096；美国专利申请 2003/0140364；美国专利申请20030196219；美国专利申请2005/0132437； 美国专利申请2005/0193444；美国专利申请系列09/757,089

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Turner和Foster，Molec.Biotech.，3：225，1995.

序列表

<110>MALVAR，THOMAS M.

HUANG，SHIHSHIEH

LUETHY，MICHAEL H.

<120>具有增加的赖氨酸的转基因植物种子

<130>MONS：094US

<140>UNKNOWN

<141>2006-09-22

<150>60/723,178

<151>2005-10-03

<160>11

<210>1

<211>903

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>1

agtacaggtt taacagctaa gaccggagta gagcacttcg gcaccgttgg agtagcaatg

60

gttactccat tcacggaatccggagacatc gatatcgctg ctggccgcga agtcgcggct

120

tatttggttg ataagggctt ggattctttg gttctcgcgg gcaccactgg tgaatcccca

180

acgacaaccg ccgctgaaaa actagaactg ctcaaggccg ttcgtgagga agttggggat

240

cgggcgaagc tcatcgccgg tgtcggaacc aacaacacgc ggacatctgt ggaacttgcg

300

gaagctgctg cttctgctgg cgcagacggc cttttagttg taactcctta ttactccaag

360

ccgagccaag agggattgct ggcgcacttc ggtgcaattg ctgcagcaac agaggttcca

420

atttgtctct atgacattcc tggtcggtca ggtattccaa ttgagtctga taccatgaga

480

cgcctgagtg aattacctac gattttggcg gtcaaggacg ccaagggtga cctcgttgca

540

gccacgtcat tgatcaaaga aacgggactt gcctggtatt caggcgatga cccactaaac

600

cttgtttggc ttgctttggg cggatcaggt ttcatttccg taattggaca tgcagccccc

660

acagcattac gtgagttgta cacaagcttc gaggaaggcg acctcgtccg tgcgcgggaa

720

atcaacgcca aactatcacc gctggtagct gcccaaggtc gcttgggtgg agtcagcttg

780

gcaaaagctg cttcgcgtct gcagggcatc aacgtaggag atcctcgact tccaattatg

840

gctccaaatg agcaggaact tgaggctctc cgagaagaca tgaaaaaagc tggagttcta

900

taa

903

<210>2

<211>3183

<212>DNA

<213>Zea mays

<400>2

atgggttctg ctgctactga gggcaatgac accttgctgg gcaatggagt tgttgggatt

60

cttgctgaga cttgtaatat gtgggaaaga agggcgccgt taactccttc ccattgtgcc

120

cgccttctgc taggaggagg caagaacgga cctcgagtaa accggattat tgtgcagcca

180

agcacaagga ggatccatca tgacgctcag tatgaggatg caggatgcga gatttcagaa

240

gacctgtcag aatgcggcct tatcataggc atcaaacaac ccaagctgca gatgattctt

300

tcagatagag cgtacgcttt cttttcacac acacacaaag cccaaaaaga gaatatgcca

360

ctgttagaca agatccttga agaaagggtg tccttgtttg attatgagct aattgttgga

420

gatgatggga aaagatcact agcatttggg aaatttgctg gtagagctgg actgatagat

480

ttcttacatg gtctcggaca gcgatatttg agccttggat actcgactcc atttctctct

540

ctgggacaat ctcatatgta tccttcgctc gctgcagcca aggctgcagt cattgtcgtt

600

gcagaagaga tagcaacatt tggacttcca tccggaattt gtccgatagt gtttgtgttc

660

actggagttg gaaacgtctc tcagggtgcg caggagatat tcaagttatt gccccatacc

720

tttgttgatg ctgagaagct tcccgaaatt tttcaggcca ggaatctgtc taagcaatct

780

cagtcgacca agagagtatt tcaactttat ggttgtgttg tgacctctag agacatggtt

840

tctcacaagg atcccaccag acaatttgac aaaggtgact attatgctca tccagaacac

900

tacacccctg tttttcatga aagaattgct ccatatgcat ctgtcatcgt aaactgtatg

960

tattgggaga agaggtttcc accattacta aatatggatc agttacagca attgatggag

1020

actggttgtc ctttagtcgg cgtttgtgac ataacttgtg atattggagg  ttccattgaa

1080

tttatcaaca agagtacatc aatagagagg cctttctttc ggtatgatcc ttctaagaat

1140

tcataccatg atgatatgga aggtgccgga gtggtctgct tggctgttga cattctccct

1200

acagaattct ctaaagaggc ctcccaacat tttggaaaca tactatctag acttgttgct

1260

agtttggcct cagtgaagca accggcagaa cttccttcct acttgagaag agcttgcatt

1320

gcacatgctg gcagattaac tcctttgtat gaatatatcc ctaggatgag aaatactatg

1380

atagatttgg cacccgcaaa aacaaatcca ttgcctgaca agaagtatag caccctggta

1440

tctctcagtg ggcacctatt tgataagttc cttataaatg aagctttgga catcattgag

1500

acagctggag gttcatttca cttggttaga tgtgaagttg gacaaagcac ggatgatatg

1560

tcatactcag agcttgaagt aggagcagat gatactgcca cattggataa aattattgat

1620

tccttgactt ctttagctaa tgaacatggt ggagatcacg atgccgggca agaaattgaa

1680

ttagctctga agataggaaa agtcaatgag tatgaaactg acgtcacaat tgataaagga

1740

gggccaaaga ttttaattct tggagctgga agagtctgtc ggccagctgc tgagtttctg

1800

gcatcttacc cagacatatg tacctatggt gttgatgacc atgatgcaga tcaaattcat

1860

gttatcgtgg catctttgta tcaaaaagat gcagaagaga cagttgatgg tattgaaaat

1920

acaactgcta cccagcttga tgttgctgat attggaagcc tttcagatct tgtttctcag

1980

gttgaggttg taattagctt gctgcctgct agttttcatg ctgccattgc aggagtatgc

2040

atagagttga agaagcacat ggtaacggca agctatgttg atgaatccat gtcaaacttg

2100

agccaagctg ccaaagatgc aggtgtaact atactttgtg aaatgggcct agatcctggc

2160

atagatcact tgatgtcaat gaagatgatt gatgaagctc atgcacgaaa gggaaaaata

2220

aaggcattta catcttactg tggtggattg ccatctccag ctgcagcaaa caatccgctt

2280

gcctataaat tcagttggaa cccagctggt gcactccggt cagggaaaaa tcctgcagtc

2340

tacaaatttc ttggtgagac gatccatgta gatggtcata acttgtatga atcagcaaag

2400

aggctcagac tacgagagct tccagctttt gctctggaac acttgccaaa tcggaattcc

2460

ttgatatatg gtgaccttta tggtatctcc aaagaagcat ccaccatata tagggctact

2520

cttcgttacg aaggttttag tgagattatg gtaacccttt ccaaaactgg gttctttgat

2580

gctgcaaatc atccactgct gcaagatact agtcgtccaa catataaggg tttccttgat

2640

gaactactga ataatatctc cacaattaac acggacttag atattgaagc ctctggtgga

2700

tacgatgatg acctgattgc cagactgttg aagctcgggt gttgcaaaaa taaggaaata

2760

gctgttaaga cagtcaaaac catcaagttc ttgggactac atgaagagac tcaaatacct

2820

aagggttgtt cgagcccatt tgatgtgatt tgccagcgaa tggaacagag gatggcctat

2880

ggccacaatg agcaagacat ggtactgctc caccacgaag tcgaggtgga atacccggac

2940

gggcaacccg ccgaaaagca ccaagcgacg ctactggagt tcgggaaggt tgaaaatggc

3000

aggtccacca ctgccatggc gctgaccgtc ggcattccag cagcaatagg ggccctgcta

3060

ttgctaaaga ataaggtcca gacgaaagga gtgatcaggc ctctgcaacc ggaaatctac

3120

gttccagcat tggagatctt ggagtcgtcg ggcatcaagc tggttgagaa agtggagact

3180

tga

3183

<210>3

<211>1350

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>3

atggcagaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg

60

aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct

120

tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga

180

ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac

240

ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa

300

gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg

360

atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt

420

gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc

480

gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc

540

acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc

600

agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg

660

accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt

720

gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat

780

ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa

840

gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc

900

gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat

960

tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc  atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac

1020

ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaatccttg ataccaccgg ttcaacctcc

1080

actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg

1140

gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc

1200

ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat

1260

ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg

1320

caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa

1350

<210>4

<211>392

<212>DNA

<213>Zea mays

<400>4

gatctcgtca atttttccct tttgtaattt tgtaatttat aatttacttt cctgtatgct

60

tctaactctg tcgttttaaa attttaataa aatttcagta ggggcttgcc cctcctgtcc

120

tataaaaaaa agttgacgtg aatagatttc attaagaggt tggatgttag tgggatgaca

180

tgactattag taggacgaga tgatgtggaa agttagtggg agatgatatg gatagttttt

240

gctttcatcg aaaggttgga agttagtatg atgacatggc taatatagat acatagatat

300

agactaccaa catggctgca tgcccccaag ctctcccact atatatatct ctggtagcac

360

atcatcccaa ttcacaatgc ttacaaaaac cc

392

<210>5

<211>903

<212>DNA

<213>Corynebacterium glutamicum

<400>5

ttatagaact ccagcttttt tcatgtcttc tcgcagagcc tcaagttcct gctcatttgg

60

agccattatt ggaagcctag gatctcctac gttgatgcct tgcagacgca gagcagcttt

120

tgccaagctg actccaccca agcgaccctg ggcagctacc agcggtgata gtttggcgtt

180

gatctccctc gcacggacca ggtcgccttc ctcgaaactt gtgtacaact cccttaatgc

240

tgtgggggct gcatgtccaa ttacggatat aaaacctgat ccgcccaaag caagccaaac

300

aaggtttagt gggtcatcgc ctgaatacca ggcaagtccc gtttctttga tcaatgacgt

360

ggctgcaacc aggtcccctt tggcgtcttt gaccgccaaa atcgtaggta attcactcag

420

gcgtctcatg gtatcagact caattggaat acctgaccta ccaggaatgt cgtagaggca

480

aattggcacc tctgttgctg ctgcgattgc cccgaagtgc gccagcaatc cctcctggct

540

cggcttactg taataaggag ttacgactaa aaggccgtct gcgccagcag aagcagcagc

600

ctccgcaagt tccacagatg tccgcgtgtt attggttccg acaccggcga ttagtttcgc

660

cctatcccct acttcctcac gcacggcctt gagcagttct agtttctcag cggcggttgt

720

cgttggggat tcaccagtgg tgcccgcgag caccaaagaa tccaagcctt tatcgactag

780

ataagccgcg acctcgcggc cagcagctat atcgatgtct ccactttccg tgaatggagt

840

taccattgct actcccacgg tgccaaagtg ctctactccg gtcttagctg ttaaacctgt

900

gct

903

<210>6

<211>171

<212>DNA

<213>Zea mays

<400>6

atggtttcgc cgacgaatct cctcccggcg cggaagatca cccctgtctc aaatggcggc

60

gcagcgacgg cgagcccctc ttctccctcg gtggccgcac ggccacggcg actcccttca

120

ggcctccaat ctgtgactgg tagagggaag gtttccttgg cagccatcac t

171

<210>7

<211>300

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>7

Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr Val

1               5                   10                  15

Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp Ile Asp Ile

            20                  25                  30

Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu Asp

        35                  40                  45

Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr Ala

    50                  55                  60

Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly Asp

65                  70                  75                  80

Arg Ala Lys Leu Ile Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr Ser

                85                  90                  95

Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu Leu

            100                 105                 110

Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gln Glu Gly Leu Leu Ala

        115                 120                 125

His Phe Gly Ala Ile Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro Ile Cys Leu Tyr

    130                 135                 140

Asp Ile Pro Gly Arg Ser Gly Ile Pro Ile Glu Ser Asp Thr Met Arg

145                 150                 155                 160

Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr Ile Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys Gly

                165                 170                 175

Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu Ile Lys Glu Thr Gly Leu Ala Trp

            180                 185                 190

Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly Gly

        195                 200                 205

Ser Gly Phe Ile Ser Val Ile Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu Arg

    210                 215                 220

Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg Glu

225                 230                 235                 240

Ile Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gln Gly Arg Leu Gly

                245                 250                 255

Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Ser Arg Leu Gln Gly Ile Asn Val

            260                 265                 270

Gly Asp Pro Arg Leu Pro Ile Met Ala Pro Asn Glu Gln Glu Leu Glu

        275                 280                 285

Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu

    290                 295                 300

<210>8

<211>449

<212>PRT

<213>Escherichia coli

<400>8

Met Ala Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp

1               5                   10                  15

Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn

            20                  25                  30

Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu

        35                  40                  45

Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

    50                  55                  60

Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr

65                  70                  75                  80

Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr

                85                  90                  95

Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp

            100                 105                 110

Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu

        115                 120                 125

Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys

    130                 135                 140

Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala

145                 150                 155                 160

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu

                165                 170                 175

Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg

            180                 185                 190

Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu

        195                 200                 205

Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro

    210                 215                 220

Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile

225                 230                 235                 240

Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

                245                 250                 255

Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile

            260                 265                 270

Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu

        275                 280                 285

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu

    290                 295                 300

Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His

305                 310                 315                 320

Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn

                325                 330                 335

Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr

            340                 345                 350

Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln

        355                 360                 365

Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu

    370                 375                 380

Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys

385                 390                 395                 400

Ala Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg

                405                 410                 415

Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro

            420                 425                 430

Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe

        435                 440                 445

Glu

<210>9

<211>1155

<212>DNA

<213>Zea mays

<400>9

ccgatttggc aagtgttcca gagcaaaagc tggaagctct cgtagtctga gcctctttgc

60

tgattcatac aagttatgac catctacatg gatcgtctca ccaagaaatt tgtagactgc

120

aggatttttc cctgaccgga gtgcaccagc tgggttccaa ctgaatttat aggcaagcgg

180

attgtttgct gcagctggag atggcaatcc accacagtaa gatgtaaatg cctttatttt

240

tccctttcgt gcatgagctt catcaatcat cttcattgac atcaagtgat ctatgccagg

300

atctaggccc atttcacaaa gtatagttac acctgcatct ttggcagctt ggctcaagtt

360

tgacatggat tcatcaacat agcttgccgt taccatgtgc ttcttcaact ctatgcatac

420

tcctgcaatg gcagcatgaa aactagcagg cagcaagcta attacaacct caacctgaga

480

aacaagatct gaaaggcttc caatatcagc aacatcaagc tgggtagcag ttgtattttc

540

aataccatca actgtctctt ctgcatcttt ttgatacaaa gatgccacga taacatgaat

600

ttgatctgca tcatggtcat caacaccata ggtacatatg tctgggtaag atgccagaaa

660

ctcagcagct ggccgacaga ctcttccagc tccaaaccgg tgctgcctgc tagttttcat

720

gctgccattg caggagtatg catagagttg aagaagcaca tggtaacggc aagctatgtt

780

gatgaatcca tgtcaaactt gagccaagct gccaaagatg caggtgtaac tatactttgt

840

gaaatgggcc tagatcctgg catagatcac ttgatgtcaa tgaagatgat tgatgaagct

900

catgcacgaa agggaaaaat aaaggcattt acatcttact gtggtggatt gccatctcca

960

gctgcagcaa acaatccgct tgcctataaa ttcagttgga acccagctgg tgcactccgg

1020

tcagggaaaa atcctgcagt ctacaaattt cttggtgaga cgatccatgt agatggtcat

1080

aacttgtatg aatcagcaaa gaggctcaga ctacgagagc ttccagcttt tgctctggaa

1140

cacttgccaa atcgg

1155

<210>10

<211>1967

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>玉米hsp70内含子与LKR/SDH基因抑制分子的嵌合DNA分子

<400>10

accgtcttcg gtacgcgctc actccgccct ctgcctttgt tactgccacg tttctctgaa

60

tgctctcttg tgtggtgatt gctgagagtg gtttagctgg atctagaatt acactctgaa

120

atcgtgttct gcctgtgctg attacttgcc gtcctttgta gcagcaaaat  atagggacat

180

ggtagtacga aacgaagata gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct

240

tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct

300

gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag

360

gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc

420

tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttgatccc gatttggcaa gtgttccaga

480

gcaaaagctg gaagctctcg tagtctgagc ctctttgctg attcatacaa gttatgacca

540

tctacatgga tcgtctcacc aagaaatttg tagactgcag gatttttccc tgaccggagt

600

gcaccagctg ggttccaact gaatttatag gcaagcggat tgtttgctgc agctggagat

660

ggcaatccac cacagtaaga tgtaaatgcc tttatttttc cctttcgtgc atgagcttca

720

tcaatcatct tcattgacat caagtgatct atgccaggat ctaggcccat ttcacaaagt

780

atagttacac ctgcatcttt ggcagcttgg ctcaagtttg acatggattc atcaacatag

840

cttgccgtta ccatgtgctt cttcaactct atgcatactc ctgcaatggc agcatgaaaa

900

ctagcaggca gcaagctaat tacaacctca acctgagaaa caagatctga aaggcttcca

960

atatcagcaa catcaagctg ggtagcagtt gtattttcaa taccatcaac tgtctcttct

1020

gcatcttttt gatacaaaga tgccacgata acatgaattt gatctgcatc atggtcatca

1080

acaccatagg tacatatgtc tgggtaagat gccagaaact cagcagctgg ccgacagact

1140

cttccagctc caaaccggtg ctgcctgcta gttttcatgc tgccattgca ggagtatgca

1200

tagagttgaa gaagcacatg gtaacggcaa gctatgttga tgaatccatg tcaaacttga

1260

gccaagctgc caaagatgca ggtgtaacta tactttgtga aatgggccta gatcctggca

1320

tagatcactt gatgtcaatg aagatgattg atgaagctca tgcacgaaag ggaaaaataa

1380

aggcatttac atcttactgt ggtggattgc catctccagc tgcagcaaac aatccgcttg

1440

cctataaatt cagttggaac ccagctggtg cactccggtc agggaaaaat cctgcagtct

1500

acaaatttct tggtgagacg atccatgtag atggtcataa cttgtatgaa tcagcaaaga

1560

ggctcagact acgagagctt ccagcttttg ctctggaaca cttgccaaat cggaattaac

1620

gcctgaagga ataaatataa atgacgaaat tttgatgttt atctctgctc ctttattgtg

1680

accataagtc aagatcagat gcacttgttt taaatattgt tgtctgaaga aataagtact

1740

gacagtattt tgatgcattg atctgcttgt ttgttgtaac aaaatttaaa aataaagagt

1800

ttcctttttg ttgctctcct tacctcctga tggtatctag tatctaccaa ctgacactat

1860

attgcttctc tttacatacg tatcttgctc gatgccttct ccctagtgtt gaccagtgtt

1920

actcacatag tctttgctca tttcattgta atgcagatac caagcgg

1967

<210>11

<211>1350

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>11

atggcagaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg

60

aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct

120

tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga

180

ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac

240

ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa

300

gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg

360

atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt

420

gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc

480

gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc

540

acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc

600

agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg

660

accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt

720

gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat

780

ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa

840

gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc

900

gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat

960

tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac

1020

ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaatccttg ataccaccgg ttcaacctcc

1080

actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg

1140

gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc

1200

ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat

1260

ggcgcatcca gccataacct gtgcttcctg gtgcccggcg aagatgccga gcaggtggtg

1320

caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa

1350