小麦禾谷镰刀菌茎腐病苗期接种鉴定方法

摘要

本发明涉及一种小麦禾谷镰刀菌茎腐病(Crown Rot)苗期接种鉴定方法，属于植物保护技术领域，用于快速鉴定、筛选我国小麦资源中具有禾谷镰刀菌茎腐病抗性的小麦种质资源。禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)活化后接种在经过121℃高压灭菌的0.6％绿豆汤液体培养基中，25℃下在摇床中培养72h，获得105个孢子/mL禾谷镰刀菌悬浮液；小麦种子消毒后催芽，萌发后播种在灭菌的土壤中，出苗后10天接种，接种35天后对小麦茎基部进行茎腐病调查。本发明的优点在于：建立了小麦禾谷镰刀菌茎腐病苗期接种鉴定方法，为小麦禾谷镰刀菌茎腐病研究提供了基础。可快速筛选小麦抗性资源，提高小麦资源利用。

说明书

技术领域

本发明涉及小麦禾谷镰刀菌茎腐病(Crown Rot)苗期快速接种鉴定方法，尤其是对小麦抗茎腐病资源材料的筛选方法，属于植物保护技术领域。

背景技术

小麦镰刀菌(Fusarium)是危害小麦高产、稳产的主要致病菌之一。镰刀菌可以引起两种主要的小麦病害：即赤霉病(wheat scab)和茎腐病(crown rot)，80年代后期以来，由于全球气候变化和耕作制度的影响，小麦赤霉病在欧洲、美国、加拿大、中国、南美等地频繁发生，对小麦产量和品质造成了严重的损失，为此人们对小麦赤霉病已经进行了广泛深入的研究，并取得了显著的成就。我国是全球小麦赤霉病受害面积最大的国家，主要致病菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，长江中下游和华南冬麦区及东北春麦区东部小麦赤霉病尤为严重，每年小麦赤霉病的发生面积已超过700万hm²，约占全国小麦总面积的1/4。但对由镰刀菌引起的小麦茎腐病的研究在我国尚没有引起重视。而小麦茎腐病在澳大利亚、北美阿根廷、意大利、南非、土耳其等地小麦种植区发病严重，已经引起当地小麦育种和病理学者们的广泛关注。美国小麦茎腐病主要发生于气候较温暖的爱达荷州、俄勒冈州和华盛顿、科罗拉多州、怀俄明州及德克萨斯州等西北太平洋各州，研究表明，许多引起小麦赤霉病的镰刀菌如黄色镰刀菌、燕麦镰刀菌、禾谷镰刀菌、锐顶镰刀菌(F.culmorum，F.avenaceum，F.graminearum and F.acuminatum)也能引起小麦茎腐病，如在澳大利亚发现在同一田块小麦赤霉病和茎腐病同时发生。但是与小麦赤霉病的研究相比，小麦茎腐病抗性的研究较少，对小麦茎腐病抗性鉴定及其抗性遗传机制进展缓慢。

我国禾谷镰刀菌约占镰刀菌种或变种的94.5％，遍及21个省(市)，是导致目前小麦赤霉病流行的优势镰刀菌种，赤霉病危害区域逐年扩大已波及黄淮海和西北等广大冬麦区，因此受到广泛关注和研究，同时也发现小麦赤霉病粒发芽率低，带菌种子还会造成苗枯及茎基部腐烂。而国外研究已经表明，许多镰刀菌(F.grantinearun，F.culmorum，F.avenaceun和F.nivale)可以引起小麦茎腐病(crown rot)，其中尤其以禾谷镰刀菌致病性最强。我国对小麦根部病害也有报道，在我国小麦赤霉病流行的部分地区具备小麦茎腐病发生的条件。但至今我国尚未详细报道由禾谷镰刀菌引起的小麦茎腐病，而有关禾谷镰刀菌茎腐病的鉴定方法更没有报道。鉴于近年来我国小麦镰刀菌引起的小麦赤霉病发病严重并有北方蔓延趋势，因此，建立小麦禾谷镰刀菌茎腐病的鉴定方法对筛选抗性资源和研究小麦茎腐病抗性机制等问题势在必行。

发明内容

技术问题本发明的目的在于：针对我国小麦禾谷镰刀菌茎腐病苗期鉴定方法的空白，提供一种快速苗期高效鉴定小麦资源材料抗性的方法。

技术方案  本发明的目的是这样实现的：小麦禾谷镰刀菌茎腐病苗期鉴定方法，其特征在于：禾谷镰刀菌菌种活化后于灭菌的0.6％绿豆汤培养基(mung beanagar，MBA)25℃振荡培养72h，多层纱布过滤，调节菌液浓度至10⁵个孢子/mL悬浮液。小麦种子经0.1％升汞消毒10min后再用75％酒精消毒5min，无菌水冲洗3-4次。在培养皿中催芽，种子萌发后播种于8×8cm营养钵中生长，营养钵中装有经过121℃高压灭菌40min的土壤，生长期温度保持20-25℃/10-15℃(昼/夜)，小麦出苗后10d(播种后约13-14天)在每株幼苗茎基部距离土表约0.5-1.0cm处缠绕少量浸湿的医用脱脂棉球，在棉球内侧小麦茎部接触处接种0.5mL已经调整好浓度的孢子液，接种后用双层遮阳网覆盖，并采用弥雾系统将接种幼苗置于近饱和的相对湿度下48h，而后去除遮阳网幼苗正常生长管理。接种后35d对小麦茎基部进行茎腐病调查。病情指数＝∑病情级别×该级株数/(调查总株数×最高病级)]×100％。病情指数＜10％为抗病；病情指数10.01-20.0％为中抗；病情指数20.01-30.0％为中感；病情指数＞30.01％为感病。鉴定试验设三次重复，每处理15株。

有益效果本发明的优点在于：在我国率先建立了小麦禾谷镰刀菌茎腐病抗性苗期鉴定新方法。本发明对我国部分小麦育种资源和引自澳大利亚小麦禾谷镰刀菌抗/感材料进行鉴定取得了满意结果。表明该方法可以用于快速筛选我国小麦资源中具有禾谷镰刀菌茎腐病抗性的小麦种质资源，拓宽小麦资源利用。

具体实施方式

取保存的禾谷镰刀菌菌种在超净工作台上挑取一小块菌丝接种在配制好的PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂)上活化培养3天。然后挑取一小块菌丝接种在灭菌后的0.6％绿豆汤液体培养基中(mung bean agar，MBA)。在25℃控温摇床上180r/min振荡培养72h，多层纱布过滤，在显微镜下用血球计数板计数、调节菌液浓度至10⁵个孢子/mL悬浮液，4℃保存备用。

小麦种子经0.1％升汞消毒10min后再用75％酒精消毒5min，无菌水冲洗3-4次。在无菌操作下将种子在培养皿中催芽，培养皿中垫一层滤纸。

种子萌发后播种于8×8cm营养钵中生长，营养钵中土壤经过高温高压灭菌40分钟，冷却后装营养钵。生长期温度保持20-25℃/10-15℃(昼/夜)。

小麦出苗后10d(播种后约13-14天)在每株幼苗茎基部距离土表约0.5-1.0cm处缠绕少量浸湿的医用脱脂棉球，在棉球内侧与小麦茎部接触处接种0.5mL已经调整好浓度的孢子液，接种后用双层遮阳网覆盖，并采用弥雾系统或喷雾器在遮阳网上弥雾，将接种幼苗置于近饱和的相对湿度下48h，而后去除遮阳网幼苗正常生长管理。

接种后35d对小麦茎基部进行茎腐病调查。病情指数＝∑病情级别×该级株数/(调查总株数×最高病级)]×100％。病情指数＜10％为抗病；病情指数10.01-20.0％为中抗；病情指数20.01-30.0％为中感；病情指数＞30.01％为感病。鉴定试验设三次重复，每处理15株。试验分别以澳大利亚小麦品种Sunco和Kennedy(V.Mitter，M.C.Zhang，C.J.Liu et al，.A high-throughput glasshouse bioassay to detect crown rot resistance in wheatgermplasm，Plant Pathology，2006，55，433-441)作为抗/感对照品种。

依据病害程度调查结果，按照病害分级和病情指数对小麦资源进行评价。

如本试验中，部分材料鉴定结果如表1，在鉴定的35份材料中，不同时期鉴定结果间相关性显著(r＝0.83)，表明该方法鉴定结果可靠。鉴定结果表明，5份材料病情指数小于20％为中抗材料；8份材料病情指数介于20-30％，属于中感材料，其余22材料病情指数大于30％，为感病材料。未发现对禾谷镰刀菌茎腐病高抗的材料。这表明在小麦茎腐病抗性资源鉴定中需要进一步扩大种质资源筛选范围，为抗茎腐病育种提供材料基础。

表1小麦部分材料禾谷镰刀菌茎腐病抗性评价

注：抗病(R)；中抗(MR)；中感(MS)；感病(S)。