一种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体

摘要

本发明提供了一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列和含有该重组基因的重组载体。本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列，将该基因序列克隆至载体pPIC9K中，得到真核表达载体pSECH。通过电击法转化巴斯德毕赤酵母GS115，根据生长情况快速筛选抗性较高的阳性克隆转化子，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列和含有该重组内切几丁质酶基因的重组载体。

背景技术

几丁质又称甲壳素，化学名为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的天然高分子氨基多糖类化合物，广泛存在于低等植物菌类、藻类的细胞和甲壳动物虾、蟹、昆虫外壳以及高等植物的细胞壁中。自然界中几丁质年生物合成量近一百亿吨，其中10％来自于海洋，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源，但遗憾的是这一资源未被充分利用而作为废物自然流失，不仅造成了巨大的浪费，而且还导致了严重的环境污染。大量的废弃几丁质资源由于没有行之有效的处理方法或因处理效果不好长期存在于自然环境中，在一定条件下会发生化学的、物理的或生物的转化，对周围环境造成一定的影响。污染成分不仅通过水、气、土壤、食物链等途径污染环境，成为大气、水体和土壤环境污染的“源头”；同时又是各种病源微生物的孽生地和繁殖场，形成病源型污染，严重危害人体健康。如何充分利用这些几丁质资源，使之变废为宝，消除其对环境的污染，成为目前急需解决的重要问题。

近年来人们逐渐发现几丁质的中间降解产物几丁寡糖具有区别于单糖的某些独特的生理功能：增强人体免疫机能；促进脾脏抗体的形成；抗肿瘤及抑制肿瘤转移；降低胆固醇和血脂的含量；抗血栓、降血压、降血糖、抗凝血、抗菌和抑菌等生物活性并能选择性地活化和增殖人体肠道内的有益菌；消除体内霉素，调节生理机能，延缓衰老；强化肝脏机能，阻碍病原菌生长繁殖和排除体内重金属等，已被科学界列为人的生命第六要素，是目前发现的唯一的阳离子动物性膳食纤维，在医药、保健、化工、食品、环境和农业等领域具有广泛的应用前景，附加值高，因此几丁寡糖的生产已成为开发利用几丁质原料的一条重要途径。

几丁质可通过酸法或酶法降解。酸法降解能耗大，降解程度难以控制，降解产物主要为单糖，降解过程中产生的含硫酸或盐酸的废水直接排放或加碱中和后排放到环境中，对环境造成严重的二次污染。酶法降解具有反应条件温和，能耗低，无需昂贵设备和对环境友好等优点，因而具有良好的应用前景。几丁质可通过几丁质降解酶系作用而降解。根据反应初级产物类型和水解切口位置的不同，几丁质降解酶系可分为内切几丁质酶、外切几丁质酶和几丁二糖酶。内切几丁质酶从几丁质链的内部切割β-1，4糖苷键，产生几丁寡糖；外切几丁质酶从几丁质链的非还原性末端依次切割β-1，4糖苷键，产生几丁单糖；几丁二糖酶则专一性的将几丁二糖降解为几丁单糖，因此研制高效廉价的内切几丁质酶是催化几丁质降解成几丁寡糖的关键所在。

巴斯德毕赤酵母表达系统现在已经发展成为一种高效的外源蛋白基因优秀表达系统，具有高表达、高稳定、高分泌、易适应大规模工业化发酵和培养成本低等优点。为了能够提高内切几丁质酶蛋白的表达量，本专利首先根据巴斯德毕赤酵母基因组中各种氨基酸密码子的使用频率，设计合适的引物，采用PCR技术合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的内切几丁质酶基因序列，然后构建了含有该目的基因序列的表达载体pSECH，最后将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶巴斯德毕赤酵母工程菌，实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景，经济、生态环境效益将非常明显。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的又一个目的在于提供一种含有上述重组内切几丁质酶基因的重组载体和由该重组载体转化的巴斯德毕赤酵母宿主。

本发明采用现代生物技术，利用PCR合成了基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因，构建了微生物表达载体，再将该表达载体转至表达量高，易于纯化以及容易适应大规模工业化发酵生产的巴斯德毕赤酵母中，构建高分泌型内切几丁质酶工程菌，可实现高效廉价内切几丁质酶的产业化生产，具有广阔的应用前景，

附图说明

图1表示重组内切几丁质酶基因的真核表达载体的构建。

具体实施方式

实施例1.基于巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性的重组内切几丁质酶基因序列的获得

根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏爱性和内切几丁质酶的基因序列，设计以下引物：

F₁：5’-GAATTCGCTAGTGGTTACGCTAACGCTGTTTACTTTACTAACTGGGGTATTTACGGT-3’

F₂：5’-ACTGGGGTATTTACGGTCGTAACTTTCAACCACAAAACCTTGTTGCTTCTGATATTACT-3’

F₃：5’-TGTTGCTTCTGATATTACTCATGTTATTTACTCTTTTATGAACTTTCAAGCTGATGGTACT-3’

F₄：5’-TTCAAGCTGATGGTACTGTTGTTTCTGGTGATGCTTACGCTGATTACCAAAAGCATTAC-3’

F₅：5’-ATTACCAAAAGCATTACGATGATGATTCTTGGAACGATGTTGGTAACAACGCTTACGGT-3’

F₆：5’-GTAACAACGCTTACGGTTGTGTTAAGCAACTTTTTAAGTTGAAGAAGGCTAACCGTAAC-3’

F₇：5’-AGAAGGCTAACCGTAACTTGAAGGTTATGCTTTCTATTGGTGGTTGGACTTGGTCTACT-3’

F₈：5’-GTTGGACTTGGTCTACTAACTTTCCATCTGCTGCTAGTACTGATGCTAACCGTAAGAAC-3’

F₉：5’-ATGCTAACCGTAAGAACTTTGCTAAGACTGCTATTACTTTTATGAAGGATTGGGGTTTT-3’

F₁₀：5’-TGAAGGATTGGGGTTTTGATGGTATTGATGTTGATTGGGAATACCCAGCTGATGATACT-3’

F₁₁：5’-ACCCAGCTGATGATACTCAAGCTACTAACATGGTTCTTCTTCTTAAGGAAATTCGTTCT-3’

F₁₂：5’-TTAAGGAAATTCGTTCTCAACTTGATGCTTACGCTGCTCAATACGCTCCAGGTTACCAT-3’

F₁₃：5’-ACGCTCCAGGTTACCATTTTCTTCTTTCTATTGCTGCTCCAGCTGGTCCAGAACATTAC-3’

F₁₄：5’-CAGCTGGTCCAGAACATTACTCTTTTCTTCATATGTCTGATCTTGGTCAAGTTCTTGT-3’

R₁：5’-AGCGGCCGCTTAGTTAAGACCACTACGAATGTTATCGTATTGAGAGTT-3’

R₂：5’-TTATCGTATTGAGAGTTTGGGTAACCAAGCAAGTTTTGAGTAGAATCAAGACTACCAAG-3’

R₃：5’-GAATCAAGACTACCAAGAGCTCTATGACTAGTACCAATCAAAGAATCAGAACCAGTCTT-3’

R₄：5’-GAATCAGAACCAGTCTTATCAGCAGAAGCTTCCCAAAACATACTACCACCAAGACCAAG-3’

R₅：5’-CTACCACCAAGACCAAGGTTCTTAAGGTAAGAAACCTTAGTGTTAATCATAGCTGGAGT-3’

R₆：5’-TTAATCATAGCTGGAGTATCAAAAGAAATAAGTTCCTTACTACTTGGATCGTAACTGTA-3’

R₇：5’-CTTGGATCGTAACTGTAGTAAGCTTGAGCAGTAGAATCGTATTGAACAGTAGCACCAGC-3’

R₈：5’-TGAACAGTAGCACCAGCCTTTGGAAGAACCTTGTAATCCCAAATACCGTTTTCCCAACT-3’

R₉：5’-ATACCGTTTTCCCAACTACCAGAACCAATACCACTGTAAGTTTGACCAATACCACCAGT-3’

R₁₀：5’-TGACCAATACCACCAGTACTTTCAAAAGAACGACCGTAAATTGGCATACCAAGAACAAT-3’

R₁₁：5’-GGCATACCAAGAACAATCTTACTAGCTGGAACACCACCCTTAATGTAATCCTTAATAGC-3’

R₁₂：5’-ATGTAATCCTTAATAGCTTGATCAGTGTTGTATGGAGAAGAGTTAGAGTTAGATGGGTT-3’

R₁₃：5’-TTAGAGTTAGATGGGTTAGCAAACAAGTTAGCATCATGACCAGAGTAACTACTCCAAGA-3’

R₁₄：5’-GAGTAACTACTCCAAGAACCAGCGTAATCGTAAGCCATAAGGTTAACGTAATCAAGAACTTGACCAA-3’

其中正向引物为F₁-F₁₄，反向引物为R₁-R₁₄。引物F₁与F₂，F₂与F₃，F₃与F₄，F₄与F₅，F₅与F₆，F₆与F₇，F₇与F₈，F₈与F₉，F₉与F₁₀，F₁₀与F₁₁，F₁₁与F₁₂，F₁₂与F₁₃，F₁₃与F₁₄以及引物R₁与R₂，R₂与R₃，R₃与R₄，R₄与R₅，R₅与R₆，R₆与R₇，R₇与R₈，R₈与R₉，R₉与R₁₀，R₁₀与R₁₁，R₁₁与R₁₂，R₁₂与R₁₃，R₁₃与R₁₄之间分别存在长度为17-20nt的相同序列片段。

将上述引物混合，各条引物的浓度为10μM，然后进行PCR反应扩增编码内切几丁质酶的基因序列。

PCR反应体系为(25μl)：10×PCR Buffer 2.5μl，MgCl₂1.5μl，dNTP 1μl，DNA2μl，Taq酶0.25μl，引物混合物2μl，双蒸水14.75μl。

反应参数为：94℃5min，(94℃45s，55℃45s，72℃1min)共30个循环，最后在72℃延伸10min，琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，回收产物送上海生工生物工程有限公司测序，所得序列如SEQ ID NO.1所示，经DNA序列比对分析，该序列测序结果与预期序列结果一致。由SEQ ID NO.1编码的重组内切几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2.重组巴斯德毕赤酵母表达载体的构建

用EcoRI和NotI分别双酶切PCR扩增产物和原始表达质粒pPIC9K，琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，用T₄DNA连接酶连接回收的目的条带，得到真核表达载体pSECH，用CaCl₂法42℃热激90秒将其转化到大肠杆菌DH5α。利用Kana抗性筛选单菌落。所选转化克隆酶切鉴定和DNA测序测定证明克隆正确后送上海生物工程有限公司测序，具体操作流程见图1。

实施例3.重组巴斯德毕赤酵母的转化和筛选

将鉴定正确的重组表达载体pSECH质粒DNA经内切酶XbaI线性化处理，电击转化毕赤酵母GS115。电击结束后，立即加入1ml预冷的1mol/l山梨醇，3000rpm离心5min，菌体重悬于400μl预冷的1mol/l山梨醇中，取200μl涂布于MD平板(1.34％酵母氮碱，4×10^-5％生物素，2％葡萄糖，2％琼脂糖)上，30℃培养至菌落出现。随机挑取菌落点种到含不同浓度抗生素G418(0，0.25mg/ml，0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.00mg/ml，1.50mg/ml，1.75mg/ml，2.00mg/ml，3.00mg/ml，4.00mg/ml)的YPD平板上，30℃培养2～5d，每天检查菌落生长情况。根据生长情况快速筛选出G418抗性较高的阳性克隆转化子。测定酶活条件：用1％胶态几丁质作为底物，pH＝7缓冲液，37℃反应1小时，加入3mL DNS，100℃反应10min中止反应，迅速用冷水冷却，离心取上清测定其OD540nm值。酶活定义：pH＝7缓冲液环境，37℃，每分钟催化胶态几丁质生成1mg NAG(乙酰氨基葡萄糖)定义为一个酶活单位。根据该测定方法，测得筛选的转化子产内切几丁质酶的酶活为837U/mL。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非作为对本发明的限定，只要在本发明的实质范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明权利要求书的范围内。

序列表

<110>浙江工商大学

<120>一种重组内切几丁质酶基因序列及其重组载体

<130>

<160>30

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1185

<212>DNA

<213>木霉(Trichoderma)

<400>1

gaattcgcta gtggttacgc taacgctgtt tactttacta actggggtat ttacggtcgt   60

aactttcaac cacaaaacct tgttgcttct gatattactc atgttattta ctcttttatg  120

aactttcaag ctgatggtac tgttgtttct ggtgatgctt acgctgatta ccaaaagcat  180

tacgatgatg attcttggaa cgatgttggt aacaacgctt acggttgtgt taagcaactt  240

tttaagttga agaaggctaa ccgtaacttg aaggttatgc tttctattgg tggttggact  300

tggtctacta actttccatc tgctgctagt actgatgcta accgtaagaa ctttgctaag  360

actgctatta cttttatgaa ggattggggt tttgatggta ttgatgttga ttgggaatac  420

ccagctgatg atactcaagc tactaacatg gttcttcttc ttaaggaaat tcgttctcaa  480

cttgatgctt acgctgctca atacgctcca ggttaccatt ttcttctttc tattgctgct  540

ccagctggtc cagaacatta ctcttttctt catatgtctg atcttggtca agttcttgat  600

tacgttaacc ttatggctta cgattacgct ggttcttgga gtagttactc tggtcatgat  660

gctaacttgt ttgctaaccc atctaactct aactcttctc catacaacac tgatcaagct  720

attaaggatt acattaaggg tggtgttcca gctagtaaga ttgttcttgg tatgccaatt  780

tacggtcgtt cttttgaaag tactggtggt attggtcaaa cttacagtgg tattggttct  840

ggtagttggg aaaacggtat ttgggattac aaggttcttc caaaggctgg tgctactgtt  900

caatacgatt ctactgctca agcttactac agttacgatc caagtagtaa ggaacttatt  960

tcttttgata ctccagctat gattaacact aaggtttctt accttaagaa ccttggtctt  1020

ggtggtagta tgttttggga agcttctgct gataagactg gttctgattc tttgattggt  1080

actagtcata gagctcttgg tagtcttgat tctactcaaa acttgcttgg ttacccaaac  1140

tctcaatacg ataacattcg tagtggtctt aactaagcgg ccgca                  1185

<210>2

<211>390

<212>PRT

<213>木霉(Trichoderma)

<400>2

Phe Ala Ser Gly Tyr Ala Asn Ala Val Tyr Phe Thr Asn Trp Gly Ile

1               5                   10                  15

Tyr Gly Arg Asn Phe Gln Pro Gln Asn Leu Val Ala Ser Asp Ile Thr

            20                  25                  30

His Val Ile Tyr Ser Phe Met Asn Phe Gln Ala Asp Gly Thr Val Val

        35                  40                  45

Ser Gly Asp Ala Tyr Ala Asp Tyr Gln Lys His Tyr Asp Asp Asp Ser

    50                  55                  60

Trp Asn Asp Val Gly Asn Asn Ala Tyr Gly Cys Val Lys Gln Leu Phe

65                  70                  75                  80

Lys Leu Lys Lys Ala Asn Arg Asn Leu Lys Val Met Leu Ser Ile Gly

                85                  90                  95

Gly Trp Thr Trp Ser Thr Asn Phe Pro Ser Ala Ala Ser Thr Asp Ala

            100                 105                 110

Asn Arg Lys Asn Phe Ala Lys Thr Ala Ile Thr Phe Met Lys Asp Trp

        115                 120                 125

Gly Phe Asp Gly Ile Asp Val Asp Trp Glu Tyr Pro Ala Asp Asp Thr

    130                 135                 140

Gln Ala Thr Asn Met Val Leu Leu Leu Lys Glu Ile Arg Ser Gln Leu

145                 150                 155                 160

Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Tyr Ala Pro Gly Tyr His Phe Leu Leu Ser

                165                 170                 175

Ile Ala Ala Pro Ala Gly Pro Glu His Tyr Ser Phe Leu His Met Ser

            180                 185                 190

Asp Leu Gly Gln Val Leu Asp Tyr Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp Tyr

        195                 200                 205

Ala Gly Ser Trp Ser Ser Tyr Ser Gly His Asp Ala Asn Leu Phe Ala

    210                 215                 220

Asn Pro Ser Asn Ser Asn Ser Ser Pro Tyr Asn Thr Asp Gln Ala Ile

225                 230                 235                 240

Lys Asp Tyr Ile Lys Gly Gly Val Pro Ala Ser Lys Ile Val Leu Gly

                245                 250                 255

Met Pro Ile Tyr Gly Arg Ser Phe Glu Ser Thr Gly Gly Ile Gly Gln

            260                 265                 270

Thr Tyr Ser Gly Ile Gly Ser Gly Ser Trp Glu Asn Gly Ile Trp Asp

        275                 280                 285

Tyr Lys Val Leu Pro Lys Ala Gly Ala Thr Val Gln Tyr Asp Ser Thr

    290                 295                 300

Ala Gln Ala Tyr Tyr Ser Tyr Asp Pro Ser Ser Lys Glu Leu Ile Ser

305                 310                 315                 320

Phe Asp Thr Pro Ala Met Ile Asn Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Asn

                325                 330                 335

Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Phe Trp Glu Ala Ser Ala Asp Lys Thr

            340                 345                 350

Gly Ser Asp Ser Leu Ile Gly Thr Ser His Arg Ala Leu Gly Ser Leu

        355                 360                 365

Asp Ser Thr Gln Asn Leu Leu Gly Tyr Pro Asn Ser Gln Tyr Asp Asn

    370                 375                 380

Ile Arg Ser Gly Leu Asn

385                 390

<210>3

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaattcgcta gtggttacgc taacgctgtt tactttacta actggggtat ttacggt    57

<210>4

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

actggggtat ttacggtcgt aactttcaac cacaaaacct tgttgcttct gatattact  59

<210>5

<211>61

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tgttgcttct gatattactc atgttattta ctcttttatg aactttcaag ctgatggtac 60

t                                                                 61

<210>6

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ttcaagctga tggtactgtt gtttctggtg atgcttacgc tgattaccaa aagcattac    59

<210>7

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

attaccaaaa gcattacgat gatgattctt ggaacgatgt tggtaacaac gcttacggt    59

<210>8

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gtaacaacgc ttacggttgt gttaagcaac tttttaagtt gaagaaggct aaccgtaac    59

<210>9

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

agaaggctaa ccgtaacttg aaggttatgc tttctattgg tggttggact tggtctact    59

<210>10

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gttggacttg gtctactaac tttccatctg ctgctagtac tgatgctaac cgtaagaac    59

<210>11

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

atgctaaccg taagaacttt gctaagactg ctattacttt tatgaaggat tggggtttt    59

<210>12

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tgaaggattg gggttttgat ggtattgatg ttgattggga atacccagct gatgatact    59

<210>13

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

acccagctga tgatactcaa gctactaaca tggttcttct tcttaaggaa attcgttct    59

<210>14

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

ttaaggaaat tcgttctcaa cttgatgctt acgctgctca atacgctcca ggttaccat    59

<210>15

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

acgctccagg ttaccatttt cttctttcta ttgctgctcc agctggtcca gaacattac    59

<210>16

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cagctggtcc agaacattac tcttttcttc atatgtctga tcttggtcaa gttcttgat    59

<210>17

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

agcggccgct tagttaagac cactacgaat gttatcgtat tgagagtt                48

<210>18

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ttatcgtatt gagagtttgg gtaaccaagc aagttttgag tagaatcaag actaccaag    59

<210>19

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

gaatcaagac taccaagagc tctatgacta gtaccaatca aagaatcaga accagtctt    59

<210>20

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

gaatcagaac cagtcttatc agcagaagct tcccaaaaca tactaccacc aagaccaag    59

<210>21

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

ctaccaccaa gaccaaggtt cttaaggtaa gaaaccttag tgttaatcat agctggagt    59

<210>22

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ttaatcatag ctggagtatc aaaagaaata agttccttac tacttggatc gtaactgta    59

<210>23

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

cttggatcgt aactgtagta agcttgagca gtagaatcgt attgaacagt agcaccagc    59

<210>24

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

tgaacagtag caccagcctt tggaagaacc ttgtaatccc aaataccgtt ttcccaact    59

<210>25

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

ataccgtttt cccaactacc agaaccaata ccactgtaag tttgaccaat accaccagt    59

<210>26

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

tgaccaatac caccagtact ttcaaaagaa cgaccgtaaa ttggcatacc aagaacaat    59

<210>27

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

ggcataccaa gaacaatctt actagctgga acaccaccct taatgtaatc cttaatagc    59

<210>28

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

atgtaatcct taatagcttg atcagtgttg tatggagaag agttagagtt agatgggtt    59

<210>29

<211>59

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

ttagagttag atgggttagc aaacaagtta gcatcatgac cagagtaact actccaaga    59

<210>30

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

gagtaactac tccaagaacc agcgtaatcg taagccataa ggttaacgta atcaagaact    60

tgaccaa                                                              67