葛根、山楂和红花黄酮类成分的提取纯化工艺

摘要

复方脑得生方中葛根、山楂和红花黄酮类成分的提取纯化工艺。按质量比取葛根261份，山楂157份和红花91份，加浓度60－80％的乙醇回流提取三次，三次乙醇加入量分别为药材质量10、8、6倍量，提取时间分别为2、1、1小时，合并3次提取液，回收乙醇，浓缩到无乙醇味，得到的提取浓缩液，加水至含生药0.1克/毫升，过滤，滤液过D－101大孔树脂柱吸附、用水洗和乙醇洗脱，吸附液流速为1－3倍柱体积/小时，吸附液量为4－5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为4－6倍柱体积；洗脱用乙醇浓度为30－60％，流速为1－3倍柱体积/小时，用量为2－6倍柱体积；收集乙醇洗脱液，浓缩至密度1.05－1.10克/毫升，干燥，即得总黄酮质量含量78.1％提取物产品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药复方的提取方法，具体涉及复方脑得生方中葛根、山楂和红花的提取方法及其提取物。

背景技术

复方脑得生收载于《中国药典》2005版一部，由三七、川芎、红花、葛根、山楂组成。治疗脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症等病症有显著疗效。

现代药理研究表明，葛根总黄酮具有扩张脑血管，解除脑血管痉挛，改善脑循环，增加脑血流量的作用。山楂的主要有效成分为黄酮类化合物，具有降血压、增加冠脉流量、强心、降血脂等作用。红花总黄酮具有扩张冠状动脉、改善心肌缺血、降低血压、抗脑缺血、保护神经细胞及抑制血小板活化、缓解血栓形成、减轻血液循环障碍等作用。因此，开发研究复方脑得生方中葛根、山楂和红花三味药总黄酮提取物具有重要的意义。

目前脑得生制剂多为片剂、蜜丸剂、颗粒剂、胶囊剂。以上各制剂中葛根、山楂、红花全部或部分以生药粉入药，以致服用剂量较大，质量可控性，不符合中药现代药化的要求。

本研究采用正交实验设计法对葛根、山楂和红花三味药的总黄酮提取纯化作了全面系统的研究。内容具有较强的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种复方脑得生方中葛根、山楂和红花的总黄酮有效部位的提取、纯化和提取物的干燥方法。

本发明的又一目的在于提供采用上述方法获得的葛根、山楂和红花总黄酮提取物。

本发明所述复方脑得生方中葛根、山楂和红花三味中药质量比例为：

葛根261份  山楂(去核)157份  红花91份。

本发明的一种葛根、山楂和红花的提取纯化方法包括：葛根、山楂和红花乙醇提取液浓缩后，过大孔树脂柱，水洗，再用乙醇洗脱，浓缩乙醇洗脱液，喷雾干燥。

具体提取纯化步骤如下：

1)、取复方脑得生方中葛根、山楂和红花饮片，加浓度60-80％的乙醇回流提取三次，第一次加药材质量10倍量的乙醇提取2小时，第二次加8倍量的乙醇提取1小时，第三次加6倍量的乙醇提取1小时，合并3次提取液，减压回收乙醇，浓缩到无乙醇味，得提取浓缩液；

2)、将步骤1)得到的提取浓缩液加水至每毫升含生药0.1克，过滤，得滤液；

3)、将步骤2)得到的滤液过D-101大孔树脂柱进行吸附、用水洗和乙醇洗脱，吸附、水洗和乙醇洗脱工艺条件为：吸附液流速为1-3倍柱体积/小时，吸附液量为4-5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为4-6倍柱体积；洗脱用乙醇的浓度为30-60％，流速为1-3倍柱体积/小时，用量为2-6倍柱体积；

4)、收集乙醇洗脱液，浓缩至密度为1.05-1.10克/毫升，喷雾干燥，得到葛根、山楂和红花的提取物产品，提取物中总黄酮质量含量为78.1％。收集干燥的提取物产品，封口，放冷，称重，置干燥处保存。

上述提取纯化优选条件：

所述步骤1)中加浓度70％的乙醇回流提取三次。

所述步骤3)中吸附流速为1倍柱体积/小时，吸附量为3.5倍柱体积；水洗速率为3倍柱体积/小时，水洗体积为5倍柱体积；洗脱用乙醇的浓度为40％，流速为3倍柱体积/小时，用量为5倍柱体积。

所述步骤4)中喷雾干燥条件为：喷雾干燥器进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为20000转/分钟。

本发明中所述乙醇浓度％是指100体积乙醇水溶液中含乙醇体积分数。

发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、有效成分转移率高且提取物总黄酮纯度高。对脑得生中葛根、山楂和红花三味药乙醇回流提取再过大孔树脂，除去了大量水溶性杂质，纯化得到的总黄酮有效部位，总黄酮转移率达到84.2％、质量含量高达78.1％。

2、采用喷雾干燥可以明显缩短活性成分的受热时间，减少成分损失。

3、喷雾干燥粉末较稳定均一，方便下一步制剂。

3、本工艺采用D-101 大孔树脂进行分离纯化。该树脂价格较低，而且安全性较高，是目前国内药品行业使用最多的一种大孔树脂。

附图说明

图1葛根、山楂和红花提取总黄酮工艺流程图

图2葛根、山楂和红花提取液样品溶液上D101大孔树脂柱吸附总黄酮的泄漏曲线

图3水洗量与水洗液中黄酮含量关系曲线(水洗量考察)

图4水洗量与水洗液中干膏重关系曲线(水洗量考察)

图540％乙醇为洗脱剂洗脱树脂柱中总黄酮的洗脱曲线

图1所示工艺流程为：取三味中药饮片(葛根261份、山楂157份、红花91份)14公斤，用70％乙醇回流提取3次，第一次用乙醇140升，回流提取2小时，第二次用乙醇为112升，第三次用乙醇为84升，分别回流提取1小时，3次得到的山楂提取液合并，回收乙醇，浓缩到无乙醇味，释至140升，过滤备用；滤液以1倍柱体积/小时速率通过大孔树脂(药材：D-101 大孔树脂＝1∶3)，吸附完全后先用以3倍柱体积/小时速率冲5倍柱体积蒸馏水，再用5倍柱体积的40％乙醇以相同流速洗脱，收集洗脱液，洗脱液浓缩至适量体积，喷雾干燥，得葛根、山楂和红花的提取物密封保存

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方法进一步说明。

实施例1葛根、山楂和红花总黄酮的提取工艺实验

(1)使用乙醇回流提取法进行实验，采用L₉(3⁴)正交实验法考察乙醇回流提取葛根、山楂和红花总黄酮中乙醇浓度、乙醇用量(药材质量的倍数)、提取时间等因素的工艺参数，并采用紫外-可见分光光度法对提取物中总黄酮的含量进行测定，同时用高效液相法测定葛根素和羟基红花黄色素A的含量，并以此为指标进行比较分析。结果见表1，表2，表3，表4，表5。

表1试验因素水平表

表2L₉(3⁴)正交实验表

表3总黄酮量方差分析

表4葛根素量方差分析

表5羟基红花黄色素A量方差分析

正交试验结果表明(见表3，表4，)，影响因素最大的为提取时间，乙醇浓度、乙醇用量无明显影响，直观分析出最佳提取工艺为A₂B₃C₃.

表6验证试验结果

从羟基红花黄色素A方差分析(表5)看，各因素对羟基红花黄色素A的含量无显著性差异。直观分析出最佳提取工艺为A₂B₃C₃.综上所述，选定最合适的工艺条件为，70％乙醇，提取3次，提取时间(倍数)分别为2小时(10倍)，1小时(8倍)，1小时(6倍)。(2)验证试验：取葛根，山楂，红花饮片(葛根261份、山楂157份和红花91份)，共3份，按照优选提取工艺进行验证试验，验证试验结果如表6：

验证试验结果表明优选的提取工艺稳定可行。

实施例2葛根、山楂和红花总黄酮的大孔树脂纯化工艺实验

用前述优选提取条件提取得到的提取液进行如下实验：

(1)D-101树脂纯化工艺实验

①吸附条件优选实验

采用正交试验方法以上样药液浓度(以样品中所含有的原药材量计)、径高比及上样流速作为考察因数，应用L₉(3⁴)正交表安排试验，因素及水平安排见表7。对以上9组试验分别测定总黄酮含量，并进行评价。分析结果见表8，表9。

表7因素水平表

表8正交试验结果

表9方差分析

直观分析表明，3个因素对葛根，山楂和红花总黄酮在大孔吸附树脂上的吸附效率的影响程度依次为：上样浓度(A)＞上样流速(D)＞径高比(B)，方差分析表明，在葛根，山楂和红花总黄酮的吸附过程中，A因素有显著影响，综合考虑，优选组合为A₂B₁D₃。

②上样量考察

取0.1克/毫升样品溶液，加于20克D-101树脂柱上(径高比1∶7)，以1倍柱体积/小时的流速通过。每个流分收集10毫升，测定并计算流分中总黄酮的浓度。测定结果见图2。图中可以看出当上样量为70毫升时(约为3.5倍柱体积)开始明显泄漏，150毫升达到吸附饱和。综合考虑确定上样体积为70毫升(即生药∶树脂＝1∶3)。

③水洗量考察

取0.1克/毫升样品溶液70毫升，加于20克D101树脂柱上(径高比1∶7)，以1倍柱体积/小时的流速通过。再用蒸馏水以2倍柱体积/小时速度洗脱，每个流分收集10毫升，测定并计算流分中总黄酮量(见图3)和干膏重(见图4)。由图可知，在5倍柱体积后的水洗脱液中黄酮损失较大，所以确定水洗体积为5倍柱体积。

④乙醇洗脱浓度考察

另取20g树脂五份上柱，按以上条件进行吸附，5倍柱体积水冲洗后，分别以适量30％、40％、50％、60％、70％乙醇以2倍柱体积/小时的流速洗脱，测定洗脱液中总黄酮含量，计算洗脱率；挥干溶剂，将浸膏衡重，精密称定并计算总黄酮的含量，结果见表10

表10不同浓度洗脱液中总黄酮的量

综合考虑总黄酮纯度与转移率选用40％乙醇洗脱。

⑤洗脱速率考察

按上述条件进行动态吸附，以80％乙醇为洗脱剂，分别以2，3，4倍柱体积/小时的速度洗脱，测定乙醇洗脱物中总黄酮量并计算洗脱率，结果表明洗脱速率为3倍柱体积/小时时洗脱率最高。

⑥乙醇洗脱量考察

按上述条件进行动态吸附，以40％乙醇为洗脱剂进行洗脱，定量收集流出液并测定其中总黄酮浓度。结果见图5。

结果表明：用100毫升(约5倍柱体积)40％乙醇以2倍柱体积/小时流速可以完全洗脱20g树脂所吸附的黄酮类成分。

实施例3中试放大实验

称取山楂饮片14千克，70％乙醇回流提取3次，第一次用乙醇140升，回流提取2小时，第二次用乙醇112升，回流提取1小时，第三次用乙醇84升，分别回流提取1小时。合并3次提取液，回收乙醇至无醇味，放置过夜，次日用滤布滤除沉淀，稀释至每毫升含生药0.1克的溶液，备用。

将20千克药用级D101型大孔树脂用适量乙醇浸泡，湿法上柱，处理后备用。

提取药液分两次上样加入树脂柱，每次70升，上样流速为1倍柱体积/小时，上样后先用5倍柱体积的蒸馏水冲洗，再用5倍柱体积40％乙醇以3倍柱体积/小时流速洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩至小体积(密度约为1.05克/毫升)，喷雾干燥(喷雾干燥器进风口温度为170℃，出风口温度为85℃，雾化盘转速为20000转/分钟)。收集干燥提取物，封口，放冷，称重，置干燥处保存。采用紫外-可见分光光度法测定提取物中总黄酮的含量，计算转移率(转移率＝提取物中总黄酮的含量/原药材中总黄酮的含量×100％)和收膏率(收膏率＝提取物总质量/原药材总质量×100％)。试验结果见表11。

表11中试实验结果

三批中试放大研究结果表明：其山楂总黄酮转移率达84.23％，提取物中总黄酮含量79.27％。表明本研究的工艺参数可行，工艺条件稳定，可望过渡到产业化生产。