喷雾流行性感冒疫苗组合物及其制备方法

摘要

本发明涉及一种喷雾流行性感冒疫苗组合物的制备方法，所述的组合物含有流感病毒抗原以及药物可接受的载体，所述载体选自：干扰素、离子交换树脂、人血白蛋白或磷酸盐缓冲液。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种喷雾流行性感冒疫苗组合物的制备方法，属于生物药物制剂领域。

背景技术：

流行性感冒简称流感(influenza)，主要是由甲(A)、乙(B)二型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染疾病。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，乙型流感病毒常常引起流感局部爆发，不引起世界性流感大流行。目前临床上仍缺乏有效的药物对流感患者进行治疗，流感病毒疫苗是防止流感疾病发生和流行最有效的一种手段。

流感病毒属正粘病毒科(Orthomyxovindae)、流感病毒属。典型的流感病毒颗粒为球型，直径80～120nm。流感病毒基因组是分多节段的单链、负链的RNA基因组，由相对分子质量不等的8个节段组成，丙型7个。易发生基因重配。其中甲型流感病毒抗原经常发生变异。其毒粒表面有血凝素(HA)蛋白、神经氨酸酶(NA)和M2三种结构蛋白，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)这两种蛋白的变化是流感病毒抗原发生抗原漂移的主要原因。如果抗原HA和NA中氨基酸序列出现一系列的点突变，使NA和HA抗原决定簇发生某些改变，可引起中、小型流行，称抗原漂移；如果抗原变异幅度较大，形成一个新的亚型，称抗原转变，常常引起较大的流行，甚至引起世界流感大流行。核蛋白(NP)是可溶性蛋白，其抗原性稳定。膜蛋白(MP)是毒粒的主要蛋白，也是特异性抗原，它们是流感病毒分型的主要依据，但它们的抗体不能中和流感病毒，所以没有保护作用。由于流感病毒经常发生变异，因此人的一生中要经历多次不同型、亚型和变种的病毒反复感染。流感病毒的变异产生了新的流行毒株，所以疫苗的毒株也必须改变，来应对新的流行毒株。为此，WHO的专家委员会每年二月推荐在北半球的冬天(11月～下年4月)流感流行的病毒毒株，每年九月推荐在南半球的下一个冬天(5月～10月)流感流行的病毒毒株。目前流感疫苗包括三个主要亚型：A(H1N1)，A(H3N2)和B型。

1937年鸡胚培养流感病毒获得成功，使大量生产流感疫苗成为可能。流感全病毒灭活疫苗于1941年在美国首次被批准使用，并证实有效。1945年在美国被广泛使用，这种收获的鸡胚尿囊液经红细胞吸附和释放有限的纯化疫苗，属早期粗制疫苗，接种人体后局部和全身的不良反应都很强。上世纪60年代末，超速离心机和层析色谱技术的应用，大大提高了病毒纯化质量，制成了全病毒灭活疫苗。它包含病毒所有蛋白、脂质和核酸。该疫苗的制作方法是将9～11日受精鸡胚尿囊腔接种流感病毒，培养、收获、纯化和灭活而得。此类疫苗免疫效果好，但儿童使用时出现了不良反应。其主要原因之一是由于毒粒本身的细胞毒性造成的。1968年在美国首次被批准使用裂解纯化流感疫苗。流感裂解疫苗含有血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)表面抗原和其他抗原。先提纯病毒，后加入裂解剂，如乙醚、3-N-丁基磷酸盐(tri-N-butylphosphate)、聚山梨酸酯80(polysorbate80)、脱氧胆酸钠(deoxycholate sodium)、三硝基甲苯(Tritonx-100)等裂解剂。去除病毒的脂质后制得，病毒的胞膜已被破坏，从而得到具有高度免疫原性的病毒蛋白混合物。虽然能够获得高度免疫原性的病毒蛋白混合物，但始终是注射剂型，注射接种免疫副反应较重，不利于大范围尤其是儿童、老人和体弱者接种，而鼻腔喷雾接种具有良好的耐受性，较低的副反应，可以用于儿童、成人和老年人，而且使用方便，可以自行接种，可以大面积人群中应用，是目前流感疫苗改进的方向。

发明内容：

本发明目的是提供一种喷雾流行性感冒疫苗组合物及其制备方法。

本发明提供一种流行性感冒疫苗组合物，该疫苗是喷雾剂型，所述的组合物含有流感病毒抗原以及药物可接受的载体。所述载体选自：干扰素、离子交换树脂、人血白蛋白或磷酸盐缓冲液。所述的干扰素是IFN-α、IFN-β或IFN-γ；离子交换树脂是聚苯乙烯磺酸钠，所述的磷酸盐缓冲液是pH是7.0的磷酸盐缓冲液。所述的流感病毒抗原为全病毒抗原、裂解病毒抗原或亚单位抗原。

本发明优选的配方组成如下：

  流感病毒抗原  (纯化)  60％(体积百分比)

或

  流感病毒抗原  (纯化)  配成2.15mg/ml(1份)  聚苯乙烯磺酸钠  配成0.5g/ml(8份)。  水  适量

其中所述聚苯乙烯磺酸钠粒径为20～40μm。

本发明的制备方法包括以下步骤：

(1)获取细胞

(2)细胞制备

(3)接种病毒

(4)收获病毒液

(5)病毒液的灭活

(6)澄清过滤、浓缩

(7)纯化

(8)裂解再纯化

(9)过滤去除Triton x-100

(10)配制

本发明使用的细胞为肾细胞，包括地鼠肾细胞和Vero细胞，优选Vero细胞，首先建立Vero细胞工作库，并对细胞库进行全面检定，合格后方可作为细胞库。在制备流感疫苗之前，需先进行细胞的复苏、培养和扩增，以达到生产批量的需要。各种用于制备疫苗的哺乳动物细胞均为附着依赖性细胞，细胞在一定的载体上生长，本工艺中细胞的培养方式为转瓶培养。培养过程中，细胞分种率根据生产批量的需要确定，当细胞长成致密单层后，即可接种流感病毒，各个型别分别接种，甲型46小时左右开始收获，乙型70小时左右开始收获，收获的病毒液血凝效价可达1∶256。

收获的病毒液用甲醛溶液灭活得到单型病毒收获液。收获液经合并后为单价病毒合并液。

单价病毒合并液体需要进行浓缩提纯制备成疫苗制品，本工艺中选用工艺采用GE公司切向流过滤系统对病毒收获液进行澄清，病毒浓缩应用750KD分子量超滤柱超滤浓缩，使纯化的病毒纯度更高，提高了疫苗的有效性和降低了副反应发生，Sepharose6FF柱层析对流感浓缩液进行纯化，裂解纯化采用Triton x-100对纯化流感病毒进行裂解，去除Triton x-100采用分子量为10000的过滤器，进行过滤去除裂解剂，经过四步的澄清、浓缩、纯化、裂解纯化，疫苗总蛋白含量减少了约99％以上。

本发明采用GE公司切向流过滤系统对病毒收获液进行澄清，替代了常规离心法。优点：操作简单，单位时间处理量是离心法的2～3倍，可达到澄清除菌双重效果。由于收获后立即除菌，可最大程度减少热源质。病毒浓缩应用750KD分子量超滤柱，替代了目前国内普遍使用的100KD和300KD超滤膜包。超滤同一批病毒收获液工期可缩短1～2倍，并且得到的浓缩液去除了大部分杂蛋白，为纯化提供了前期保证，延长了纯化用凝胶寿命。使纯化的病毒纯度更高，提高了疫苗的有效性和降低了副反应发生。我们用柱层析纯化法代替梯度密度离心法纯化法，更适合工业化大生产。采用Triton x-100对纯化流感病毒进行裂解，裂解效果要优于去氧胆酸钠。通过超滤法去除裂解剂，比以往梯度密度离心法去除裂解剂的方法具有操作简单、成本降低、节约能源、质量超过国内同类产品等优点。

本工艺中配制喷雾流感疫苗通过加入聚苯乙烯磺酸钠和流感抗原配制喷雾流感疫苗。

另一种方法是干扰素、流感抗原、人血白蛋白、PBS磷酸盐缓冲液后配制成喷雾流感疫苗。

两种的配制方法中各组分不同浓度是经多次研究的最佳组合，是经过筛选得到的，可以产生最佳的免疫效果。以下通过对比试验证明本发明的效果：

免疫小鼠

用本工艺制备的喷雾流感疫苗实施例1和实施例2滴鼻8只雌性成年BALB/c小鼠(6～8周)鼻孔，每孔50微升，阳性对照组肌肉注射100微升8只雌性成年BALB/c小鼠(6～8周)。实施例1和实施例2每只小鼠等量鼻腔免疫二次，间隔14天，对照组肌肉注射只免疫一次。

阴性对照组采用PBS磷酸盐缓冲液。

取样方法：

于眼眶采血、离心、分离血清，同组血清混合一起，4℃备用。

HI法测定抗体效价

在血凝板中，用25μl生理盐水倍比稀释待检血清，加入等量的四个血凝单位的病毒，轻轻摇匀后置室温60min，加入25μll1％的红细胞悬液，再摇匀置室温30～60min后观察结果。

结果

不同毒株疫苗的抗体效价

经红细胞凝集抑制试验(HI)法检测抗体，两种配方的喷雾流感疫苗抗原性与阳性对照疫苗相似。

制品对动物保护性研究

将用实施例1和实施例2疫苗分别滴鼻免疫11～13g小白鼠，免疫21天后鼻腔攻击甲1、甲3和乙型流感病毒，每个鼻孔感染10^-1～10^-6病毒0.05ml。然后每天观察，感染24小时内死亡的为非特异性死亡，不于统计。观察14天，同时设立对照，不接种疫苗，21天后直接攻毒。用Reed和Muench公式计算LD50，测定保护指数。

将小白鼠分成4组，每批90只，对照组15只，雌雄各半。滴鼻免疫小白鼠，每只免疫50微升疫苗，观察21天。攻击流感病毒甲1、甲3和乙型，取10^-1～10^-6病毒稀释度，每个稀释度鼻腔感染5只小白鼠，小白鼠每个鼻孔感染流感病毒0.05ml，感染24小时内死亡的为非特异性死亡，观察14天，解剖取气管，研磨直接做血凝试验。用Reed和Muench公式计算LD50，测定保护指数。

试验结果表明疫苗对小白鼠具有保护作用，保护指数均在100以上。结果如下：

喷雾流感疫苗对小白鼠保护情况

按照本工艺制备的喷雾流感疫苗滴鼻免疫小白鼠后，能够有效的使机体产生免疫应答，对病毒的侵害具有保护作用。

按照本工艺进行制备喷雾流感疫苗，配方独特，不用注射，无刺激性，质量容易控制，产品稳定，并且有好的耐受性，低的副反应，可以用于儿童、成人和老年人，而且使用方便，可以自行接种，可以大面积人群中应用。

具体实施方式：

实施例1、

按照本工艺中的制备方法进行流感抗原制备，也可从市场上购买得到，取流感抗原后进行配制。取聚苯乙烯磺酸钠，聚苯乙烯磺酸钠是由国家食品药品监督管理局批准的药品，配成水溶液，使其含量为0.5g/ml，取流感抗原配成水溶液，使其含量为2.15mmg/ml，按照8∶1进行进行混合，搅拌1小时制成混合水性悬浊液。将该悬浊液以每次0.6ml的量在人体鼻腔内喷雾给药。

实施例2：

应用本工艺的制备方法制备流感抗原，也可从市场上购买得到，取制备好的流感抗原配制成600ml，加入干扰素10^4.5单位/L、人血白蛋白25ml、其余为PBS磷酸盐缓冲液混合后制成1000ml喷雾流感疫苗。