一种HPCE指纹图谱鉴别葛根药材的方法

摘要

本发明提供了一种HPCE指纹图谱鉴别葛根药材的方法，该方法为：取过3号筛的待检药材粉末，加入400～600倍30％乙醇，称重，80℃超声30min，放冷后再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液，按以下步骤进行高效毛细管电泳：在压力为137.9kpa的条件下5秒钟时间内完成进样；接着在温度为20℃的条件下于由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，得到所测药材的HPCE指纹图谱，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv；当所得到的指纹图谱具有如摘要附图所示的16个特征峰时，即被检药材为葛根药材。

说明书

技术领域

本发明涉及中药材的鉴别方法，具体是采用HPCE法建立葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)指纹图谱的鉴别方法。

背景技术

葛根是豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)的干燥根径，始载于我国汉代《神农本草经》，列为中品，是常用的传统中药，具解肌退热，生津，透疹，升阳止泻之功效，临床常用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢，泄泻，以及高血压颈项强痛等症状。葛根在我国分布较广泛，资源很丰富。2005年以前，我国药典收载的葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Wild.)Ohwi或甘葛藤Pueraria thomsonill Benth.的干燥根。2005年版中国药典开始将野葛和粉葛分开，并规定含量，野葛中葛根素含量不得少于2.4％；粉葛中葛根素的含量不得少于0.30％。药典中鉴定葛根的方法是外形观察和采用薄层色谱法定性检测药材中的葛根素，用高效液相色谱法检测药材中葛根素的含量。

中药色谱指纹图谱方法是近年来研究较多的一种中药鉴别和质量控制方法，该方法在实现物质群体整体控制方面具有明显的优势，并得到了国际社会的认可。英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用及芳香植物学会均接受并收集了指纹图谱的质控方法。用“中药色谱指纹图谱方法”鉴别中药的真伪，控制其质量更能客观地反映中药物质基础的整体观，是更为科学、有效的质控方法。

蔡光先等报道了5批不同地区的商品葛根30％乙醇超声提取物的HPLC指纹图谱，色谱条件是：色谱柱为大连依利特公司Hypersil BDS C18柱(4.6mm×200mm，5μm)；流动相A(乙腈)％B(水)％：0-7min，2-98％；7-60min，26-74％。柱温为25℃；流速为1.0mL·min-1；检测波长为250nm，得到的指纹图谱共有峰共11个。该方法用于鉴别葛根虽然具有供试品制备简单、精密度和重复性好等优点，但存在分析时间长、流动相有机溶剂用量比例大、出峰信息量少等不足(蔡光先，李顺祥，蒋炜.葛根超微饮片的HPLC指纹图谱研究，中南药学，2005：3(2)：67-70.)。

陈斌等等报道了10批不同地区的葛根30％乙醇热回流提取物的HPLC指纹图谱，色谱条件色谱柱为Agilent ZORBAX 80A Extend-C18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为75％水溶液与25％甲醇洗脱；流速1.0ml·min-1；柱温25℃；检测波长250nm；参比波长360nm；分析时间30min；供试品及参照物进样量各20μl，得到6个共有峰。该方法用于鉴别葛根虽然具有分析时间短、精密度和重复性好等优点，但存在流动相有机溶剂用量比例大、出峰信息量非常少等不足(陈斌，刘训红，蔡宝昌.葛根高效液相色谱指纹图谱的研究.时珍国医国药，2005，16(5)：384-385)。

陈士林等采用HPLC法研究报道了13批不同地区(10批为安徽霍山葛根基地产品)的葛根30％乙醇热回流提取物的指纹图谱，色谱条件：色谱柱为Zorbax XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为甲醇-水，梯度洗脱：0-10min甲醇由25％升为30％，20-50min甲醇由30％升为80％，50-60min甲醇由80％升为100％；流速为0.5mL/min；检测波长为250nm；进样量为20μL，得到15个共有峰。该方法用于鉴别葛根虽然具有出峰信息量多、精密度和重复性好等优点，但存在流动相有机溶剂用量比例大、分析时间长等不足(陈士林，陈四保，杨大坚等.葛根高效液相指纹图谱的研究.中草药，2003，34(7)：661-663)。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴别葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)药材的方法。

本发明实现上述目的的技术方案是：

一种HPCE指纹图谱鉴别葛根药材的方法，该方法由以下步骤组成：

取过3号筛的待检药材粉末，加入400-600倍30％乙醇，称重，80℃超声30min，放冷后再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液，按以下步骤进行高效毛细管电泳分析：在压力为137.9kpa的条件下5秒钟时间内完成进样；接着在温度为20℃的条件下于由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，得到所测药材的HPCE指纹图谱，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv；当所得到的指纹图谱具有以下特征峰时，即被检药材为葛根药材：

峰1：迁移时间为9.84min±0.22min，相对峰面积为3.59％±0.80％；峰2：迁移时间为10.12min±0.28min，相对峰面积为0.47％±0.14％；峰3：迁移时间为10.26min±0.29min，相对峰面积为4.32％±1.24％；峰4：迁移时间为10.43min±0.31min，相对峰面积为0.51％±0.13％；峰5：迁移时间为13.04min±0.39min，相对峰面积为2.16％±0.62％；峰6：迁移时间为13.25min±0.43min，相对峰面积为7.01％±1.78％；峰7：迁移时间为13.73min，相对峰面积为0.77％±0.23；峰8：迁移时间为14.22min±0.51min，相对峰面积为2.63％±0.58％；峰9：迁移时间为14.39min±0.55min，相对峰面积为2.47％±0.66％；峰10：迁移时间14.94min±0.59min，相对峰面积为55.88％±14.58％；峰11：迁移时间为15.07min±0.62min，相对峰面积为3.00％±0.77％；峰12：迁移时间为15.75min±0.66min，相对峰面积为3.59％±0.73％；峰13：迁移时间为17.93min±0.79min，相对峰面积为2.73％±0.62％；峰14：迁移时间为18.84min±0.86min，相对峰面积为5.8％±1.04％；峰15：迁移时间为19.04min±0.91min，相对峰面积为3.63％±0.74％；峰16：迁移时间为21.69min±1.06min，相对峰面积为1.45％±0.42％，其中峰10和峰13分别为葛根素和大豆苷元的特征峰。

本发明方法所述的指纹图谱中的16个特征峰是将11批分别来自山东、河南、安徽(2批)、吉林、湖北、湖南、广东、广西、江西、四川各个产区的葛根按照相同条件提取和高效毛细管电泳分离所获得的指纹图谱中共有的特征峰，能较全面反映葛根的成分组成特点，可用于鉴别葛根。本发明人还发现在所述的指纹图谱中，葛根的重要的有效成分葛根素和大豆苷元分别占总峰面积的55.88％±14.58％和2.73％±0.62％，因此，本领域的技术人员可以根据这一特征利用本发明方法检测葛根的品质。

本发明方法所建立的葛根指纹图谱峰分离良好，易于辨认，尤其主峰葛根素与前后峰分离良好，有利于指标成分的定量分析。此外，本发明方法还具有样品制备方法简便、易于掌握；所需分析时间短，出峰信息量多；有机溶剂的用量少，经济环保等优点。

附图说明

图1是葛根素对照品的高效毛细管电泳图谱。

图2是大豆苷元对照品的高效毛细管电泳图谱。

图3是葛根药材高效毛细管电泳标准指纹图谱。

图4是11批来自全国不同产区葛根的高效毛细管电泳指纹图谱，其中S1：山东崂山采集，S2：购于广州健禾饮片公司(标注产地河南)，S3-S4：购自安徽毫州，S5：购自吉林长春，S6：购自湖北武汉，S7：购自湖南长沙，S8：广东清远采集，S9：购自广西南宁，S10：购自江西南昌，S11：购自四川成都。

图5是山东崂山葛根样品高效毛细管电泳图谱，色谱峰所标数字依次代表峰号、迁移时间、峰面积百分率。

图6广州市售粉葛样品高效毛细管电泳图谱，色谱峰所标数字依次代表峰号、迁移时间、峰面积百分率。

图7山东葛根指纹图谱与广州市售粉葛图谱相似性比较，其中S1表示山东葛根图谱；S2表示粉葛图谱。

具体实施方式

例1本发明方法标准图谱的构建及特征峰的确定

1仪器、样品、试药：

1.1仪器：P/ACE^TM MDQ毛细管电泳系统(美国，Beckman)，二极管阵列检测器，毛细管为eCAP^TM(75μm×60cm，有效长度50cm)。采用国家药典委员会指定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱分析。

1.2样品：11批葛根样品，分别来自山东、河南、安徽(2批)、吉林、湖北、湖南、广东、广西、江西、四川等药材公司。经鉴定均为葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)的干燥根径。

1.3试药：葛根素、大豆苷元对照品(中国药品生物制品检定所提供)，色谱分析用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2方法与结果

2.1将葛根素和大豆苷元分别按下述方法进行高效毛细管电泳分析：将葛根素、大豆苷元溶于甲醇配制成一定浓度的对照品溶液，分别进行高效毛细管电泳：采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，进样时间为5秒，接着在由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为20℃，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得葛根素和大豆苷元的标准电泳图，如图1和图2所示。

2.2将全国各产地的葛根分别按下述方法制备供试品溶液并进行高效毛细管电泳分析：

将来自山东的葛根分别磨成粉，过3号筛，称取0.1g，置带塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，称定重量，80℃超声30min，放冷，再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液进行高效毛细管电泳：采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，进样时间为5秒，接着在由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为20℃，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得所测药材的指纹图谱；其余各产地的葛根同样按上述方法制备指纹图谱，所得图谱如图3所示。

经过统计，11批葛根的共有峰为16个，迁移时间及峰面积百分率见表1，得标准指纹图谱，如图4所示，与葛根素和大豆苷元的标准指纹图谱比较，确定迁移时间为14.94min，RSD＝3.97％和17.93min，RSD＝4.39％的特征峰分别是葛根素和大豆苷元，且经统计发现两者的峰面积均约占总峰面积的55.88％和2.73％。

表1：葛根药材指纹图谱特征峰迁移时间及峰面积百分率(n＝11)

  峰号  峰1  峰2  峰3  峰4  峰5  峰6  峰7  峰8  A(min)  9.84  10.12  10.26  10.43  13.04  13.25  13.73  14.22  RSD(％)  2.24  2.78  2.85  2.95  3.01  3.24  3.43  3.59  B(％)  3.59  0.47  4.32  0.51  2.16  7.01  0.77  2.63  RSD(％)  22.34  28.97  28.62  25.23  28.65  25.35  29.30  22.11  峰号  峰9  峰10  峰11  峰12  峰13  峰14  峰15  峰16  A(min)  14.39  14.94  15.07  15.75  17.93  18.84  19.04  21.69  RSD(％)  3.86  3.97  4.09  4.21  4.39  4.57  4.76  4.88  B(％)  2.47  55.88  3.00  3.59  2.73  5.80  3.63  1.45  RSD(％)  26.87  14.58  25.67  20.47  22.69  17.99  20.31  29.19

注：其中A表示峰迁移时间(min)；B代表峰峰面积百分率(％)

例2葛根的鉴定以及本发明方法的精密度、稳定性和重现性试验1仪器、样品、试药：

1.1仪器：P/ACE^TM MDQ毛细管电泳系统(美国，Beckman)，二极管阵列检测器，毛细管为eCAP^TM(75μm×60cm，有效长度50cm)。采用国家药典委员会指定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱分析。

1.2样品：产于山东崂山的葛根

2方法

2.1鉴别

将葛根分别按下述方法进行高效毛细管电泳分析：称取待测药材粉末(过3号筛)0.8g，置带塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，称定重量，80℃超声30min，放冷，再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液进行高效毛细管电泳：采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，进样时间为5秒，接着在由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为20℃，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得所测药材的指纹图谱。该批葛根的指纹图谱如图5所示，具有迁移时间分别为9.69min，9.97min，10.11min，10.28min，12.89min，13.10min，13.58min，14.07min，14.24min，14.79min，14.92min，15.60min，17.78min，18.69min，18.89min，21.54min；峰面积百分率为3.36％，0.40％，4.32％，0.39％，2.24％，7.14％，0.97％，2.68％，2.61％，55.42％，3.25％，2.16％，3.43％，6.08％，3.85％，1.50％的特征峰，判断为葛根，判断结果与实际相符。

2.2本发明方法的精密度、稳定性和重现性试验

2.2.1本发明方法的精密度试验：按2.1方法制备葛根供试品溶液，并按2.1电泳条件连续进样5次，将所得色谱图进行相似度比较，5次进样的相似度(中位数)结果表明相似度均在0.99上，说明精密度良好。

2.2.2本发明方法的稳定性试验：按2.1方法制备葛根供试品溶液，并按2.1电泳条件，分别在0、6、12、24、36h进样分析，将所得色谱图进行相似度(中位数)比较，结果表明相似度均在0.99以上，说明样品在试验时间内稳定性好。

2.2.3本发明方法的重现性试验：取同一批葛根6份，分别按2.1方法制备供试品溶液，并按2.1电泳条件，将所得色谱图进行相似度(中位数)比较，结果表明相似度均在0.99以上，说明本方法重现性好。

例3对比例应用

1仪器、样品、试药：

1.1仪器：P/ACE^TM MDQ毛细管电泳系统(美国，Beckman)，二极管阵列检测器，毛细管为eCAP^TM(75μm×60cm，有效长度50cm)。采用国家药典委员会指定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱分析。

1.2样品：来自广州市售粉葛

2.1鉴别

将市售粉葛分别按下述方法进行高效毛细管电泳分析：精密称取粉葛粗粉0.8g，置带塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇50ml，称定重量，80℃超声30min，放冷，再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液进行高效毛细管电泳：采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，进样时间为5秒，接着在由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为20℃，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得所测药材的指纹图谱，见图9。

表2  山东葛根HPCE指纹图谱与广州市售粉葛图谱

  类别  峰1  峰2  峰3  峰4  峰5  峰6  峰7  峰8  S1min)  9.69  9.97  10.11  10.28  12.89  13.10  13.58  14.07  S2(min)  9.90  10.06  12.94  13.89  S1(％)  3.36  0.4  4.32  0.39  2.24  7.14  0.97  2.68  S2(％)  1.35  5.25  5.44  2.55  类别  峰9  峰10  峰11  峰12  峰13  峰14  峰15  峰16  S1min)  14.24  14.79  14.92  15.60  17.78  18.69  18.89  21.54  S2(min)  14.59  14.76  15.70  17.64  S1(％)  2.61  55.42  3.25  2.16  3.43  6.08  3.85  1.50  S2(％)  52.06  3.14  23.83  6.37

注：S1代表葛根指纹图谱，S1(min)迁移时间S1(％)峰面积百分率

S2代表广州市售粉葛指纹图谱，S2(min)迁移时间S2(％)峰面积百分率

从表2可以看出，广州市售粉葛与葛根只有8个共有峰，可见本发明葛根的HPCE指纹图谱是葛根特有的，本发明所述的方法可用于葛根的鉴定。