法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-09-10
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N33/68 授权公告日:20130327 终止日期:20130717 申请日:20060717
专利权的终止
2013-03-27
授权
授权
2008-09-17
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-07-23
公开
公开
本发明涉及用于鉴定抑制蛋白质的折叠，从而抑制其生物学功能 的抑制剂的方法，尤其是用于鉴定蛋白质折叠、具有高度选择性并且 不产生抗性的肽类抑制剂的方法。
发明背景
蛋白质起主要生理学作用的事实是本领域公知的。人们已经在用 蛋白质作为治疗剂，催化剂和具有特定性能的适宜材料方面作出了许 多努力。
许多疾病起源于导致蛋白质丧失功能性的蛋白质突变。在某些情 况下，例如，由蛋白质发挥的催化活性可能受损，从而导致代谢途径 发生改变(例如，苯丙酮尿症)。在其它一些情况下，蛋白质本身的 结构特性可能受到影响，以致于导致物理功能性的丧失(例如，肌营 养不良症)。Creutzfeld-Jakob病和其它传染性脑病可能由蛋白质的改 变其形状和形成聚合物的结构修饰引起[1]。类似地，疾病还可能由蛋 白质逐渐转化为聚合性β-折叠的长链，并沉淀，形成原纤维的淀粉样 变引起[2]。
已知有许多癌症的发生是由于蛋白质的突变。在这个意义上，已 知有约50％的人类癌症由主要降低其稳定性的肿瘤抑制因子P53的突 变导致[3]。
酶和受体是恢复功能，或者破坏传染原或癌症的药物的常见靶点。 蛋白质科学的终极目标是能根据蛋白质的氨基酸序列预测其结构和活 性(所谓的“折叠问题”)，及抑制该活性[4，5]。有了这样的成果，设 计和合成新的催化剂，材料及药理活性剂，尤其是适于抑制酶活性的 药物将成为可能。
这些药物可能显示的主要特性是特异性(即，无毒)和有效性。 通常，这可以通过将酶的活性位点加帽(竞争性抑制)，或者通过结 合到该蛋白质的某些其它区域/部分上，从而引起使该酶不适于与底物 结合的结构变化(变构抑制)来实现。
为了实现这些目标中的任何一个，必须优化配体和蛋白质之间的 结合。由于不仅需要计算酶和底物或其它配体间的能，而且还需要计 算它们与水的相互作用能和反应期间熵的变化这样一个事实，因此这 是个相当艰巨费时的问题。净结合能是两个大数之间的小差异。
在靶点为显示高突变率的病毒蛋白质的情况下，出现的更复杂的 问题是常常伴随着众所周知的抗性的发展。因此，策划新的策略，使 设计比已知的以活性位点为中心的设计更有效更经济的蛋白质抑制剂 成为可能，以及产生以阻断酶与其底物间的相互作用为目的，不产生 抗性的策略是至关重要的。
许多实验性[6-8，38，41]和理论性[9，10]的研究显示球状单结构域蛋 白质(即，长度为N，包括60-150个氨基酸的蛋白质[28])通过分级 机制(hierarchical mechanism)折叠，所述分级机制即，由少数连续氨 基酸组成小单元，由小单元构成大单元，大单元再依次构成更大的单 元，最后形成完整蛋白质。
对天然态形成前氨基酸链段的折叠和缔合的实验性研究鉴定了初 期折叠事件中的部分类天然结构[39]。这些结构要素通常被称为折叠结 构域或折叠子[9]。这些单元的操作定义是：“蛋白质从变性态开始折 叠形成的最初可观察的类天然结构的三维结构”。这些结构域内的突 变可以严重限制正确折叠蛋白质的形成[10]。
模型计算[11，12]显示，小的单体单结构域蛋白质的折叠从未折叠 构象开始，在依次发生下列分级事件后进行：1)形成少数(2-4个) 总体上含有所述蛋白质的约20％至约30％的氨基酸(因此各含有该蛋 白质的5％至15％的氨基酸)的局部基本结构(通常称为LES)，所述 LES通过少数沿所述多肽链接近的高度保守的强相互作用(“热”) 疏水氨基酸(小于所述蛋白质氨基酸的10％)而得到稳定；2)LES在 (后临界)折叠核对接(docking)[13]，即形成使系统处于整个折叠过 程的主要自由能障之上的天然接触的最小集合；3)在折叠核形成后将 剩余的氨基酸立刻松弛在天然结构上。人们发现，稳定LES的“热” 点对(非保守性)点突变非常敏感。由于大多数蛋白质稳定能集中在 这些位点，因此其中一个或两个发生突变的可能性具有较高的使折叠 构象失稳的概率。用模型计算的LES鉴定前段的折叠结构域是正常的。
同样的模型表明，利用其序列与蛋白质的LES的序列相同的肽(称 为p-LES)可能使该蛋白质的天然构象失稳[14]。
这些折叠抑制剂相对于常规折叠抑制剂而言，具有两个重要优势。 第一，其分子结构直接由靶蛋白质提示。人们不必设计或优化任何事 物，只需找到靶蛋白质的LES即可。由于LES的设计已经由无数次病 毒(或表达该蛋白质的有机体)的增殖，以识别并彼此剧烈地相互作 用，使该蛋白质快速折叠并避免与其它蛋白质发生聚集的演化而完成， 所得抑制剂有望显示较小的毒性。第二，其不太可能由于逃逸突变而 无效。实际上，p-LES遵循使折叠核稳定的相同范例与该靶蛋白质的互 补性LES结合，稳定化由蛋白质的“热”氨基酸控制[15，16]。
因此，逃逸突变必须包括那些为LES的稳定和对接所必需的“热” 氨基酸上的突变。这些突变通常导致蛋白质变性。换言之，不妨碍蛋 白质折叠成其天然生物活性状态的结构突变不能阻止局部基本结构向 折叠核的对接或p-LES的抑制作用。通过LES失稳或其对接而阻碍折 叠核形成的突变原则上避免了p-LES的作用，但其将由于突变蛋白质 不能折叠而不被表达。
发明概述
总而言之，本发明涉及使球状单域蛋白质(这些蛋白质的典型长 度为60-150)的LES个体化的简单，经济且(基本)无误差的方法。 因此，本发明涉及不太可能产生抗性的这些蛋白质的折叠的高度特异 性强效抑制剂(p-LES肽)的个体化。
由于球状多结构域蛋白质通常被构建成序列单元(结构域，区组 [17-24]或模块[25，26])的组合，对于真核生物，所述序列单元的特征 长度为约125个氨基酸，对于原核生物，特征长度为约150个氨基酸， 序列单元如单结构域蛋白质那样折叠，因此本发明还涉及用于鉴定蛋 白质折叠的肽抑制剂而不管蛋白质的大小或模块性的方法及三态多聚 体的各个单体[29，30]。
在下文中，我们在球状蛋白质或属于三态多聚体的单体的序列单 元的框架下对本发明进行了解释。
发明目的
本发明因此涉及用于鉴定在不诱导逃逸突变的条件下抑制蛋白质 折叠，从而抑制其特定生物活性的肽类抑制剂的方法。
因此，本发明的第一个目的是用于鉴定含N个氨基酸的蛋白质的 折叠的肽抑制剂的方法，该方法包括：
a)设计M个长度为L的肽，其各自显示与靶蛋白质的某区段同 一的序列，以覆盖全部蛋白质，不同肽之间允许有一些重叠。L通常包 含约10个氨基酸，优选在约4至约20之间变动。因此，M的范围为 约5至约50，通常为约20。
b)单个或集群制备M个所设计的肽。
c)制备M份各自含有适当摩尔比的所考虑的蛋白质和一种肽的 溶液，并在37℃孵育各溶液。
d)利用标准技术评价上述溶液中肽的抑制效力或未折叠度或两 者，以鉴定对所述蛋白质赋予抑制活性的肽。
本发明的方法特别有优势，因为其使得人们可以用可靠且非常简 单的方法从M个特意设计和制备的肽中鉴定出所考虑的蛋白质具有抑 制活性，甚至最高抑制活性的肽。
发明详述
根据本发明，除非另有说明，术语“肽”表示通常包括大约10个 氨基酸的短肽链。优选该肽包括L个氨基酸，其中L在约4至约20之 间变动。该“肽”的序列除非另有说明，与所述蛋白质的同等长度的 区段相同。
此外，“肽类抑制剂”是指阻断靶蛋白质的折叠，从而阻断其特 定生物学功能的肽。即，该抑制剂具有与所述蛋白质的LES基本同一 的序列，因此也可以被称为p-LES[14]。
“LES”(局部基本结构)是指在折叠过程中形成得非常早的第 一天然结构[11，12](在文献[9，10，38]中也被称为折叠子或折叠结构域)。 这些结构通过强相互作用，通常疏水的高度保守(“热”)氨基酸得 到稳定。人们可以区别结构良好的所谓的闭合LES和低结构化的所谓 的开放LES[15]。当在溶剂中分离时，后一种类型的LES不显示任何 (重要)天然接触。相反地，当分离时，闭合LES却显示出了同样在 (后临界)折叠核中起重要作用的天然接触[13]。
(后临界)折叠核“FN”是指为克服整个折叠过程中蛋白所遇到 的最高自由能障所需要的天然接触的最小集合[13]。这些接触大部分由 LES的对接引起。该事件基本上由闭合LES控制。“热”氨基酸是指 在蛋白质的折叠中起主要作用的氨基酸。这些氨基酸的非保守性突变 通常导致蛋白质变性[16]。
根据本发明的方法的步骤(a)及其任何变体，M个长度为L的肽 可以这样设计，即显示与所考虑的蛋白质的某区段同一的序列。M和L 的值的选择应能覆盖所述蛋白质的全部氨基酸序列，并且允许有一些 重叠。通常L是10个氨基酸(对于长度为N的单结构域蛋白质，相当 于氨基酸总数N的约十分之一，即，L＝N/10)，优选在约4至约20 之间变动。因此，M的范围为约5至约50，通常为约20。
仅作为非限制性的解释性的例子，本发明的方法可以通过设计19 个氨基酸链长均为12个氨基酸的肽(即，M等于19)，用于对蛋白质， 例如，包括120个氨基酸的蛋白质具有抑制活性的肽的鉴定。
由上所述，当19个长度均为12个氨基酸的肽显示与所述蛋白质 的指定区段相同的序列，并且必须覆盖全部蛋白质序列时，对本领域 技术人员而言显而易见的是将存在着具有重叠区段的肽(各相邻肽之 间的重叠在该特定例子中约为50％)。
通常，本发明的方法的步骤(a)可以提供用于系统地设计指定的 M个肽，通过从氨基酸1和下一个氨基酸开始，逐渐覆盖全部蛋白质 (因此不同肽之间允许有约50％至约70％的重叠；常见下述实施例4)。
或者，所述M个肽可以通过从与接近氮和碳末端的蛋白质区段及 蛋白质中心相应的区域开始进行设计，并且允许不同肽之间的再次重 叠。
步骤(b)包括根据本领域公知的方法制备M个肽。所述方法可 以包括，例如，任何已知的用于合成肽的合成方法，或者，可能按照 已知方法通过在适当的位点切割蛋白质而直接由蛋白质获得它们。
通过将步骤(b)中所制备的任何一种肽与靶蛋白质一起溶解在任 何适宜的溶剂中而执行步骤(c)。肽与蛋白质的摩尔比可以在1∶1-10∶1 (肽/蛋白质)的范围内适当地变动；优选相对浓度是3∶1(肽/蛋白质)。 这样获得的溶液在约37℃孵育数分钟，例如，一直到10分钟。
或者，步骤b)和c)可以由计算机模拟取代，其利用蛋白质的简 化模型(例如，全原子Gō模型，Cα Gō-模型等[33])，加上热力学取 样或模拟动力学(例如，Monte Carlo算法，Newton动力学等)，模拟 蛋白质在各个类型肽存在下的演变(从该蛋白质的未折叠或折叠构象 开始)，从而确定蛋白质本身在这些肽存在下的未折叠度。
这些模拟实验可以提供有关与蛋白质的区段相同的抑制剂的序列 及其在溶液中的天然构象的信息。与显示小结构和/或大波动的抑制剂 相比，显示高度结构和稳定性的抑制剂是优选的。这与高度结构化抑 制剂(与所谓的“闭合”局部基本结构(LES)，即，显示对蛋白质稳 定性重要的天然接触的动机区段相对应)有望比其它低结构化的所谓 的“开放”LES特异性更强，从而毒性更小的事实是一致的[11，12，15]。 在这方面，值得注意的是，仅考虑残基的Cα-原子的模型计算重视了存 在于这两种类型LES之间的差异。
当存在的系统实验信息涉及与大量蛋白质位点相关的φ值[4]时， 为了确定蛋白质的“温”和“热”位点(即，在蛋白质的折叠中起主 要作用的部位[16]，相应的占据它们的氨基酸是高度保守的)，可以最 后对长度和蛋白质上的初始和最终氨基酸数稍微进行调整，以保证肽 抑制剂包括所有热氨基酸，并且，即使不是全部，也包括大多数温氨 基酸。
迭代(iteration)过程可以常常通过利用适当的软件(参见下述实 施例1)计算与靶蛋白质的不同氨基酸相关的φ值来进行。一旦设计了 新的抑制剂，还可能通过按照上述步骤(d)的分析测试其效力。
根据本发明的方法的步骤(d)，上述溶液中肽的抑制效力或未折 叠度或两者可以根据常规方法进行测定。作为非限制性例子，分光光 度检测，沉降平衡试验，圆二色谱和核磁共振技术都可以用来测定上 述抑制作用。
同样地，吸收实验是本领域[4]已知的当蛋白质是酶时用来测定抑 制效力[4，31]的方法。
如之前报道的那样，一旦发现有效阻断蛋白质折叠的肽，就不必 要继续进行检查其余肽的抑制特性的过程，搜索和鉴定可以终止于该 点。
换言之，本发明的方法可以用来从所制备并如此测试的所有M个 肽中鉴定出被赋予最高抑制活性的最佳肽。
或者，如上文所述，步骤(c)的不同溶液可以按任何顺序进行测 试，一旦发现具有预期抑制活性的肽便停止全部方法，而无需测试和 制备所有溶液。
这样，根据本发明的其它实施方案，步骤(a)可以包括设计长度 为4-20的单个肽；步骤(b)可以包括制备所述肽；步骤(c)可以包 括制备蛋白质与所述相同肽的溶液；步骤(d)可以包括评价所述肽的 抑制活性。如果发现所述肽的抑制效力令人满意，则可以终止该方法， 因为其能容易地鉴定适当的肽抑制剂。反之，如果抑制效力不佳，或 者无论如何该肽缺乏任何显著抑制效力，则用另一个肽重复步骤(a) 至(d)，直到鉴定出最佳抑制剂。
少数(1-4)抑制蛋白质折叠，并被我们称之为p-LES的肽鉴定了 在折叠过程中导致LES的蛋白质的氨基酸区段。
由于蛋白质为了实现其生物活性必须为天然(折叠)构象，因此 p-LES也有望成为蛋白质功能的有效的且永久有效的特异性抑制剂。
应该测定p-LES在培养基中的溶解度，并且如果需要，可以对其 进行修饰，以降低其疏水性。
例如，修饰可以通过以下方法进行：1)加入极性和/或带电荷的 氨基酸；2)缩短链长，即释放C端或N端或此两端的一个或两个疏水 氨基酸；3)保守突变，即用另一个疏水性稍小的氨基酸置换疏水性氨 基酸。
此外，由于p-LES是肽，因此其也可以被细胞消化和/或产生过敏 反应。
在这种情况下，p-LES可以用作对应于其模拟分子的折叠抑制剂， 或者按照已知方法，利用D-氨基酸合成的最终具有相同氨基酸序列的 肽的先导物。
下面将通过实施例，同时参考肽模拟物和p-LES的溶解度更加详 细地描述本发明的各个方面和实施方案。
所述实施例不希望限制本发明，因为人们将认识到，可以在不超 出本发明的范围的条件下对本发明的方法的细节进行修改。
附图：
图1：src SH3的晶体结构的图。(5个)反向平行的β-折叠被描 画为带箭头的(浅灰色)带状物，而α螺旋则以深灰色表示。
图2：在三种不同温度下计算的单独的SH3蛋白质的序参数q的 平衡分布概率，所述q的定义为天然接触的相对数。q＞0.7时，该蛋白 质为天然构象，q＜0.5时，该蛋白质为变性态。天然和变性态的峰具有 相同面积时的温度T＝0.843是折叠温度。
图3：由Src-SH3蛋白质结构域和三种与插图中所示由第一个和最 后一个氨基酸表征的蛋白质区段之一具有相同序列的肽组成的系统的 序参数q在T＝0.825时的平衡分布概率。
图4：T＝0.825时计算的由Src-SH3蛋白质结构域和三种与插图中 所示由第一个和最后一个氨基酸表征的蛋白质区段之一具有相同序列 的肽组成的系统的序参数q的平衡分布概率。
图5：T＝0.825时由Src-SH3蛋白质结构域和三个其序列与长度为 6的起始于横坐标所示部位的蛋白质片段同一的肽组成的系统的天然 态群，其已相对于蛋白质本身的天然态群(pN非p-LES)进行标准化。肽 以区段1-6开始，以区段55-60结束，不同肽之间的重叠为67％。线引 导目光。空心圆点提供了由轻微修饰两种初始肽，即肽p-S2(＝21-27) 和p-S3(＝35-40)而获得的肽p-S′2(＝18-28)和p-S′3(＝36-42)的抑 制剂特性的信息(参见正文)。
图6：Src SH3蛋白质结构域在T＝0.825时的天然态群(空心圆点)。 所示横坐标值为0的结果与野生型序列相对应。其它结果与在位点9， 30(冷，C)，5，49和55(温，W)及18，26(热，H)处具有突变 的蛋白质相对应。T＝0.825时，Src SH3蛋白质结构域在三种p-S3(35-40) 存在下的天然态的相对群以实心三角形的方式显示。图线引导目光。 不同突变位点的值与具有横坐标中所指突变的蛋白质的野生型序列相 对应。
图7：利用改良Gō模型计算的Src-SH3突变的自由能的变化ΔΔG。 并且还显示了[ΔΔG]和[ΔΔG]+2σ的值。ΔΔG＞[ΔΔG]+2σ的位点(#18， 26，27和40)被称为热氨基酸，而[ΔΔG]＜ΔΔG＜[ΔΔG]+2σ的位点(#4， 5，6，28，39，41，48，49，50和55)是温氨基酸。系统计算和实验 信息表明，单结构域单球状蛋白质的“热”和“温”点以上述比例存 在(参照[40]及其中的参考文献)。
图8：与图7相同，但是是通过蛋白质工程[32]经实验确定的 ΔΔGU-N值。在这种情况下，位点10，20，24和26是热点，而位点5， 7，18，23，38，41，44，48，49和50则是温点。
图9：HIV-1-PR同二聚体的天然构象的图。各单体含有99个氨基 酸。两种单体用不同灰度级表示。在向右显示的单体中，与该单体有 关的LES的可能候选者以暗灰色表明[37]。
图10：利用广义C□Gō模型[37]计算的HIV-1-PR单体的许多位点 (x轴)上的突变对该蛋白质的天然态的稳定性pN(y轴)的影响。实 心十字与单独的单体的天然构象的稳定性相对应(生物学温度T＝2.5 kJ/mol)，而实心圆点则显示了该单体在三种p-S8(＝83-93)型p-LES 存在下的pN值。在突变位点＝0处所画十字和闭合圆点表示与野生型序 列相关的结果。图线引导目光。
图11：在肽83-93(1)，非抑制剂肽(2)，肽61-70(3)和肽 9-19(4)(来自参考文献[36])存在下HIV-1-PR活性基准的吸光度作 为时间的函数。
实施例
实施例1(Sre-SH3)
该结构域显示5个反向平行的β-折叠和α螺旋，由60个残基组成 (参见图1)。
对于本发明的方法，这是有趣的基准，因为其已通过热力学和动 力学实验被广泛表征[32]。
利用广义Gō模型[33]模拟SH3结构域的折叠，并计算该结构域为 其天然构象的概率(参见图2)。对SH3结构域与肽同时存在的每一 种情况，我们重复该计算过程，所述肽显示与28种长度为N/10(＝6) 的蛋白质区段，即1-6，3-8，5-10，……，55-60之一同一的序列，并 且肽-结构域比例为3∶1。结果见图3，4和5。
从这些结果可以清楚地指出肽p-S1＝3-8，p-S2＝21-27，p-S3＝35-40 和p-S4＝45-50抑制了折叠，而p-S3肽是最有效的。
因此，区段Si(i＝1，2，3和4)是src SH3结构域的LES。
图6中所示结果证明了肽Si(i＝1，2，3和4)不仅是有效抑制剂， 而且还永久有效的事实。
图6中显示了点突变对蛋白质本身及在三种p-S3肽存在下的稳定 性的影响。不影响蛋白质的稳定性或折叠能力的突变(例如，在位点 #9和#30处的突变)未改变p-S3肽的抑制能力。另一方面，逃逸突变 (例如，在位点#(5，18，26，49和55)处的突变)不能折叠。这些 结果与位点#(9，30)，#(5，49，55)和#(18，26)分别为冷，温 和热点的事实一致。
结合图5和图7中所示结果，为了确保4种抑制剂p-Si(i＝1，2， 3和4)包括所有热点(位点#18，26，27和40)和大多数温点(4，5， 6，28，39，41，48，49，50，55)，可以稍微调整这4种抑制剂的长 度和初始及最终氨基酸数。沿这些图线进行的第一次迭代的合理成果 产生了：P-S1＝P-S1′＝3-8(包括温氨基酸4，5和6)，p-S′2＝18-28(热 氨基酸18，26，27；温氨基酸28)，p-S′3＝36-42(热氨基酸40；温氨 基酸39，41)，p-S′4＝p-S4＝45-50(温氨基酸48，49，50)。注意：该 抑制剂肽的集合不包括单个(温)氨基酸(#55)。这与不是所有参与 (后临界)FN的温点必定属于LES(例如，S36-模型蛋白质的温氨基 酸#16是后临界FN的一部分，但不属于任何LES[16])的事实是一致 的。图5中所示P-S2′和p-S3′的结果(空心圆点)例证了迭代肽的改良 的效力。
值得注意的是，到现在为止报道的所有结果均来自于模型计算。 由于在目前的情况(Src-SH3蛋白质结构域)下，存在的详细实验信息 涉及在折叠过程中起重要作用的氨基酸(即从蛋白质工程中了解ΔΔG 值[32]，参见图8)，因此可能利用该信息去进行迭代过程。
从图8所示结果可以指出分别与氨基酸#10，20，24，26和氨基酸 #5，7，18，23，38，41，48，50相应的“热”和“温”点。
利用这些结果及图5和6中所示结果，我们发现合理的第一次迭 代产生了p-S1′＝5-10(含有热氨基酸10和温氨基酸#5，7)，p-S2′＝20-26 (热氨基酸#20，24，26；温氨基酸#23)，p-S3′＝38-44(温氨基酸#38， 41，44)和p-S4′＝p-S4＝45-50(温氨基酸#48，50)。
由上述方法确定的这些肽的抑制特性应该通过本发明的方法的步 骤(d)中所引用的分析法进行测试。
实施例2(HIV-PR，计算的)
HIV-1-PR是由各自含有99个氨基酸的链构成的同二聚体(图9)。 该酶的稳定性已通过冗长的时间达数百纳秒(ns)的全原子模拟进行了 研究。利用相应的结果建立了广义模型。然后其被用来模拟该酶 折叠的全部动力学演化，并将所得结果与可在文献中获得的全原子标 准Gō模型模拟实验的结果进行比较。结合获自这些模拟实验的认知和 来自突变的信息(表1)，确定该蛋白质的“热”和“温”点，并选出 LES的可能候选者。尤其是，区域S8＝(83-93)(详情参照[37]和其中的 参考文献)。
在3种p-S8肽存在下模拟HIV-1-PR单体的折叠。将天然态的群 PN定义为链显示出低于的RMSD，并形成大于70％的天然接触的 标准化概率，一个结果显示PN＝0.28。该数值必须与相同生物学条件下 单独的蛋白质的PN＝0.87及该蛋白质在具有与片段61-71和4-14相同 的序列的对照肽存在下的数值PN＝0.72和0.66进行比较[37]。该抑制剂 不产生抗性这一事实的证据见图10。不影响蛋白质的稳定性或折叠能 力的突变基本上未改变p-S8肽的抑制特性(例如，在位点#19处的突 变)。逃逸突变(例如，在位点#33处的突变)基本上不能折叠。
实施例3(HIV-PR，实验性的)
通过固相合成得到显示与野生型HIV-1-PR单体的区段83-93(S8) 和区段9-19及61-70具有同一的序列的肽。向20mM磷酸盐缓冲液(pH 6)中加入0.8mM NaCl，1nM EDTA和1mM二硫苏糖醇，再加入2.78 μg HIV-1蛋白酶和5.4μM肽(即，各不同肽的浓度为蛋白酶浓度的3 倍)，制成各溶液。
利用显色底物[34]进行光谱分析，测量其在310nm处的吸光度相 对时间的变化[36]。图11中报道了部分相应结果。可以看到，肽83-93 始终降低蛋白酶的活性，因此可以用作抑制剂。该序列因此可以被理 解为产生了HIV-1-PR的LES。如从图9观察到的那样，该LES结构良 好，包含许多内部天然接触(其稳定α螺旋转角)。其因此是特异性 尤其强的肽抑制剂。值得注意的是，不管是否由商品化药物(目标为 抑制该蛋白酶的活性部位)诱导，在该片段[35]或其互补片段(即，片 段24-34)中观察到的突变都被发现是保守突变(参照表1)。
表1：参考文献[35]中报道的观察到的HIV-1-PR的突变。对于野 生型序列的各残基(wt)，列出了在治疗和/或未治疗患者中观察到的 突变(mut)和与这些突变中的最少保守性突变相关的PAM250分值 (PAM250是由分析相关蛋白质之间发生的氨基酸置换而得到的分值。 其为通常发生在相关蛋白质之间的置换(保守突变)规定各种正值， 为不可靠置换(unlikely replacements)(非保守突变)规定零或负分值)。 用粗体字报告了发生非保守性突变的位点。
实施例4
如果是含有N个氨基酸的蛋白质，可以制备长度为L＝(N/10)±2， 各显示与该蛋白质的某区段相同的序列的肽。肽#1与开始于氨基酸1 和结束于氨基酸L的区段一致，肽#2与区段(L/z+1)-[(1+z)L/z]- 致，…，而ith肽与区段(iL/z+1)-[(i+z)L/z]-致，其中i＝1，2，…， im，其中im＝zN/L-z。因此，将产生的肽的最大数量是im+1。数量z控 制两个相邻肽之间允许的重叠。z的推荐值为导致50％和67％重叠的2 和3。
为了(现实)例证的目的，我们选择值N＝100，L＝10，z＝3。然后 获得im＝27和67％的重叠。与28种可能肽各自的第一个和最后一个氨 基酸相对应的数集中在表2中。
以HIV-1-PR二聚体的单体为例，我们关联这些结果，并假定在抑 制折叠的肽的搜索中所遵循的三种不同方案：a)从氨基酸(aa)1开 始有序搜索，并继续进行至aa 100(即，从N端开始向C端进行)，b) 有序搜索，但以相反的顺序进行(由100至1，即，从C端到N端)， c)从蛋白质的N端，C端和中间开始随机搜索，然后从这些区域离开， 以覆盖全部蛋白质。为找到p-LES抑制剂(表2的肽#26)，在第一种 情况下，研究者需要进行26次尝试，在第二种情况下，需要3次尝试， 而在第三种情况下则需要12次尝试(见表2)。
表2：将HIV-1-PR的序列分割为肽的例子。各列分别显示了肽的 标识号，指标i(参见正文)，HIV-1-PR序列中的相应片段和基本上同 时从蛋白质的中心及C和N末端开始进行的非连续抑制试验的例子(以 罗马数字表示)。在这种情况下，当测试肽#26时，搜索工作在12个 步骤后结束。
参考文献
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机译： 蛋白质折叠抑制剂的鉴定方法
机译： 蛋白质折叠抑制剂的鉴定方法
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