运用环介导恒温扩增技术检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法

摘要

本发明公开了一种运用环介导恒温扩增技术检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，属于细菌检验技术领域，主要的技术方案是设计了引物组序列，采用环介导恒温扩增技术进行检测，其环介导恒温扩增产物检测方法包括：(1)10,000×g，5分钟，室温，阳性可见在试管底部见到白色沉淀；(2)加入显色剂，阳性结果成绿色；(3)1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果有阶梯状电泳条带；可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。该方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的细菌，提高了检测效率，节约了时间，从而解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状。

说明书

技术领域

本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用环介导恒温扩增反应来检测小肠结肠炎耶尔森氏菌，特别是食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测方法。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌是食品中的常见细菌，可引起极为严重的食品中毒事件，并可以导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康，为各国海关必检微生物之一。快速、准确的检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌是有效预防和控制耶尔森氏菌感染的前提条件。目前食品中的细菌鉴定通常还是利用传统生理生化方法进行检测，利用传统的方法检测食品中的小肠结肠炎耶尔森氏菌，不仅需要4天的时间进行菌落培养，更要消耗大量的人力和物力，现在已经越来越无法满足进出口货物日益增长的现状。

另外还有一种利用普通的PCR技术进行检测的方法，该方法在设备要求上非常严格，不仅要有价格昂贵的PCR仪，更必须备有电泳装置和相应的实验室，因此不便于广泛推广应用。

随着分子生物学的发展，食品检验检疫工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。最新开发出来的环介导恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。因此如何运用环介导恒温扩增技术检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌已成为食品检验检疫工作中进行攻关的重要课题。

发明内容

为了提高食品检测效率，节约时间，以解决传统检测方法无法满足进出口货物日益增长的现状，本发明经过无数次的实验检测，终于探索出一种运用环介导恒温扩增技术检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，该方法具有检测快速、便捷、低成本等特点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物用于环介导恒温扩增技术检测；

(2)整合各引物使之不相互干扰。

(3)以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；

(4)扩增完毕后可通过短暂离心直接目测白色沉淀检测结果，或通过电泳带形分析检测结果。

本发明用特异性的引物组扩增小肠结肠炎耶尔森氏菌，反应后目测结果和电泳结果均未发现假阳性和假阴性的结果。

该方法包括：应用该方法检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌所使用的引物组和与之配套的扩增反应条件。其中所使用的引物组序列如下：

引物序列一：TCCACTCAGACCCACCAA

引物序列二：ACCGTATCGGCATAACTCATCCTGATACTGCGTGACT

引物序列三：TCTTACGACCGCAGCACAT

引物序列四：TTGCTTTTTATGTGGGGCTATGGAACTAAGCGGGATGGAA

环介导恒温扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                    浓度        加样量

扩增体系预混合物        2×         12.5μL

引物序列一              10μmol/L   0.2μL

引物序列                10μmol/L   1.6μL

引物序列三              10μmol/L   0.2μL

引物序列四              10μmol/L   1.6μL

DNA样品                             2μL

双蒸水    6.9μL

总体积    25μL

环介导恒温扩增程序为：

(1).61℃  1小时；

(2).80℃  10分钟。

环介导恒温扩增产物检测方法包括：

(1).10,000×g，5分钟，室温，可在试管底部见到白色沉淀；

(2).加入显色剂，反应液呈现绿色；

(3).1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果有为阶梯状电泳条带；

选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

环介导恒温扩增产物检测理论依据

1、阳性结果会产生白色沉淀：在环介导恒温扩增过程中，dNTP不断添加进新合成的核苷酸链，同时会生成大量的副产物——焦磷酸镁。焦磷酸镁是一种白色沉淀物，由于整个扩增实验都是在61℃进行，所以焦磷酸镁沉淀无法溶解，最终，随着阳性核苷酸链的增加，焦磷酸镁沉淀也不断积累。从而在反应结束后，可以直接通过观察白色沉淀而确定阳性反应。

2、阳性结果在加入SYBR Green染料后，溶液变成绿色：阳性的环介导恒温扩增会合成大量核苷酸链。反应后，向阳性反应产物中加入SYBR Green染料后，SYBR Green分子会大量嵌入核苷酸链中，从而使SYBR Green分子产生绿色荧光。而阴性结果由于没有目的基因片段，无法扩增出核苷酸链，SYBR Green也便无法同核苷酸链结合，结果只能是棕黄色。

3、阳性结果在电泳中表现为阶梯状电泳条带：环介导恒温扩增的引物设计有一至关重要的环节，即在正常扩增引物的5’末端结合了一段链内配对区域。其目的在于，在扩增进行的同时，链内配对区可以同新扩增的核苷酸链中的某部区域配对，从而在新扩增链的一端形成环状结构。同理，在新扩增链的另一端，也可以形成相同的环状结构。而在以后的扩增过程中，引物会不断地扩增这一段两端成环的模板，从而不断积累这一环状单位的个数，使新合成核苷酸链分子以一个环状结构为基数，不断合成、不断积累。而这一分子量的积累，反映在电泳中，则表现为形成阶梯状电泳条带。

如出现其它结果则表明此次检验失败不能确定是否存在小肠结肠炎耶尔森氏菌，需重新检验。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，基于环介导恒温扩增的鉴定方法适用于直接从患者含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次环介导恒温扩增反应就能够检测小肠结肠炎耶尔森氏菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它PCR方法，本方法仅需要简单的设备——一个恒温水域箱、一个离心机或普通电泳设备(电泳仪)即可，大大提高了性价比节约了成本。环介导恒温扩增方法具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定特异的目的细菌。环介导恒温扩增鉴定方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。

附图说明

图1某待测鲜鸡肉样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，离心后目测沉淀结果：待测样品试管(右侧)底部可见明显白色沉淀；阴性对照(左侧)没有沉淀。

图2某待测鲜鸡肉样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，SYBR Green染色结果：待测样品溶液(右侧)呈现绿色；阴性对照(左侧)为棕黄色。

图3某待测鲜鸡肉样品环介导恒温扩增技术检测待测样品DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果：待测样品(第3道)出现阶梯状条带；阴性对照(第2道)没有条带；第1道为Marker。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

样本：某处出口鲜鸡肉。

用常规生理、生化方法检测出小肠结肠炎耶尔森氏菌落，然后进行如下环介导恒温扩增技术检测：

1.样品处理

(1)取100克待检样品，粉碎。

(2)将样品放于装有1升营养肉汤的锥形瓶中，培养箱中37℃培养8小时。

2.DNA抽提

用滴管取培养后的营养肉汤1mL，在冰浴中静置5分钟，然后在室温下3000转/分钟，离心10分钟，取上清液，室温下10000转/分钟，离心5分钟，弃掉上清液，向沉淀中加入50μl细菌裂解液，沸水浴10分钟，室温下10000转/分钟，离心5分钟，取上清液置-20℃保存。

3.环介导恒温扩增

扩增反应体系中各组分构成比例如下：

成分                    浓度        加样量

扩增体系预混合物        2×         12.5μL

引物序列一              10μmol/L   0.2μL

引物序列二              10μmol/L   1.6μL

引物序列三              10μmol/L   0.2μL

引物序列四              10μmol/L   1.6μL

DNA样品                             2μL

双蒸水                              6.9μL

总体积                              25μL

环介导恒温扩增程序为：

(1)61℃  1小时；

(2)80℃  10分钟。

反应在恒温水浴箱中进行。

环介导恒温扩增共进行2管反应，其中一管中加入样品DNA；另一管为无样品DNA的反应体系，作为阴性对照。

4.对被检测样品结果进行观察

(1)环介导恒温扩增产物10,000×g离心5分钟后，待测样品试管底部有明显白色沉淀，阴性对照则没有沉淀，结果如图1。

(2)环介导恒温扩增产物加入SYBR Green染色后，待测样品溶液呈现绿色，阴性对照为棕黄色，结果如图2。

(3)环介导恒温扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，待测样品有阶梯状电泳条带，阴性对照没有电泳条带，结果如图3。

可以选择以上三种环介导恒温扩增产物检测方法中的任意一种方法进行检测。

实验表明样品中含有小肠结肠炎耶尔森氏菌。

3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为小肠结肠炎耶尔森氏菌。环介导恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

<120>运用环介导恒温扩增技术检测食源性小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法

<160>4

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>primer bind

<222>(1)..(18)

<223>

<400>1

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<210>2

<211>37

<212>DNA

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<222>(1)..(37)

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<400>

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<222>(1)..(40)

<223>

<400>4

ttgcttttta tgtggggcta tggaactaag cgggatggaa                       40