植物中基因表达的dsRNA介导的调节

摘要

本发明涉及利用基因的有义和反义RNA片段改变植物中靶基因表达的方法。有义和反义RNA片段能够配对并形成双链RNA分子，从而改变基因的表达。本发明还涉及用本发明的方法获得的植物、其后代和产生的种子。

说明书

本申请是基于申请号为99807888.3，申请日为1999年5月25日， 发明名称为“植物中基因表达的dsRNA介导的调节”的中国专利申请的 分案申请。

本发明涉及改变植物中基因表达的方法，特别是利用该基因的有义 和反义RNA片段，并且涉及利用本发明的方法获得的基因表达改变的植 物。

分子生物学和植物转化技术的发展使得能产生具有希望的不同性状 的转基因植物，这些性状例如，对昆虫及真菌或微生物病原体的抗性， 对除草剂的耐受性或增值性状。这些希望的性状主要是通过植物中转基 因过量表达而获得的。然而，在某些情况中，修饰植物使得特定基因的 表达改变，从而产生具有希望的表型或具商业价值的特性的植物也是希 望的。现有的改变基因表达的方法通常依赖于有义或反义抑制技术。例 如，矮牵牛属(Petunia)中查耳酮合酶基因的有义抑制产生色素形成改 变的花，番茄中多聚半乳糖醛酸酶基因的反义抑制导致延迟的果实成熟。 遗憾的是，这些方法在改变基因表达的能力方面常常是易变的且无法预 测的，在许多情况下不能实现特定基因活性的完全破坏。改变基因表达 的其他方法包括催化核糖核苷酸或核酶的应用，这在技术上是有挑战性 的，或者同源基因破坏，虽然在遗传学上这是最希望的，但遗憾的是利 用现有技术不足以常规用于这些目的。

因此，一直需要但尚未找到能有效地且可预测地改变植物细胞中基 因表达，而获得具有改善的或商业重要特性的植物的新方法。

本发明涉及利用分子技术和遗传转化产生具有改善的特性和性状的 植物。特别是，本发明涉及利用基因的有义和反义RNA片段改变植物细 胞中基因表达的方法。重要地，这些有义和反义RNA片段能够形成双链 RNA分子。本发明还涉及用这些方法获得的植物细胞，由这些细胞衍生 的植物，这些植物的后代和这些植物产生的种子。在这些植物细胞或植 物中，特定基因之基因表达的改变比利用本领域已知的现有方法获得的 特定基因之基因表达的改变更有效、更有选择性且更可预测。

因此本发明提供：

一种方法，包括向植物细胞中引入靶基因的有义RNA片段和该靶基 因的反义RNA片段，其中该有义RNA片段和反义RNA片段能形成双 链RNA分子，其中靶基因在该细胞中的表达被改变。在一个优选实施方 案中，RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。在另一个实施方案中， 此RNA片段在被引入细胞之前混合。在另一个优选实施方案中，此RNA 片段在被引入细胞之前，在能使其形成双链RNA分子的条件下混合。在 另一个优选实施方案中，这些RNA片段被顺序引入所述细胞中。在又另 一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于一种RNA分子中。在这种 情况中，该RNA分子优选地能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段 形成双链RNA分子。

本发明另外提供：

一种方法，包括向植物细胞中引入能在该细胞中表达靶基因的有义 RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达靶基因的反义RNA 片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能 形成双链RNA分子，其中靶基因在该植物细胞中的表达被改变。在一个 优选实施方案中，这些DNA序列稳定地整合于植物细胞的基因组中。在 一个优选实施方案中，DNA分子另外含有与所述第一种或第二种DNA 序列有效连接的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和 第二种DNA序列包含于两种不同的DNA分子中。

或者，第一种DNA序列和第二种DNA序列也可包含于一种DNA 分子中。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地包含 于该DNA分子的同一DNA链中，并且优选地，有义RNA片段和反义 RNA片段包含于一种RNA分子中。优选地，该RNA分子能够折叠，使 得其中包含的所述RNA片段形成双链区。在另一个优选实施方案中，有 义RNA片段和反义RNA片段包含于或者表达为两种RNA分子。在此 情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地与双向启动子有效 连接，或者，另外，第一种DNA序列与第一种启动子有效连接，而第二 种DNA序列与第二种启动子有效连接，其中第一种启动子和第二种启动 子是相同的启动子或不同的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种 DNA序列和第二种DNA序列包含于所述DNA分子的互补链中。

在又一个优选实施方案中，在所述DNA分子中，第一种DNA序列 是第二种DNA序列的互补DNA链。

在此情况中，该DNA分子另外含有与所述第一种DNA序列有效连 接的第一种启动子。在一个优选实施方案中，该DNA分子另外含有位于 第一种启动子和第一种DNA序列之间的第一个位点特异性重组位点，和 位于第一种DNA序列3’末端的第二个位点特异性重组位点，其中第一个 和第二个位点特异性重组位点能够在位点特异性重组酶的存在下，翻转 位于第一种和第二种位点特异性重组位点之间的第一种DNA序列，并且 优选地彼此互为反向。在另一个优选实施方案中，由于这种翻转，第一 种启动子能够表达第二种DNA序列。植物细胞优选地另外含有一种能够 识别所述位点特异性重组位点的位点特异性重组酶。

在又一个优选实施方案中，该DNA分子另外含有与所述第一种DNA 序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种 启动子，其中第一种启动子和第二种启动子含有相同的启动子或不同的 启动子。

在另一个优选实施方案中，靶基因是所述植物细胞的天然基因，优选 的是该植物细胞的必需基因。在另一个优选实施方案中，DNA分子中的 启动子包括该天然靶基因的天然启动子。在另一个优选实施方案中，该 启动子是异源启动子，例如组织特异性启动子、发育调节启动子、组成 型启动子或诱导型启动子。任选地，该启动子是一种能在启动子任一侧 起始DNA序列转录的趋异启动子。在另一个优选实施方案中，该基因是 该植物细胞中的异源基因，优选地稳定整合于该植物细胞的基因组中， 或者另外作为染色体外分子存在于该植物细胞中。

在另一个优选实施方案中，DNA序列在编码有义和反义RNA片段 的DNA序列之间另外含有一种接头。接头包括例如，含有功能基因(如 选择性标记基因)或调节序列(如内含子加工信号)的表达盒。

本发明另外还提供：

一种植物细胞，其含有本发明的有义和反义RNA片段，其中所述RNA 片段、植物细胞产生的植物及其后代，和该植物产生的种子改变了所述 植物细胞中靶基因的表达。

本发明另外还提供：

通过本发明的方法获得的植物细胞。

“双链RNA(dsRNA)”分子包含靶基因的有义RNA片段和相同靶 基因的反义RNA片段，两者都含有彼此互补的核苷酸序列，从而使得有 义和反义RNA片段配对，并形成双链RNA分子。

“互补”是指含有反平行核苷酸序列的两种核苷酸序列，它们能在反 平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此配对。

“反平行”在此是指在互补碱基残基之间通过氢键配对的两种核苷酸 序列，在一种核苷酸序列中磷酸二酯键为5’-3’方向，而在另一种核苷酸 序列中为3’-5’方向。

“靶基因”是植物细胞中的任一基因。例如，靶基因是一种具有已知 功能的基因，或者是一种尚未知其功能但已知其全部或部分核苷酸序列 的基因。或者，靶基因的功能及其核苷酸序列也可都未知。靶基因是植 物细胞的天然基因，或者是以前通过例如遗传转化引入植物细胞或该植 物细胞的亲代细胞中的异源基因。异源靶基因稳定地整合于植物细胞的 基因组中，或者作为染色体外分子如自主复制染色体外分子存在于植物 细胞中。

“天然”基因是指存在于未转化的植物细胞基因组中的基因。

“必需”基因是编码植物生长或存活所必需的蛋白质如生物合成酶、 受体、信号转导蛋白、结构基因产物或转运蛋白的基因。

“改变”植物细胞中靶基因的表达意思是，应用本发明的方法后，植 物细胞中靶基因的表达水平不同于应用该方法之前其在细胞中的表达。 改变基因表达优选地意思是，植物中靶基因的表达降低，优选地强烈降 低，更优选地基因表达检测不到。必需基因表达的改变可导致植物细胞 或由其衍生的植物中的敲除突变表型。

在本发明申请书中“分离的”是一种分离的核酸分子，其通过人工操 作与其天然环境分开存在，因此不是一种天然产物。分离的核酸分子可 能以纯化的形式存在，或者可能存在于非天然环境中，如转基因宿主细 胞中。

在此使用的“表达盒”意思是能在适当宿主细胞中引导特定核苷酸序 列表达的DNA序列，包括与目的核苷酸序列有效地连接的启动子，该核 苷酸序列与终止信号有效地连接。它一般还包含核苷酸序列适当翻译所 需的序列。编码区通常编码目的蛋白，但也可编码目的功能性RNA，例 如有义或反义方向的反义RNA或非翻译RNA。含有目的核苷酸序列的 表达盒可以是嵌合的，意思是其至少一种成分对于至少另一种成分是异 源的。表达盒也可是天然发生的，但已以可用于异源表达的重组形式获 得。然而一般而言表达盒对于宿主是异源的，即表达盒的特定DNA序列 不在宿主细胞中天然存在，并且必须通过转化事件被引入宿主细胞或宿 主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱 导型启动子的控制，该启动子只有在宿主细胞接触某种特定外部刺激物 时才起始转录。对于多细胞生物，如植物，启动子也可能是对特定组织 或器官或发育阶段特异的。

在此使用的“异源的”意思是“不同天然来源的”，或者表示一种非 天然状态。例如，如果用从另一种生物尤其是从另一个种衍生的核酸序 列转化宿主细胞，该核酸序列对于该宿主细胞是异源的，并且对于该宿 主细胞的携带该核酸序列的后代也是异源的。类似地，异源是指来源于 和插入相同天然、原始细胞型的核苷酸序列，但它以非天然状态存在， 例如，不同拷贝数，或处于不同调节元件控制之下。

最广义地来说，当在此对于核苷酸序列使用时，术语“基本上类似” 意思是一种对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相应的序列编码 一种与参照核苷酸序列编码的多肽有基本上相同的结构和功能的多肽， 例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸改变。希望地，基本上类似的核 苷酸序列编码参照核苷酸序列编码的多肽。基本上类似的核苷酸序列与 参照核苷酸序列之间同一性的百分数(互补序列中的互补碱基数除以互 补序列中的碱基总数)希望地为至少80％，更希望地为85％，优选地至 少90％，更优选地至少95％，再更优选地至少99％。

“调节元件”是指参与核苷酸序列表达的序列。调节元件包含与目的 核苷酸序列有效连接的启动子和终止信号。它们一般还包含该核苷酸序 列适当翻译所需的序列。

“植物”指在任何发育阶段的任何植物或植物的部分。其中也包括插 条、细胞或组织培养物和种子。与本发明联合使用时，术语“植物组织” 包括但不限于，整个植物、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、 愈伤组织、细胞培养物、和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。

本发明涉及调节植物细胞中基因表达的方法。调节植物细胞中基因表 达的常用方法缺乏可预测性，并且根据所调节的基因显示变化性。本方 法解决了这些问题，并且提供了植物细胞中可重复的及有效的基因调节。

本发明利用靶基因的有义RNA片段和反义RNA片段改变植物细胞 中基因的表达。在第一个实施方案中，本发明提供了改变靶基因在植物 细胞中表达的方法，包括向植物细胞中引入靶基因的有义RNA片段，和 该靶基因的反义RNA片段，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形 成双链RNA分子，其中靶基因在所述细胞中的表达改变。在一个优选实 施方案中，用不同的转化方法将RNA片段引入植物细胞中。例如，利用 如共同未决的申请08/717,676所述的粒子轰击向宿主细胞中转移RNA片 段。在另一个优选实施方案中，通过如Lebel等人(1995)理论与应用 遗传学(Theor.Appl.Genet.)91：899-906的PEG介导的转化或通过电 穿孔法向原生质体或其他细胞型中引入RNA片段。在另一个优选实施方 案中，使用其他技术，如RNA片段的显微注射。

在另一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于两种不同的RNA 分子中。在此情况中，此RNA片段在被引入所述细胞之前，例如在能使 其形成双链RNA分子的条件下混合。在另一个优选实施方案中，这些RNA 片段被顺序引入所述细胞中。优选地，每种RNA分子引入之间的时间间 隔很短，优选地少于1小时。在又另一个实施方案中，这些RNA片段包 含于一种RNA分子中。利用一种RNA分子，两种互补的RNA片段紧 密接近，引起配对，促成了双链形成。在这种情况中，该RNA分子优选 地能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链区。在这种情况中， RNA分子的互补部分彼此识别，互相配对，形成双链RNA分子。在一 个优选实施方案中，在引入细胞之前，在能使其形成双链RNA分子的条 件下温育RNA片段。在又另一个实施方案中，RNA分子在有义RNA片 段和反义RNA片段之间含有一个接头。该接头优选地包含含有功能基因 如选择性标记基因的表达盒所编码的RNA序列。在另一个实施方案中， 接头包含调节序列编码的RNA序列，例如，含有内含子加工信号。

在另一个优选实施方案中，本发明提供一种方法，包括向植物细胞中 引入能在所述细胞中表达靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列， 和能在所述细胞中表达靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其 中有义RNA片段和反义RNA片段能形成一种双链RNA分子，其中该 细胞中靶基因的表达改变。在一个优选实施方案中，第一种DNA序列和 第二种DNA序列稳定地整合于植物细胞的基因组中。在另一个优选实施 方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列存在于植物细胞中染色体 外分子上，如自主复制分子上。此外，第一种DNA序列稳定整合于植物 细胞的基因组中，而第二种DNA序列存在于植物细胞的染色体外分子 上。

在另一个优选实施方案中，DNA序列包含于两种不同的DNA分子 中。在这种情况中，第一种DNA序列与第一种启动子有效连接，而第二 种DNA序列和第二种启动子有效连接。在一个优选实施方案中，两种启 动子包含于同一种启动子中，或者另外，包含于不同的启动子中。该DNA 分子中任选地也包含终止信号。

在另一个优选实施方案中，DNA序列包含于一种DNA分子中。优 选地，第一种和第二种DNA序列包含于DNA分子的相同DNA链中， 并且优选地，有义RNA片段和反义RNA片段包含于或者表达为DNA 分子编码的一种RNA分子。在此情况中，DNA分子另外含有与第一种 或第二种DNA序列有效连接的启动子，其中该启动子能转录第一种和第 二种DNA序列。该启动子优选地与编码反义片段的DNA序列有效连接， 该序列本身与编码有义片段的DNA序列有效连接。或者，该启动子与编 码有义片段的DNA序列有效连接，该序列本身与编码反义片段的DNA 序列有效连接。利用一种单RNA分子，两种互补的RNA片段紧密接近， 引起配对，促成了双链形成。

或者，当DNA序列包含于同一DNA链中时，产生两种不同的RNA 分子，例如，一种含有有义RNA片段的RNA分子和一种含有反义RNA 片段的RNA分子。在这种情况中，DNA分子优选地另外含有能表达这 些RNA片段的调节元件。在一个优选实施方案中，这些调节元件包括趋 异的、双向启动子，其位于编码有义RNA片段的DNA序列和编码反义 RNA片段的DNA序列之间。在另一个优选实施方案中，含有相同启动 子或不同启动子的两种不同的启动子置于两个DNA序列之间。在又另一 个优选实施方案中，DNA分子包含与第一种DNA序列有效连接的第一 种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子，其中该DNA 序列位于两个启动子之间，并且两种启动子能以相反方向引导转录。在 另一个优选实施方案中，DNA序列另外在编码两种互补RNA片段的DNA 序列之间含有一种接头。该接头优选地包含含有功能基因如选择性标记 基因的表达盒。在另一个优选实施方案中，该接头包含调节序列，例如 包含内含子加工信号。

在又另一个优选实施方案中，第一种和第二种DNA序列包含于DNA 分子的互补DNA链中。更优选地，在DNA分子中，第一种DNA序列 是第二种DNA序列的互补链。例如，在此情况中，第一种DNA序列对 应于靶基因片段的编码链，并能表达有义RNA片段，第二种DNA序列 对应于靶基因的互补非编码链，能表达反义RNA片段。因此，在此情况 中，优选地产生两种不同的RNA分子。因此，DNA分子含有与第一种 DNA序列5’端有效连接的第一种启动子，能表达第一种DNA序列，和 与第一种DNA序列3’端有效连接的第二种启动子，能表达为第一种DNA 序列的互补链的第二种DNA序列。在一个优选实施方案中，使用两种不 同的启动子，或者另外，用相同的启动子表达两种DNA序列。在另一个 优选实施方案中，DNA分子另外在启动子的远端含有转录终止子。优选 地，在此情况中，转录物由一个启动子的3’端开始，以一个方向通过DNA 序列，从3’端到5’端通过第二个启动子，终止于第二个启动子5’末端的 转录终止子处。转录终止子的应用可稳定转录的RNA。

在另一个优选实施方案中，DNA分子另外含有与所述第一种DNA 序列有效连接的启动子，可能还含有位于该启动子与第一种DNA序列之 间的第一个位点特异性重组位点，和位于第一种DNA序列3’末端的第二 个位点特异性重组位点，其中第一个和第二个位点特异性重组位点在能 识别位点特异性识别位点的位点特异性重组酶的存在下，能翻转位于第 一个和第二个位点特异性重组位点之间的第一种DNA序列。无重组酶 时，只能产生第一种DNA序列编码的有义RNA片段。在相应重组酶的 存在下，位点特异性重组位点之间的DNA序列翻转，并且第二种DNA 序列与该启动子有效连接，反义片段得以表达。在重组酶的持续存在下， 发生DNA序列的进一步翻转，有义和反义RNA片段都积累。因此本发 明也提供进一步含有能识别位点特异性重组位点的位点特异性重组酶的 植物细胞。本发明的这一实施方案在实施例5中进一步描述。

在本发明的DNA分子中，DNA序列优选地与启动子有效连接。在 一个优选实施方案中，DNA分子中的启动子包括待灭活的天然靶基因的 天然启动子，以确保双链RNA以与待表达靶基因相同的发育时间存在于 相同的组织中。在另一个实施方案中，启动子是异源启动子，例如组织 特异性启动子、发育调节启动子、组成型启动子、趋异或诱导型启动子。 在另一个优选实施方案中，该基因是所述植物细胞中的异源基因。DNA 分子中任选地也包含终止信号。

一种RNA分子或两种不同的RNA分子优选地能形成一种双链区， 其中RNA片段的互补部分彼此识别，互相配对，形成双链RNA分子。 利用本领域众所周知的或以下描述的方法将本发明的DNA分子转化到植 物细胞中。例如，使用微粒轰击、显微注射或农杆菌介导的转化。并且， 利用电穿孔或化学处理(如PEG处理)以本发明的DNA分子转化原生 质体。

此外，也用病毒载体，例如通过所谓的农杆菌感染法，向植物细胞中 引入本发明的DNA分子或RNA片段。在另一个优选实施方案中，通过 真空渗入或叶表面磨擦向植物细胞中引入本发明的DNA分子或RNA片 段。

这些方法能产生含有本发明的有义和反义RNA片段的植物细胞，其 中，所述RNA片段、植物细胞衍生的植物及其后代，和该植物产生的种 子改变了所述植物细胞中靶基因的表达。

本发明中，有义与反义RNA片段之间互补区的长度希望地含有至少 15个核苷酸长，更希望地至少50个核苷酸长，优选地至少500bp长。优 选地，互补区小于5kb，更优选地小于2kb。有义与反义RNA片段之间 的互补区最好含有靶基因的编码区。在另一个优选实施方案中，互补区 含有靶基因的非翻译区(UTR)，例如5’UTR或3’UTR。在另一个优选 实施方案中，编码本发明的有义或反义RNA片段的DNA序列由一种c- DNA分子衍生。在另一个实施方案中，互补序列含有其表达改变的靶基 因的调节元件，如启动子或终止信号。

在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区与表 达被改变的基因的相应序列相同。在另一个优选实施方案中，有义与反 义RNA片段之间的互补区基本上类似于表达被改变的基因的相应序列， 并且仍能改变该基因的表达。在这种情况中，互补区与表达被改变的基 因的相应序列希望地至少50％相同，更希望地至少70％相同，优选地至 少90％相同，更优选地至少95％相同。因此，应用一个双链RNA分子 可以改变一个基因或多个基因的表达，单个基因包含与双链RNA相同的 序列，或基本上类似于双链RNA。

在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区在有 义和反义RNA片段之间不包含任何错配。在另一个优选实施方案中，有 义与反义RNA片段之间的互补区在有义与反义RNA片段之间包含至少 一个错配，两个RNA片段仍能配对，并形成双链RNA分子，从而改变 了基因的表达。希望地，在互补区的有义与反义RNA片段之间有低于50％ 的错配，更希望地低于30％的错配，优选地低于20％的错配，更优选地 低于10％的错配，再更优选地低于5％的错配。

例如，本发明的方法用来改变参与植物细胞代谢途径、参与植物对病 害抗性或易感性、或参与细胞分化的基因的表达。这些改变使植物具有 商业重要的改进的性状，如特定代谢途径的改变，对病害的抗性，或细 胞分化的改变。靶基因的其他实例描述于如美国专利5,107,065、5,283,184 和5,034,323中，在此引用作为参考。本发明的方法也用于改变基因的表 达，以阐明其功能。在这种情况中，例如，通过本领域众所周知的或以 下所述的转化方法将能够表达该基因的有义和反义RNA片段的DNA序 列引入植物细胞中。这些DNA序列例如稳定地整合于植物细胞的基因组 中。然后检查植物细胞的如表型或代谢改变。此外，也可由植物细胞再 生为植物，并检查该植物或其后代的如表型或代谢改变。例如，利用这 种方法，和对例如胚致死性、幼苗致死性或其他相关表型筛选转化植物， 发现必需基因。然后利用对基因功能的了解，通过遗传转化产生性质改 进的作物，或对新的化学试剂筛选。特别是，必需基因是除草剂靶标的 良好候选物。例如，必需基因序列在植物中过量表达，赋予植物对除草 剂的抗性，其抑制该基因编码的天然存在的酶的功能。也产生必需基因 的突变变体，并筛查对除草剂或对相关化合物的耐受性。这些突变变体 通过本领域众所周知的方法产生。必需基因编码的酶也用来筛查抑制其 功能的化合物，如用于体外高流通量筛查。然后测试抑制化合物的除草 剂活性。

本发明的方法也用来在事先不了解其核苷酸序列的情况下随机改变基 因的表达。在这种情况中，制备能配对并形成双链RNA分子的随机RNA 片段文库，或编码能配对并形成双链RNA分子的RNA片段的随机DNA 序列文库，并用本领域众所周知的或以下所述的方法将其引入植物细胞 中。对特定性质或表型筛查转化的植物细胞或植物。例如，用这种筛查 发现了上述必需基因。筛查的另一个实例用于在不同条件下未受妨碍的 生长，或者比未转化的细胞更不受妨碍的生长，这些条件例如，较高的 盐度或渗透压、较高温度、有毒或有害物质如除草剂的存在。这种筛查 后，回收双链RNA或编码双链RNA的DNA分子，并测定互补RNA片 段的序列，从而可以分离其表达的改变引起特定性质或表型的基因。然 后例如用该基因通过遗传转化改进作物或对新的化学试剂筛查。

植物转化技术

利用常规重组DNA技术将本发明的DNA分子掺入植物或细菌细胞 中。通常，本发明的DNA分子包含于一种转化载体中。可使用大量的这 些本领域所知的载体系统，如质粒、噬菌体病毒及其他修饰的病毒。表 达系统的成分也可被修饰，例如，用于增强有义和反义RNA片段的表达。 例如，可使用截短序列、核苷酸置换或其他修饰。本领域所知的表达系 统可用来在适当条件下实际转化任何作物植物细胞。包含本发明的DNA 分子的转基因优选地稳定转化到并整合到宿主细胞基因组中。在另一个 优选实施方案中，包含本发明的DNA分子的转基因位于自主复制载体 中。自主复制载体的实例是病毒，特别是双生病毒。转化细胞优选地再 生为整个植物。

按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限 于：玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、洋白 菜、花椰菜、硬花球花椰菜、萝卜、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、 胡椒、芹菜、笋瓜、南瓜、大麻、夏季南瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、 李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠萝、鳄梨、 番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油菜 子、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、黄瓜、 拟南芥，和木本植物如松柏类和落叶类树。希望的核苷酸序列被转化到 特定植物种后，可以用传统培育技术在该种中繁殖或转移到相同种的其 他品种中，特别包括商业品种。

A.构建植物表达盒的要求

首先在表达盒中在可在植物中表达的适当启动子之后装配准备在转基 因植物中表达的基因序列。这些表达盒也可包含转基因表达所需或选择 的其他任何序列。这些序列包括但不限于，例如，转录终止子、增强表 达的外部序列，如内含子、关键序列和用于将基因产物导向特定细胞器 和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易地转移至上述植物转化载 体中。下面是典型表达盒的不同成分的描述。

1.启动子

在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因植物中转基因的空间和 时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉 细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因， 此选择将反映基因产物积累的希望的位置。另外，所选的启动子可在多 种诱导条件下引导基因表达。启动子在其强度即促进转录的能力方面不 同。根据使用的宿主细胞系统，可使用本领域所知的多种适当启动子中 的任一种。例如，CaMV 35S启动子、稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启 动子可用于组成型表达。例如，来源于烟草或拟南芥的化学诱导型PR-1 启动子可用于调节型表达(见，例如，美国专利号5,689,044)。

一类优选的启动子是创伤诱导型启动子。曾经描述了可在创伤部位表 达的多种启动子。这类优选的启动子包括Stanford等人，分子普通遗传 学(Mol.Gen.Genet.)215：200-208(1989)、Xu等人，植物分子生物 学(Plant Molec.Biol.)22：573-588(1993)、Logemann等人，植物细 胞(Plant Cell)1：151-158(1989)、Rohrmeier和Lehle，植物分子生物 学22：783-792(1993)、Firek等人，植物分子生物学22：129-142(1993) 和Warner等人，植物杂志(Plant J.)3：191-201(1993))所述的启动 子。

优选的组织特异性表达模式包括绿色组织特异、根特异、茎特异及花 特异模式。适于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基 因的多种启动子，和已从单子叶植物和双子叶植物中克隆的多种这类启 动子。一种优选的启动子是磷酸烯醇羧化酶基因的玉米PEPC启动子 (Hudspeth和Grula，植物分子生物学12：579-589(1989))。用于根特 异表达的一种优选启动子是de Framond(FEBS 290：103-106(1991)；EP 0 452 269)所述的启动子，另一种优选的根特异启动子是本发明所述的 来自于T-1基因的启动子。一种优选的茎特异启动子是美国专利5,625,136 所述、能引导玉米trpA基因表达的启动子。

本发明的优选实施方案是以根特异方式表达核苷酸序列的转基因植 物。其他的优选实施方案是以创伤诱导或病原体感染诱导方式表达核苷 酸序列的转基因植物。

2.转录终止子

多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责超出转基因之外的转 录终止及其正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作 用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶 终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶及双子叶植物中。

3.增强或调节表达的序列

已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明 的基因结合使用而增强其在转基因植物中的表达。例如，多种内含子序 列如玉米Adh1基因的内含子，显示能增强表达，尤其是在单子叶植物细 胞中。另外，已知多种由病毒衍生的非翻译前导序列也可增强表达，且 其在双子叶植物细胞中特别有效。

4.编码序列优化

通过改变用于在目的作物种中最佳表达的编码序列，可以遗传改造所 选基因的编码序列。修饰编码序列以实现在特定作物种中最佳表达的方 法是众所周知的(见，例如，Perlak等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl. Acad.Sci.USA)88：3324(1991)；Koziel等人，生物技术(Bio/technol.) 11：194(1993))。

在另一个优选实施方案中，本发明的DNA分子被直接转化到质体基 因组中。质体转化技术在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818 中，在PCT申请号WO 95/16783中，和McBride等人(1994)美国国 家科学院院报91，7301-7305中有广泛描述。叶绿体转化的基本技术包括， 例如使用biolistics或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)，将 侧翼为选择性标记的克隆的质体DNA区与目的基因一起引入适当的靶组 织中。1-1.5kb的侧翼区，称为导向序列，利于与质体基因组的同源重组， 从而允许原质体特定区域的替换或修饰。最初，叶绿体16S rRNA和赋 予壮观霉素和/或链霉素抗性的rps12基因中的点突变被用作转化的选择 性标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)美国国家 科学院院报87，8526-8530；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物细 胞4，39-45)。这些标记间克隆位点的存在使得产生用于引入外源DNA 分子的质体导向载体成为可能(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBO J.12，601-606)。通过将隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替换为一 种显性选择标记——编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷转移酶的细菌 aadA基因，可获得转化率的大大提高(Svab，Z.和Maliga，P.(1993) 美国国家科学院院报90，913-917)。以前，该标记已成功用于绿藻莱因 哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体基因组的高频转化 (Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.) 19：4083-4089)。用于质体转化的其他选择性标记在本领域中公知，并包 括于本发明的范围之中。

质体表达，其中通过同源重组将基因插入每个植物细胞存在的几千个 拷贝的环形质体基因组中。在一个优选实施方案中，本发明的DNA插入 质体导向载体中或转化入希望的植物宿主的质体基因组中。获得对含有 本发明的DNA分子的质体基因组来说同质的植物，它们优先地能高表达 该DNA分子。优选地，该DNA分子编码的有义和反义RNA片段能够 配对，并能在植物质体中形成双链RNA分子，从而改变质体基因的表达。 在一个优选实施方案中，有义和反义片段在互补区中不包含任何错配。 在另一个优选实施方案中，有义和反义片段在互补区中包含至少一个错 配。在该情况中，编码RNA片段的DNA分子的DNA序列不能互相重 组。

B.植物转化载体的构建

可用于植物转化的多种转化载体为植物转化领域的技术人员所公知， 并且与本发明有关的基因可与任何这些载体结合使用。载体的选择取决 于优选的转化技术和用于转化的目标种。对于某些目标种，优选不同的 抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉 素及相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene) 19：259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304：184-187(1983))、 赋予除草剂phosphinothricin抗性的bar基因(White等人，核酸研究 18：1062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.) 79：625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger 和Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)、允许在甘露糖存在下进 行正选择的manA基因(Miles和Guest(1984)基因32：41-48；美国专 利号5,767,378)、赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))、和赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国 专利号4,940,935和5,188,642)。

1.适用于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体

许多载体可用于应用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的 转化。它们一般带有至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19 (Bevan，核酸研究(1984))的载体。适用于农杆菌转化的典型载体包 括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素 选择衍生物。(见，例如，美国专利号5,639,949)。

2.适用于非农杆菌转化的载体

不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的 需要，所以除上述包含T-DNA序列的载体外，也可应用缺少这些序列的 载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如 PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于待转化的种 的优选。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和 pSOG35(见，例如，美国专利号5,639,949)。

C.转化技术

目的DNA序列被克隆到表达系统中后，即被转化到植物细胞中。植 物转化和再生的方法在本领域中众所周知。例如，Ti质粒载体已用于外 源DNA的送递，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微 粒轰击。另外，也可用农杆菌属的细胞转化植物细胞。

用于双子叶植物的转化技术在本领域中众所周知，包括基于农杆菌的 技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括原生质体或细胞对外 源遗传物质的直接摄取。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击 介导的送递、或显微注射来完成。在所有情况中，都用本领域公知的标 准技术使转化的细胞再生为整个植物。

大多数单子叶植物种的转化现也已成为常规。优选的技术包括使用 PEG或电穿孔技术向原生质体中直接转移基因，对愈伤组织的粒子轰击， 以及农杆菌介导的转化。

利用本领域众所周知的方法，生长、繁殖并培育转化事件产生的植物， 产生具有希望的性状的后代，并获得具有希望的性状的种子。

将参照下列详细的实施例进一步描述本发明。提供这些实施例的目的 仅仅是说明，除非另外指明而不意在限制。

实施例

在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域众所周知，并被 描述于Sambrook等人的《分子克隆》，冷泉港实验室出版社，冷泉港， NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和LWEnquist的《基因融 合实验》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)，和Ausubel，F.M.等人 的《现代分子生物学方法》，由Greene Publishing Assoc.和Wiley- Interscience出版(1987)。

实施例1：萤光素酶基因表达的调节

编码有义和反义萤光素酶RNA片段的嵌合DNA分子(有义/反义构 建体)的构建

使用寡核苷酸引物ds_Luc1(5’-CGC GGA TCC TGG AAG ACG CCA AAA ACA-3’，SEQ ID NO：1；BamHI限制位点以下划线标出)和 ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3’，SEQ ID NO：2；HindIII限制位点以下划线标出)，从 pPH108质粒DNA中扩增来源于质粒pLuc+(Promega)的萤火虫萤光 素酶基因的738bp“有义”方向片段。按照使用手册在50μl反应体积中 使用TurboPfu热稳定DNA聚合酶(Stratagene)，95℃/1分钟、55℃/1.5 分钟、72℃/2分钟5个循环，随后95℃/1分钟、72℃/3.5分钟25个循 环。用类似的方法，使用寡核苷酸引物ds_Luc3(5’-CGG TCT AGA GGAAGA CGC CAA AAA CAT A-3’，SEQ ID NO：3；XbaI限制位点以下划 线标出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TAT CCG GAA TG-3’，SEQ ID NO：4；HindIII限制位点以下划线标出)， 从pPH108质粒DNA中PCR扩增来源于质粒pLuc+的萤火虫萤光素酶 基因的737bp“反义”方向片段。通过由低熔点琼脂糖(FMC)制备的 1％Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后酚-氯仿抽提切下的含有PCR产物的凝胶 片，纯化得到的DNA片段。按照标准方法，用BamHI和HindIII消化 有义产物(ds_Luc1/2)的DNA，用XbaI和HindIII消化反义产物 (ds_Luc3/2)的DNA(限制酶从New England Biolabs获得)。如上所 述凝胶纯化得到的粘末端DNA片段。通过用BamHI和HincII消化质粒 CSA104并纯化564bp DNA片段，获得含有mas 1’启动子(Velten等人 (1984)EMBO J.3：2723-2730)的DNA片段。该片段用BamHI消化， 分离并凝胶纯化含有mas 1’启动子的484bp EcoRI-BamHI亚片段。为了 构建质粒pPH169，用EcoRI和XbaI消化克隆载体pLitmus29(New England Biolabs)的DNA，并以四路反应用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将分离的片段与mas 1’启动子EcoRI-BamHI片段和有义 (BamHI-HindIII)及反义(HindIII-XbaI)ds_Luc萤光素酶基因片段 连接。

为了构建二元载体pPH170，以用于应用ds_Luc1/2/3有义/反义构建 体的农杆菌介导的植物转化，用EcoRI和XbaI消化带有用于细菌筛选 的卡那霉素抗性基因和用于转基因植物筛选的潮霉素抗性基因的二元质 粒pSGCHC1的DNA。以四路反应用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将得到的自pSGCHC1分离的11.6kb片段与mas 1’启动子 EcoRI-BamHI片段和有义(BamHI-HindIII)及反义(HindIII-XbaI) ds_Luc萤光素酶基因片段连接。

农杆菌的转化和拟南芥植物的真空渗入

通过电穿孔将质粒pPH170引入根瘤农杆菌GV3101中，筛选并扩增 转化的菌落。用带有pPH170二元T-DNA载体的农杆菌克隆真空渗入组 成型(UBQ3启动子(Norris等人(1993)PMB 21：895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5’UTR/Iuc+；pPH108)或诱导型(拟南芥PR-1启动子/luc+；pPH135， 6E系)表达萤光素酶的四至五周龄拟南芥突变系植物。在潮霉素和卡那 霉素上共筛选转化植物，并在控制的人工气候室条件下生长，以测定萤 光素酶活性。另外，在BTH诱导48小时后(BTH处理基本如Lawton 等人，植物杂志10：71-82所述)，估测pPH135-6E背景中的萤光素酶活 性。在加入萤光素底物后，用基于发光的测定法定量组织提取物中的萤 光素酶活性。也用CCD-冷成像系统(Hamamatsu)监测植物中的萤光 素酶活性。

实施例2：拟南芥GL1基因表达的调节

GL1基因编码正常毛状体(叶毛)形成起始所需的myb样转录因子 (Oppenheimer等人(1991)细胞67：483-493)。发育早期GL1表达的 敲除产生缺乏毛状体的植物。敲除表型在幼苗中易于鉴定，并且不是致 死的。构建了用于组成型表达的三种载体和用于GAL4/C1调节表达的三 种载体。对每种启动子检测的三种不同载体是GL1基因片段的有义(+) 表达、反义(-)表达和有义及反义(+/-)RNA表达。(+)和(-)载体 是用于比较其对GL1表达的影响的对照。在每种情况中，GL1序列 (GenBank保藏M79448)从碱基#739-#1781的5’片段用于载体构建。 GAL4/C1调节的表达

将GL1基因片段作为NcoI-SacI片段克隆到杂交诱导型载体构建体 pJG304-1中。质粒pJG304由pBSSK+衍生。质粒pBS SK+(Stratagene， LaJolla，CA)用SacI线性化，用绿豆核酸酶处理除去SacI位点，并用 T4连接酶再连接形成pJG201。用KpnI从pAT71中除去10XGAL4共 有结合位点/CaMV 35S最小启动子/GUS基因/CaMV终止子盒，并克隆 到pJG201的KpnI位点，形成pJG304。质粒pJG304用限制性内切核 酸酶Asp718部分消化，分离全长线性片段。该片段与摩尔过量的22个 碱基的寡核苷酸JG-L(5’-GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G-3’， SEQ ID NO：5)连接。用限制性分析鉴定该接头插入GAL4 DNA结合位 点5’的克隆，该质粒被命名为pJG304DXhoI。

通过合成5’端具有适当限制位点的PCR引物，向(+)和(-)片段 的末端添加NcoI和SacI位点。通过首先产生两个片段来产生(+/-)GL1 片段：(+)片段在5’端含有NcoI位点，在3’端含有HindIII位点，(-) 片段在5’端含有HindIII位点，在3’端含有SacI位点。通过在EcoRI位 点处连接得到的片段产生(+/-)单位。表达单位含有GAL4 DNA结合域， 随后是最小TATA序列，和方向为(+)、(-)或(+/-)的GL1基因片段 (Guyer等人(1998)遗传学(Genetics)149：633-639)。

组成型表达

使用在双子叶植物中相对较强且为组成型的农杆菌甘露氨酸合酶mas 1’启动子(Velten等人(1984)EMBO J.3：2723-2730)。如上所述，将 GL1(+)、(-)和(+/-)片段连接于pBluescript中1’启动子之后。三种 不同的表达盒作为EcoRI/SalI片段连接于pCIB200中(Uknes等人 (1993)植物细胞5：159-169)。

实施例3：胱硫醚β-裂合酶基因表达的调节

胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因编码一种实现甲硫氨酸生物合成途径中 一个步骤的蛋白质。CBL催化胱硫醚向高半胱氨酸的转化(Ravanel等 人(1998)美国国家科学院院报95：7805-7812综述)。拟南芥CBL基因 的cDNA序列已被鉴定(Ravanel等人(1995)植物分子生物学29：875- 882)。其在植物中表达调节的影响用有义RNA表达(有义构建体)、反 义RNA表达(反义构建体)和有义及反义RNA表达(有义/反义构建体) 的构建体检测。

A.反义构建体：使用二元BASTA载体pJG261，其含有pJG304DXhoI 载体的片段，并以反义方向插入CBL基因部分(核苷酸#13-1159，GenBank 保藏#L40511)。

pJG304/aCBL：用NcoI和SacI消化质粒pJG304DXhoI，切下GUS 基因。将pJG304DXhoI的GUS基因替换为也用NcoI和SacI消化的CBL PCR产物。该产物是使用引物DG354(5’-GAT CGA GCT CCA CGA GAA CTG TCT CCG-3’；SEQ ID NO：6)和DG357(5’-TCA GCC ATG GGA AGA CAA GTA CAT TGC-3’；SEQ ID NO：7)并用pFL61拟南芥 cDNA文库(Minet等人(1992)植物杂志2：417-422)作为模板产生的。 由与CBL PCR产物连接的pJG304DXhoI消化的载体构建质粒 pJG304/aCBL。

pJG261/aCBL：用XhoI酶切pJG304/aCBL，切下含有GAL4 DNA 结合位点/35S最小启动子/反义CBL/CaMV终止子融合体的盒。该盒与 XhoI消化的pJG261(Guyer等人，遗传学(1998)，149：633-639)连接， 产生pJG261/aCBL。

B.有义构建体：除了CBL片段为相反方向外，与反义构建体相同。该构 建体含有ATG起始密码子和大部分CBL ORF，并用作CBL基因表达 调节的对照。

pJG304/sCBL：用NcoI和SacI消化质粒pJG304DXhoI，切下GUS 基因。将pJG304DXhoI的GUS基因替换为也用NcoI和SacI消化的CBL PCR产物。该产物是使用引物CBL1(5’-CTT GCC ATG GCA CGA GAA CTG TCT CCG-3’；SEQ ID NO：8)和CBL2(5’-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3’；SEQ ID NO：9)并用pFL61拟南芥 cDNA文库作为模板产生的。由与CBL PCR产物连接的pJG304DXhoI 消化的载体构建质粒pJG304/sCBL。

pJG261/sCBL：用XhoI酶切pJG304/sCBL，切下含有GAL4 DNA 结合位点/35S最小启动子/有义CBL/CaMV终止子融合体的盒。该盒与 XhoI消化的pJG261连接，产生pJG261/sCBL。

C.有义/反义构建体：将有义方向的CBL基因片段(#13-1159)插入载体 pJG304DXhoI中反义方向CBL基因下游的SalI位点。两个拷贝的CBL 之间有一个大约10bp的接头。

pJG304/dsCBL：用SacI消化质粒pJG304/aCBL。插入也用SacI消 化的CBL PCR产物，使插入的CBL基因为有义方向。该产物是使用CBL2 (5’-CAT GGA GCT CGA AGA CAA GTA CAT TGC A-3’；SEQ ID NO：9)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO：10)并用pFL61拟南芥 cDNA文库作为模板产生的。通过用HindIII消化鉴定含有希望方向的插 入DNA的质粒构建体。由与CBL PCR产物连接的pJG304/aCBL消化 的载体构建质粒pJG304/dsCBL。用SURE2(Stratagene，LaJolla，CA) 作为细菌宿主稳定该构建体。

pJG261/dsCBL：用XbaI酶切pJG304/dsCBL，切下含有GAL4 DNA 结合位点/35S最小启动子/反义CBL/有义CBL/CaMV终止子融合体的 盒。该盒与SpeI消化的pJG261连接，产生pJG261/dsCBL。用XL1-BLUE MRF’(Stratagene，LaJolla，CA)作为细菌宿主部分稳定该构建体。 通过琼脂糖凝胶纯化分离该构建体的未重排的DNA。

D.GAL4结合位点/最小CaMV 35S/CBL转基因植物的产生

将所述三种pJG261/CBL构建体电转化(Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA)到根瘤农杆菌recA-株AGL1中(Lazo等人(1991)生 物/技术9：963-967)，并通过浸润(Bechtold等人(1993) C.R.Acad.Sci.Paris，316：1188-1193)转化拟南芥植物(Columbia生态 型)。在含有15mg/升Basta的发芽培养基(4.3g/升Murashige-Skoog盐、 0.5g/升Mes、1％蔗糖、10μg/升硫胺素、5μg/升吡哆醇、5μg/升烟酸、1mg/ 升肌醇，pH5.8)上筛选浸润植物的种子。

E.应用GAL4/C1反式激活蛋白与应用GAL4结合位点/最小35S启动 子对CBL抑制的比较

将含有GAL4结合位点/最小CaMV 35S启动子/CBL构建体的转基 因植物移种到土壤中并在温室中生长成熟。每个系中转基因CBL片段的 存在由PCR证实。为了检测反义构建体，用引物ASV1(5’-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3’；SEQ ID NO：11)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO：10)证实大约1200bp产物的存在。鉴定出6个含有反义构建体 的转基因系。为了检测有义构建体，用引物ASV2(5’-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3’；SEQ ID NO：12)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO：10)证实大约1200bp产物的存在。鉴定出13个含有有义构建体 的转基因系。为了检测有义/反义构建体，用引物ASV2(5’-GGA TTT TGG TTT TAG GAA TTA GAA-3’；SEQ ID NO：12)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C- 3’；SEQ ID NO：10)证实大约1200bp产物的存在。另外，为了检测有 义/反义构建体，用引物ASV1(5’-TTT GGA GAG GAC AGA CCT GC-3’；SEQ ID NO：11)和CBL3(5’-CAT CGA GCT CCT CTG TTT AAA CCA CGA GAA CTG TCT CCG TCG C-3’；SEQ ID NO：10)证 实大约1200bp产物的存在。鉴定出11个含有有义/反义构建体的转基因 系。

初级转化子上的花与纯合GAL4/C1反式激活蛋白系pAT53-103 (Guyer等人，遗传学(1998)149：633-649)的花粉杂交。将F1种子 平板接种于MS+2％蔗糖培养基中(4.3g/升Murashige-Skoog盐、0.5g/ 升Mes、2％蔗糖)。对于平板上的F1子代来说，没有一个含有反义构建 体的系显示异常的表型。对于每个平板上大约一半的F1子代，含有有义 构建体的13个系中有2个显示弱的表型。对于平板平板上的F1子代， 含有有义构建体的13个系中的另外11个不显示异常表型。对于每个平 板上大约一半的F1子代，含有有义/反义构建体的11个系中的10个显示 从弱到强不等的表型。具有强烈表型的植物不能存活，紫色加深，失去 绿色素，并且在平板上14天后不能形成叶。具有较弱表型的植物显一定 的紫色，比正常的更显淡绿，并在平板上14天后形成较小的叶。因此， 有义/反义构建体在降低内源必需基因活性方面比反义或有义构建体更有 效。

F.用两个启动子对CBL表达的调节

使CBL基因位于两个启动子之间——一个引起有义链的转录，而另 一个引起反义链的转录。利用该方法，有义和反义RNA都在植物细胞中 产生，并且两种类型的链能彼此杂交，导致双链RNA分子的形成。用 ACTIN2作为位于CBL基因两侧的启动子。对于所有这些方法，可以选 择在启动子远端使用或不使用转录终止子。如果使用转录终止子，转录 物将从一个启动子的3’末端开始，以一个方向通过CBL基因，从3’端到 5’端通过第二个启动子，终止于第二个启动子5’末端的转录终止子处。转 录终止子的使用可用来稳定所转录的RNA。

实施例4：萤光素酶基因表达的调节

编码有义和反义萤光素酶RNA片段的嵌合DNA分子(有义/反义构 建体)的构建

使用寡核苷酸引物ds_Luc1(5’-CGC GGA TCC AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3’，SEQ ID NO：13；BamHI限制位点以下划线标 出)和ds_Luc2(5’-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GATCTC-3’，SEQ ID NO：14；HindIII限制位点以下划线标出)，从pPH108 质粒DNA中扩增来源于质粒pLuc+(Promega载体pGL3，Genbank 保藏#U47295)的萤火虫萤光素酶基因的670bp“有义”方向片段。按照 使用手册在50tl反应体积中使用TurboPfu热稳定DNA聚合酶 (Stratagene)，95℃/1分钟、55℃/1.5分钟、72℃/2分钟5个循环，随 后95℃/1分钟、72℃/3.5分钟25个循环。用类似的方法，使用寡核苷 酸引物ds_Luc3(5’-CGG TCT AGA AAG ATT CAA AGT GCG CTG CTG-3’，SEQ ID NO：15；XbaI限制位点以下划线标出)和ds_Luc2 (5’-GCG AAG CTT GGC GAC GTA ATC CAC GAT CTC-3’，SEQ ID NO：16；HindIII限制位点以下线标出)，从pPH108质粒DNA中PCR 扩增来源于质粒pLuc+的萤火虫萤光素酶基因的669bp“反义”方向片 段。通过由低熔点琼脂糖(FMC)制备的1％Tris-乙酸盐凝胶电泳，随 后酚-氯仿抽提切下的含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。 按照标准方法，用BamHI和HindIII消化有义产物(ds_Luc1/2)的DNA， 用XbaI和HindIII消化反义产物(ds_Luc3/2)的DNA(限制酶从New England Biolabs获得)。如上所述凝胶纯化得到的粘末端DNA片段。然 后通过三路连接将有义BamHI-HindIII片段和反义HindIII-XbaI片段克 隆到BamHI和XbaI消化的克隆载体pLitmus28(New England Biolabs) 中。得到的构建体命名为pAdF3。用寡核苷酸bar-1(5’-GCG AAG CTT GAT CCA TGA GCC CAG AAC GA-3’，SEQ ID NO：17；HindIII限制 位点为粗体)和bar-2(5’-GCC AAG CTT CCT AGA ACG CGT GAT CTC-3’，SEQ ID NO：18；HindIII限制位点为粗体)从质粒CSA104 DNA 中扩增含有bar基因(D’Halluin等人(1992))开放阅读框的563bp DNA 片段。按照使用手册在100μl反应体积中使用Pfu热稳定DNA聚合酶 (Stratagene)，94℃/1分钟、55℃/1分钟、72℃/1分钟25个循环。经 酚抽提和乙醇沉淀纯化后，bar PCR产物用HindIII消化，并如上所述 用2％琼脂糖凝胶凝胶纯化。通过将HindIII bar DNA片段连接到用 HindIII消化的质粒pAdF3中构建质粒pAdF1。在这种无方向克隆产生 的两种可能的构建体中，pAdF1的特征在于bar基因的方向，它与pAdF3 中存在的萤光素酶基因的“有义”片段相同。从pNOV1416(由Scott Rabe 制备的构建体；NB171第122页；8-17-98)切下含有拟南芥ACT2启动 子(An等人(1996)植物杂志10：107-121)的BamHI-SalI 1.2kb DNA 片段，并克隆到用BamHI和SalI消化的pUC21中，产生构建体pAct2。 然后通过BamHI和SpeI消化从pAct2中切下ACT2启动子。

为了构建二元载体pAdF4，以用于应用ds_Luc1/2/3 RNA有义/反义 构建体的农杆菌介导的植物转化，用SpeI和SacI消化带有用于细菌筛选 的卡那霉素抗性基因和用于转基因植物筛选的潮霉素抗性基因的二元质 粒pSGCHC1的DNA。以三路反应用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将自pSGCHC1分离的11.6kb片段与Act2启动子BamHI-SpeI 片段和含有有义及反义萤光素酶基因片段的pAdF3的BamHI-SacI片段 连接。同样，以三路连接反应构建二元载体pAdF2，包括上述用SpeI和 SacI消化的11.6kb pSGCHC1载体、带有Act2启动子的SpeI-BamHI 片段和在bar基因周围含有有义和反义萤光素酶基因片段的pAdF1的 BamHI-SacI片段。

农杆菌的转化和拟南芥植物的真空渗入

通过电穿孔将质粒pAdF2和pAdF4引入根瘤农杆菌GV3101中，筛 选并扩增转化的菌落。用带有pAdF2或pAdF4二元T-DNA载体的农杆 菌克隆真空渗入组成型(UBQ3启动子(Norris等人(1993)PMB 21：895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5’UTR/luc+；pPH108)或诱导型(拟 南芥PR-1启动子/luc+；pCIB200，6E系)表达萤光素酶的四至五周龄 拟南芥突变系植物。在潮霉素和卡那霉素上共筛选转化的植物，并在控 制的人工气候室条件下生长，以测定萤光素酶活性。另外，在BTH诱导 48小时后(BTH处理基本如Lawton等人(1996)植物杂志10：71-82 所述)，估测pCIB200-6E背景中的萤光素酶活性。在加入萤光素底物后， 用基于发光的测定法定量组织提取物中的萤光素酶活性。也用CCD-冷成 像系统(Hamamatsu)监测植物中的萤光素酶活性。注意pPH108中的 萤光素酶基因来自于pGL3(Promega，Genbank保藏#U47295)； pCIB200-6E中的萤光素酶基因来自于pGL2(Promega，Genbank保藏 #X65323)。

用萤光素酶测定试剂(Promega，目录号E1501)进行萤光素酶测定。 叶在4℃下用0.1M KPO₄ pH7.8缓冲液研磨，并快速沉淀。一等份上清 液与萤光素酶测定试剂混合，并用Monolight 2010发光计(Becton Dickinson微生物系统)定量萤光素酶活性。用有义/反义构建体pAdF2 和pAdF4转化的pPH108植物的分析结果示于表1中，而用有义/反义构 建体pAdF4转化的pCIB200-6E植物的结果示于表2中。

表1：植物中萤光素酶活性的相对光单位

检测了亲本系pPH108的不同植物，以测定不同植物中萤光素酶的平 均水平。该系不是纯合的，因此显示最高水平萤光素酶的个体植物(即 植物1、2和3)可能是纯合的。

分析了在pPH108背景中含有pAdF2构建体的双转基因植物pPH108 (pAdF2)或在pPH108背景中含有pAdF4构建体的pPH108(pAdF4) 的独立T1系。萤光素酶水平随系而不同，这或许是由于有义/反义构建 体的表达水平不同。也分析了独立T1事件——用pAdF2(Columbia (pAdF2))或pAdF4(Colum bia(pAdF4))转化的野生型拟南芥Columbia 植物，作为对照。

 植物#  pPH108   pPH108   (pAdF2)   pPH108   (pAdF4)     Columbia     (pAdF2)     Columbia     (pAdF4)  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  449102  381191  338480  199141  190187  137125  134421  124596  121062  121047  115430  114916  106007  104298  92455   108452   85301   21013   9669   8098   7349   6197   4944   4482   3975   3697   3244   3146   2516   2449   2315   1850   1689   1578   1282   859   202   155   338274   116609   90545   81241   54457   32361   23929   18780   16637   15008   14901   13342   13111   12198   9538   8316   8301   5957   5110   4941   4904   4754   4642   4147   3296   3286   2885   2800   2423   1703     390     282     231     160     150     144     133     133     129     127     127     123     122     121     118     107     425     339     273     242     226     214     213     192     179     161     161     156     156     151     138     131

表2：所测个体植物中萤光素酶活性的相对光单位

培育亲本系pCIB200-6E及独立T1双转基因系pCIB200-6E (pAdF4)的小植物，并取样。也分析了独立T1事件——用构建体pAdF4 转化的野生型拟南芥Columbia，作为对照。

   植物#   pClB200-6E    pClB200-6E(pAdF4)  Columbia(pAdF4)    1    2    3    4    5    6    7    8    9    10   17983   7662   6657   5608   3340   2850   2461   2445   2349   2301    19990    5157    4753    3334    1370    736    484    478    476    373  214  217  233  263  186  291  239  227  274

实施例5：用位点特异性重组系统对目的基因表达的调节

在本发明的另一个实施方案中，用位点特异性重组系统产生有义和反 义RNA片段。位点特异性重组是一种由重组酶介导的DNA切割及再连 接方法。重组酶识别高度特异的DNA序列。某些位点特异性重组系统只 用一种蛋白质作用于其靶位点。已知有几种位点特异性重组系统如 Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix介导植物中位点特异的重组过程(Ow 和Medberry，1995，植物科学评述(Critical Reviews in Plant Sciences) 14：239-261)。根据重组底物中重组酶识别位点的构型，重组过程可导致 DNA序列的缺失、翻转或整合。一种具体的这类反应，即翻转，与本发 明有关。将两个重组酶识别位点以相反方向置于希望的基因表达盒中。 第一个识别位点置于转基因编码序列的非翻译前导区中或5’近端区域中 的启动子下游。第二个位点以与第一个位点相反的方向置于转基因编码 序列的3’非翻译区或3’近端区域中。目的DNA序列的编码或非编码链与 启动子有效连接。在重组酶的存在下，侧翼为两个方向相反的识别位点 的序列翻转。由于重组过程，目的基因的编码链和非编码链都与启动子 有效连接，有义和反义转录物都在同一染色体环境中由同一基因座位产 生，并且能形成dsRNA分子。

在某些植物中，位点特异性重组酶如Cre的高水平组成型表达可导 致异常表型(Que等人，1998，植物杂志13：401-409)。优选地，重组酶 的表达受诱导型启动子的控制。在本发明的一个实施方案中，重组酶表 达盒被置于用于引入目的转基因序列的同一转化载体中，转基因序列侧 翼为方向相反的两个重组酶识别位点。在本发明的另一个实施方案中， 含有侧翼为重组酶识别位点的转基因的转基因植物与表达重组酶的系杂 交，或用表达重组酶的载体再转化。在本发明的另一个实施方案中，用 含有诱导型重组酶表达盒的重组RNA或DNA病毒感染含有目的转基因 构建体的植物。重组病毒优选地在导致异常表型方面缺陷。在以上的实 施方案中，重组酶引起目的序列染色体拷贝的翻转，从而产生希望的 dsRNA。

在本发明的另一个实施方案中，用重组植物DNA病毒产生能形成 dsRNA的有义和反义RNA片段。一般而言，植物DNA病毒在染色体表 面复制。在一个优选实施方案中，向植物细胞中引入一种构建体以及表 达重组酶的第二种重组病毒，该构建体含有一种盒，其包含能表达靶基 因的RNA片段的DNA序列，侧翼为两个倒置的重组酶识别位点。另外， 也可在同一病毒DNA载体中连接重组酶表达盒和侧翼为倒置识别位点的 DNA序列。将病毒DNA载体引入植物中后，重组酶基因表达。重组酶 基因的表达导致侧翼为重组酶识别位点的病毒DNA序列的翻转，并导致 由目的DNA序列产生大量dsRNA，这是由于细胞中高拷贝数的病毒基 因组。优选的重组酶系统是已知可在植物中介导位点特异的重组过程的 Cre/lox、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix(Ow和Medberry，1995，植物科 学评述14：239-261，在此引用作为参考)。

实施例6：构建植物表达盒的要求

准备在转基因植物中表达的基因序列首先装配于位于适当启动子之后 并位于适当转录终止子上游的表达盒中。植物表达盒构建的所有要求适 用于本发明的DNA分子，并可用本领域众所周知的技术进行。

启动子选择

在表达盒中使用的启动子的选择将决定转基因植物中DNA分子的空 间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、 叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达DNA 分子，这种选择将反映该DNA分子编码的RNA片段生物合成的希望的 定位。另外，所选的启动子可在光诱导的或其他时间调节启动子之下引 导DNA分子的表达。另一个选择是所选的启动子可被化学调节。这将提 供仅当希望时和用化学诱导剂处理时才诱导DNA分子表达的可能性。

转录终止子

多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责转录的终止，和优选 地正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的转录 终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子、 豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物和双子叶植物。

增强或调节表达的序列

已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明 的DNA分子结合使用以增强其在转基因植物中的表达。

多种内含子序列能增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例如，发现 当被引入玉米细胞时，玉米Adh1基因的内含子显著增强位于同源启动子 之下的野生型基因的表达。发现内含子1在与氯霉素乙酰转移酶基因的 融合构建体中特别有效且增强表达(Callis等人，基因发育(Genes Develep)1：1183-1200(1987))。在相同的实验系统中，玉米bronzel基 因的内含子在增强表达方面具有相似的作用(Callis等人，同上文)。内 含子序列已被常规掺入植物转化载体，一般在非翻译前导区内。

已知病毒衍生的多种非翻译前导序列也可增强表达，且其在双子叶植 物细胞中特别有效。具体而言，烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉 米萎黄病斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列在增 强表达方面是有效的(如Gallie等人，核酸研究15：8693-8711(1987)； Skuzeski等人，植物分子生物学15：65-79(1990))。

实施例7：表达盒构建的实施例

本发明包括本发明的DNA分子在可在植物中表达的任何启动子调节 下的表达，而不论该启动子的来源如何。因此，用本领域众所周知的技 术将DNA分子插入任何表达盒中。然后可将这些表达盒容易地转移到以 下所述的植物转化载体中。

此外，本发明还包括任何植物可表达的启动子与DNA分子表达所需 或所选的其他任何序列的联合使用。这些序列包括但不限于，转录终止 子、增强表达的外来序列(如内含子[如Adh内含子1]、病毒序列[如TMV- Ω])。

组成型表达：CaMV 35S启动子

质粒pCGN1761的构建在公开的专利申请EP 0 392 225中描述。 pCGN1761含有“双”35S启动子和tml转录终止子，在启动子与终止 子之间具有唯一的EcoRI位点，并且具有pUC型骨架。构建了pCGN1761 的一种衍生物，它含有一个除已有的EcoRI位点外还包含NotI和XhoI 位点的修饰过的多接头。该衍生物被命名为pCGN1761ENX。 pCGN1761ENX可用于其多接头内cDNA序列或基因序列(包括微生物 开放阅读框序列)的克隆，其目的是在35S启动子控制下在转基因植物 中表达。该结构的完整的35S启动子-基因序列-tml终止子盒可从启动子 5’侧的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点以及终止子3’侧的XbaI、BamHI 和BglI位点切割，用于向转化载体转移。此外，可通过用HindIII、SphI、 SalI、XbaI或PstI进行5′切割，并用任何多接头限制位点(EcoRI、NotI 或XhoI)进行3′切割，切下双35S启动子片段，而替换为另一种启动子。

因此，本发明的DNA分子插入pCGN1761ENX中，用于在CaMV 35S 启动子控制下组成型表达。

化学调节型启动子下的表达

本部分描述了用所选的任何启动子替换pCGN1761ENX中的双35S 启动子；用实施例的形式描述了化学调节的PR-1a启动子。选择的启动 子优选地用限制酶从其来源切下，但另外也可用带有合适的末端限制位 点的引物进行PCR扩增。如果进行PCR扩增，则在靶载体中克隆扩增 的启动子之后，应该对启动子重新测序以检查扩增错误。从质粒pCIB1004 (见EP 0 332 104)上切下化学调节型烟草PR-1a启动子，转移至质粒 pCGN1761ENX。用NcoI酶切pCIB1004，得到的线性片段的3′突出端 通过T4 DNA聚合酶处理产生平端。然后用HindIII酶切该片段，凝胶 纯化得到的包含PR-1a启动子的片段，并克隆至已去除双35S启动子的 pCGN1761ENX中。实现方法是用XhoI酶切，用T4聚合酶产生平端， 随后用HindIII酶切，并分离较大的其中克隆有pCIB1004启动子片段的 含载体终止子片段。这产生一种pCGN1761ENX衍生物，其含有PR-1a 启动子和tml终止子以及一个具有唯一EcoRI和NotI位点的间插多接 头。

向该载体中插入本发明的DNA分子，随后将融合产物(即启动子-基 因-终止子)转移至选择的任何转化载体中，包括本申请所述的转化载体， 从而引起DNA分子的化学诱导型表达。

组成型表达：肌动蛋白启动子

已知肌动蛋白的几个同种型可在大多数细胞型中表达，因此肌动蛋白 启动子是组成型启动子的较佳选择。尤其是，稻Act1基因的启动子已被 克隆和表征(McElroy等人，植物细胞2：163-171(1990))。发现该启动 子的1.3kb片段含有在稻原生质体中表达所需的所有调节元件。此外，已 构建了多种基于Act1启动子的表达载体，以特别用于单子叶植物 (McElroy等人，分子普通遗传学231：150-160(1991))。其中掺入了Actl- 内含子1、Adhl 5′侧翼序列和(玉米乙醇脱氢酶基因的)Adhl-内含子1 和CaMV 35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和Actl内含子 或Actl 5′侧翼序列和Actl内含子的融合体。McElroy等人(分子普通遗 传学231：150-160(1991))所述的启动子表达盒易于为了本发明DNA 分子的表达而修饰，且尤其适用于单子叶植物宿主。例如，可从McElroy 结构中切下含启动子片段，用它来替换pCGN1761ENX中的双35S启动 子，然后该载体可用于特定基因序列的插入。将这样构建的融合基因转 移至合适的转化载体。在个别报道中，也发现含有第一种内含子的水稻 Actl启动子可引导在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等人，植物 细胞报道(Plant Cell Rep.)12：506-509(1993))。

将本发明的DNA分子插入该启动子下游，随后将融合产物(即启动 子-基因-终止子)转移到选择的任何转化载体中，包括本申请书中所述的 载体。

组成型表达：遍在蛋白启动平

遍在蛋白是已知可在多种细胞型中积累的另一种基因产物，其启动子 已从几个种中克隆，用于转基因植物(如向日葵-Binet等人，植物科学 79：87-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物学12：619-632 (1989))。已在转基因单子叶系统中研究了玉米遍在蛋白，并且其序列 和为单子叶植物转化构建的载体公开于专利公开文本EP 0 342 926中。 另外，Taylor等人(植物细胞报道12：491-495(1993))描述了一种载体 (pAHC25)，其包含玉米遍在蛋白启动子和第一种内含子，经微粒轰击 引入时在多种单子叶植物细胞悬液中具有高活性。遍在蛋白启动子适于 在转基因植物尤其单子叶植物中表达本发明的DNA分子。合适的载体是 通过引入适当遍在蛋白启动子和/或内含子序列而修饰的pAHC25衍生物 或本申请所述的任何转化载体。

因此将本发明的DNA分子插入这类启动子中，融合产物(即启动子- 基因-终止子)用于植物转化，引起DNA分子的组成型表达。

根特异的表达

本发明的DNA分子的一种优选表达模式是根表达。只在根组织中表 达核苷酸序列具有只改变根中靶基因的表达而不同时改变叶和花组织及 种子中的表达的优点。一种合适的根启动子是由de Framond(FEBS 290：103-106(1991))并在公开的专利申请EP 0 452 269中描述的启动子。 该启动子被转移至合适的载体如pCGN1761ENX中，并向该载体中插入 DNA分子。随后将完整的启动子-基因-终止子盒转移至目的转化载体中。

创伤诱导型启动子

已描述了许多这类启动子(例如，Xu等人，植物分子生物学 22：573-588(1993)，Logemann等人，植物细胞1：151-158(1989)， Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22：783-792(1993)，Firek等人， 植物分子生物学22：129-142(1993)，Warner等人，植物杂志3：191-201 (1993))，且均都适用于本发明。Logemann等人(同上文)描述了双子 叶植物马铃薯wun1基因的5′上游序列。Xu等人(同上文)证明双子叶 植物马铃薯的创伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物水稻中有活性。此 外，Rohrmeier和Lehle(同上文)描述了玉米Wipl cDNA的克隆，其 为创伤诱导型，并可用来使用标准技术分离同源启动子。类似地，Firek 等人(同上文)和Warner等人(同上文)描述了单子叶植物药用芦笋 (Asparagus officinalis)的创伤诱导基因，它在局部创伤和病原体侵入 部位表达。使用本领域众所周知的克隆技术，可将这些启动子转移至适 当载体中，与本发明的DNA分子融合，并用来在害虫侵害部位表达这些 基因。

木髓偏好的表达

专利申请WO 93/07278描述了玉米trpA基因的分离，该基因优先在 木髓细胞中表达。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转 移至如pCGN1761的载体中，替换35S启动子，并用来以木髓偏好的方 式引导本发明的DNA分子的表达。实际上，包含木髓偏好的启动子或其 部分的片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。DNA 分子的木髓偏好的表达通过向该载体中插入DNA分子而实现。

花粉特异的表达

专利申请WO 93/07278另外描述了在花粉细胞中表达的玉米钙依赖 的蛋白激酶(CDPK)基因的分离。该基因序列和启动子从转录起点延伸 可达1400bp。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至 如pCGN1761的载体中，替换35S启动子，并用来以花粉特异的方式引 导本发明的DNA分子的表达。实际上，包含花粉特异的启动子或其部分 的片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。

叶特异的表达

Hudspeth和Grula(植物分子生物学12：579-589(1989))描述了 一种编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。应用标准分子生物学技 术，该基因的启动子可用来以叶特异的方式引导本发明的DNA分子在转 基因植物中的表达。

实施例8：植物转化载体的构建

许多转化载体可用于植物转化，并且本发明的DNA分子可插入上述 任何表达盒中，使其能在适当条件下在希望的细胞中表达该DNA分子。 然后将含核苷酸序列的表达盒掺入以下所述的任一适当转化载体中。

所用载体的选择将取决于优选的转化技术和用于转化的目标物种。对 于某些目标物种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使 用的选择标记包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing 和Vierra，基因19：259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature) 304：184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等 人，核酸研究18：1062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学 79：625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger 和Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)和赋予氨甲喋呤抗性的 dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)：1099-1104(1983))。

(1)适用于农杆菌转化的载体的构建

许多载体可用于应用根瘤农杆菌的转化。它们一般具有至少一个T- DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))的载 体。以下描述了两种典型载体的构建。

pCIB200和pCIB2001的构建

二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建农杆菌使用的重组载体， 按以下方法构建。通过用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski， 细菌学杂志164：446-455(1985))切下四环素抗性基因，随后插入一个 来自pUC4K的带有NPTII的AccI片段(Messing和Vierra，基因 19：259-268(1982)；Bevan等人，自然304：184-187(1983)；McBride 等人，植物分子生物学14：266-276(1990))，产生pTJS75kan。使XhoI 接头与pCIB7的EcoRV片段连接，该片段包含左和右T-DNA边界、植 物选择性nos/nptII嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等人，基因 53：153-161(1987))，并将XhoI消化片段克隆入SalI消化的pTJS75kan 中产生pCIB200(参见EP 0 332 104)。pCIB200含有下列单一多接头限 制位点：EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200 的衍生物，它是通过向多接头中插入其他限制位点而产生的。pCIB2001 多接头的单一限制位点是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、 BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除包含这些单一限制位点外，pCIB2001 还有植物和细菌卡那霉素的选择性、用于农杆菌介导的转化的左和右T- DNA边界、在大肠杆菌和其他宿主之间转移的RK2衍生的trfA功能以 及也源自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适用于含有其自 身调节信号的植物表达盒的克隆。

优选地使用多接头，将含本发明的DNA分子的上述任一种植物表达 盒插入pCIB2001中。

pCIB10及其潮霉素筛选衍生物的构建

二元载体pCIB10含有编码植物中筛选所需卡那霉素抗性的基因、T- DNA右和左边界序列，并且掺入宽宿主范围的质粒pRK252的序列，使 其在大肠杆菌和农杆菌中均可复制。其构建由Rothstein等人描述(基因 53：153-161(1987))。已构建了pCIB10的多种衍生物，其中掺入了Gritz 等人(基因25：179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸转移酶基因。这些 衍生物能使在仅有潮霉素(pCIB743)或同时有潮霉素和卡那霉素 (pCIB715、pCIB717)时筛选转基因植物细胞。该载体用来转化含有本 发明的DNA分子的表达盒。

(2)适用于非农杆菌转化的载体的构建

不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的 需要，所以除如上所述包含T-DNA序列的载体外，还可使用缺少这些序 列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄 取(如PEG和电穿孔)、显微注射的转化或花粉转化(美国专利 5,629,283)。载体的选择主要取决于待转化种的优选。下面，描述了某些 典型载体的构建。

pCIB3064的构建

pCIB3064是一种pUC衍生载体，适用于与除草剂basta(或 phosphinothricin)筛选结合的直接基因转移技术。质粒pCIB246包含与 大肠杆菌GUS基因有效地融合的CaMV 35S启动子和CaMV 35S转录 终止子，在PCT公开申请WO 93/07278中有述。该载体的35S启动子 在起始位点5′端包含两个ATG序列。用标准PCR技术突变这些位点以 去除ATG，产生限制位点SspI和PvuII。新限制位点距唯一的SalI位点 96bp和37bp，距实际起始位点101bp和42bp。产生的pCIB246的衍生 物命名为pCIB3025。然后通过SalI和SacI消化从pCIB3025上切下GUS 基因，使末端变为平端，并再连接，产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82 从John Innes Centre，Norwich获得，切下含有产绿色链霉菌 (Streptomyces viridochromogenes)bar基因的400bp的SmaI片段， 将其插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等人，EMBO J.6：2519-2523 (1987))。这产生了pCIB3064，其含有位于CaMV 35S启动子和终止 子控制下的用于除草剂筛选的bar基因、氨苄青霉素抗性基因(用于在 大肠杆菌中筛选)和具有单一SphI、PstI、HindIII、BamHI位点的多 接头。该载体适用于含有自身调节信号的植物表达盒的克隆，用来引导 本发明的DNA分子的表达。

pSOG19知pSOG35的构建

pSOG35是一种应用大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选 择性标记提供氨甲喋呤抗性的转化载体。用PCR扩增35S启动子 (～800bp)、玉米Adh1基因的内含子6(～550bp)和pSOG10的18bp 的GUS非翻译前导序列。也PCR扩增编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II 型基因的250bp片段，将这两个PCR片段与pBI221(Clontech)的包 含pUC19载体骨架和胭脂氨酸合酶终止子的SacI-PstI片段装配。这些 片段的装配产生pSOG19，它含有与内含子6序列融合的35S启动子、GUS 前导序列、DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子。pSOG19中的GUS前导 序列替换为玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)的前导序列产生载体 pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因，并且 具有可用于克隆外源序列尤其是本发明的DNA分子的HindIII、SphI、 PstI和EcoRI位点。

实施例9：叶绿体转化

转化载体

为了在植物质体中表达本发明的DNA分子，使用质体转化载体 pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将DNA分子插入pPH143中，从 而替换PROTOX编码序列。该载体然后用于质体转化和根据壮观霉素抗 性的转化子筛选。另外，将DNA分子插入pPH143中，使其替换aadH 基因。在这种情况中，根据对PROTOX抑制剂的抗性筛选转化子。

叶绿体转化

每板七个，按1″环形排列于T琼脂培养基上，使烟草c.v.′Xanthi nc′ 的种子萌发，播种12-14天后，基本如所述(Svab，Z.和Maliga，P.(1993) PNAS 90，913-917)，用质粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm 钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轰击。将轰击的秧苗在T培养 基上温育两天，之后切下叶子，远轴侧朝上置于亮光下(350-500μmol 光子/m²/s)，置于含有500μg/ml壮观霉素二盐酸(Sigma，St.Louis，MO) 的RMOP培养基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990) PNAS 87，8526-8530)。轰击三至八周后在漂白叶下出现的抗性苗被亚克 隆至相同的选择培养基上，使之形成愈伤组织，分离并亚克隆第二批苗。 用Southern印迹标准技术(Sambrook等人(1989)《分子克隆实验 室手册》，冷泉港实验室，冷泉港)评价独立亚克隆中转化的质体基因组 拷贝的完全分离(同质体状态)。BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA (Mettler，I.J.(1987)植物分子生物学报道5，346-349)在1％Tris- 硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移至尼龙膜上(Amersham)，用³²P- 标记的随机引物DNA序列探查，该序列对应于pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，包含一部分rps7/12质体导向序列。同质的 苗在含壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等人(1994)PNAS 91， 7301-7305)上无菌生根，并转移到温室中。

序列表

<110>Novartis AG

<120>基因表达的调节

<130>S-30496A

<140>

<141>

<150>US 09/084,942

<151>1998-05-26

<160>18

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描还：寡核苷酸

<400>1

cgcggatcct ggaagacgcc aaaaaca                                    27

<210>2

<211>38    

<212>DNA

<213>人工序列

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

<400>2

cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg                        38

<210>3

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<213>人工序列

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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<213>人工序列

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg                        38

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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gtacctcgag tctagactcg ag                                         22

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<212>DNA

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gatcgagctc cacgagaact gtctccg                                    27

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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tcagccatgg gaagacaagt acattgc                                    27

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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cttgccatgg cacgagaact gtctccg                                 27

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catggagctc gaagacaagt acattgca                                28

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catcgagctc ctctgtttaa accacgagaa ctgtctccgt cgc               43

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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ggattttggt tttaggaatt agaa                                    24

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<223>人工序列描述：寡核苷酸

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cgcggatcca agattcaaag tgcgctgctg                               30

<210>14

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：寡核苷酸

<400>14

gcgaagcttg gcgacgtaat ccacgatctc                               30

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：寡核苷酸

<400>15

cggtctagaa agattcaaag tgcgctgctg                               30

<210>16

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：寡核苷酸

<400>16

gcgaagcttg gcgacgtaat ccacgatctc                               30

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：寡核苷酸

<400>17

gcgaagcttg atccatgagc ccagaacga                            29

<210>18

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：寡核苷酸

<400>18

gccaagcttc ctagaacgcg tgatctc                              27