一种藏药榜嘎提取物及其在制备抗病毒药物中的应用

摘要

本发明涉及了一种榜嘎提取物及其在制备抗病毒药物中的应用。本发明所提供的榜嘎提取物本不但能够抑制多种病原细菌，而且可以通过抑制病毒吸附、直接灭活病毒、抑制病毒增殖等多环节发挥明显的抗病毒作用，故而该提取物可以在制备抗菌、抗病毒药物中应用。同时，也可以在食品、保健品和化妆品中应用。本发明提供的榜嘎提取物可以在制备抗菌、抗病毒药物中以单味或者复方方式制备成药物组合物，尤其是单味或者复方方式在制备治疗生殖器疱疹的药物组合物中应用。同时，也可将其掺入食品、保健品和化妆品中应用。榜嘎提取物原料丰富、价廉、萃取工艺简单，成本低，并可很方便地做成各种剂型。具有重要的开发与应用前景。

说明书

技术领域

本发明为藏药榜嘎提取物及其该提取物在制备抗菌、抗病毒药物中的应用，属于民族药学领域。

背景技术

目前大量使用抗生素引起的细菌耐药性不断上升已成为全世界共同关注的难题之一。尤其是金黄色葡萄球菌的耐药率已达90％以上。单纯疱疹病毒II型主要引起生殖器部位皮肤粘膜感染。病毒经呼吸道、口腔、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体，潜居于人体正常粘膜、血液、唾液及感觉神经节细胞内。当机体抵抗力下降时，如发热、胃肠功能紊乱、月经、妊娠、病灶感染和情绪改变时，体内潜伏的HSV-II被激活而发病^[11]。合成药物在单纯疱疹性的治疗中较肯定的抗病毒药物是ACV，但近年来临床不断发现ACV的耐药株，且耐药性随药物疗程的延长有增长趋势。

因此，开发新的高效低毒的抗菌、抗病毒药物具有广阔的前景，传统中药的多靶点作用机制、低毒副作用、易于代谢、无耐药性等优点使它成为筛选高效低毒的抗菌、抗病毒药物的热点。

藏药材生长在海拔3000米以上，生境独特，药理活性强，是新药研究的宝库。藏药榜嘎为毛茛科植物船盔乌头及甘青乌头的全草。生于高山山地草坡或湿润草地。分布于陕西、甘肃南部、青海东部、四川西部、云南西北部及西藏东部。味苦，性凉，有小毒。有清热解毒的功能。用于传染病发热，肝、胆热病，肺热，肠热，流行性感冒，食物中毒。

综观国内外的报道，均未见藏药榜嘎的乙醇总提取物、挥发油和生物碱类提取物抗菌、抗病毒作用研究。本发明提供了藏药榜嘎乙醇总提取物、挥发油和生物碱类提取物以及这些提取物在制备抗菌、抗病毒药物中应用。与现有抗菌、抗病毒合成药相比，藏药榜嘎提取物药效作用强，毒性低，安全可靠，而且藏药榜嘎原料丰富、价廉、萃取工艺简单、制备成本低，可以制成各种剂型。

发明目的：

提供藏药榜嘎乙醇总提取物、挥发油和生物碱类提取物及其这些提取物在制备抗菌抗病毒药物中的应用。

发明内容：

本发明提取物制备方法如下

1、藏药榜嘎乙醇总提取物的制备

藏药榜嘎的全草粉碎成粗粉，以95％乙醇为溶剂回流提取，抽滤除渣，经减压浓缩至无醇味，得到乙醇总提取物。

2、藏药榜嘎挥发油的制备

取藏药榜嘎干燥全草，粉碎，以95％乙醇提取，回收乙醇，提取浸膏以水悬溶，用石油醚萃取，回收石油醚，石油醚萃取物加入乙醚溶解，加入蒸馏水进行水蒸汽蒸馏，收集馏出液，用乙醚萃取，合并乙醚萃取液，回收乙醚，用无水硫酸钠脱水，得黄绿色油状物，有特殊香味，备用。本工艺中是以水蒸气蒸馏为例，还可以是CO₂超临界萃取，这是本领域技术人员所能够理解的。

3、藏药榜嘎脂溶性生物碱提取

藏药榜嘎乙醇总提取物加适量5％盐酸搅拌溶解，调至pH＝3，静置过夜，过滤除去不溶杂质，滤液用石油醚、乙醚分别萃取3次除去杂质，将酸性母液加浓氨水调pH＝10用氯仿萃取，合并各次氯仿溶液，减压除去氯仿得脂溶性生物碱。

4、藏药榜嘎水溶性生物碱提取

藏药榜嘎乙醇总提取物加适量5％盐酸搅拌溶解，调至pH＝3，静置过夜，过滤除去不溶杂质，滤液用石油醚、乙醚分别萃取3次除去杂质，将酸性母液加浓氨水调pH＝10用氯仿萃取后的母液用正丁醇萃取，合并各次正丁醇溶液，减压除去正丁醇得水溶性生物碱。

本发明所提供的上述藏药榜嘎提取物不但能够抑制多种病原细菌，而且可以在抑制病毒吸附、直接灭活病毒、抑制病毒增殖等多环节发挥明显的抗病毒作用，故而该提取物可以在制备抗菌、抗病毒药物中应用。本发明提供的藏药榜嘎提取物可以在制备抗菌、抗病毒药物中以单味或者复方方式制备成药物组合物，尤其是单味或者复方方式在制备治疗生殖器疱疹的药物组合物中应用。同时，也可以在食品、保健品和化妆品中应用。由于软胶囊、硬胶囊、滴丸、片剂、分散片、颗粒剂、注射液、口服液、栓剂等药物剂型的制备是本领域的研究人员所能理解的，可以方便地实现藏药榜嘎提取物与相应载体组合而制备成各种药物剂型：软胶囊、或硬胶囊、或滴丸、或片剂、或分散片、或颗粒剂、或注射液、或口服液、或栓剂。也可将其掺入食品、保健品和化妆品中应用。

具体实施方式：

实施例1藏药榜嘎提取物抗菌作用

1、菌种和培养基

实验菌种有甘肃省疾病控制中心和甘肃省临床检验中心提供。列表如下：

属                     菌种

葡萄球菌属             金黄色葡萄球菌ATCC 25923(Staphylococcus aureus)

                       耐药表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)，

大肠埃希菌属           杆菌ATCC 25922(Escherichia coli)，

                       粪肠球菌(Enterococcus faecalis)

芽孢杆菌属             枯草杆菌(Bacillus subtilis)

                       蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)

念珠菌属               白色念球菌(Candida albicans)

实验用培养基：细菌MH培养基，真菌PDA培养基均购自中国药品生物制品检定所。

2抑菌效果检测方法：

2.1抑菌效果用杯碟法测定抑菌圈大小

活化菌液用无菌生理盐水稀释至10⁵～10⁶cfu/ml备用。加0.2ml菌液至干燥的MH培养基平板，涂匀。放置5min，使培养基充分吸收菌液。每个平板放置已灭菌的牛津杯6个，放置5min，使牛津杯紧密吸附于培养基表面。牛津杯中加入0.1g/ml水提物物100ul。阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑。阳性对照细菌用浓度均为40μg/ml左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为200μg/ml氟康唑，均加100ul。阴性对照加无菌水。然后将平板置于37℃恒温培养箱培养24h(白色念珠球菌48h)，出用卡尺量取抑菌圈直径，计算平均值，用抑菌圈直径D表示抑菌活性。抑菌效果判断标准为：D≤8mm为不敏感，8mm＜D≤13mm为低度敏感，13mm＜D≤19mm为中度敏感，D＞19mm为高度敏感。

2.2最小抑菌浓度MIC的测定采用微量稀释板法

试验菌液浓度为10⁶cfu/ml。吸取稀释好的菌液加于96孔细胞培养板中，每孔100ul，每种药物100ul，依次对比稀释10孔，最后一孔不加药物(仅加培养基和细菌)加入稀释菌液100ul，为细菌生长对照孔。留一列孔不加细菌(仅加培养基和药物)作药物对照孔，阳性对照用左氧氟沙星和氟康唑，按说明做倍比稀释。置于振荡器上振荡1min，使孔内溶液充分混匀后，微孔板加盖并放在铺有湿纱布的方形搪瓷盘中，于37℃温箱中孵育24h(白色念珠球菌48h)，眼观无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。

3抑菌效果

表1：不同藏药榜嘎提取物抑菌圈(mm)

  乙醇总提取物  挥发油  脂溶性生物碱  水溶性生物碱  阳性对照  金黄色葡萄球菌  11  10  16  16  26  耐药表皮葡萄球菌  9  13  14  11  29  大肠杆菌  12  11  17  15  25  粪肠球菌  16  15  15  13  25  枯草杆菌  17  14  16  11  26  蜡状芽孢杆菌  19  12  15  11  26  白色念珠球菌  18  12  16  14  10

注：a藏药榜嘎乙醇总提取物、挥发油和生物碱类加入量为1mg/杯，b阳性对照细菌用浓度均为40μg/ml左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为200μg/ml氟康唑，均加100ul。5％DMSO为阴性对照。

表2：不同藏药榜嘎提取物最小抑菌浓度(MIC)(单位mg/ml)

  乙醇总提取物  挥发油  脂溶性生物碱  水溶性生物碱  阳性对照  金黄色葡萄球菌  6.25  0.5  18.75  3.125  0.002  耐药表皮葡萄球菌  12.5  0.5  18.75  3.125  0.002  大肠杆菌  25  1  9.375  6.25  0.004  粪肠球菌  12.5  1  18.75  3.125  0.002  枯草杆菌  6.25  0.5  18.75  3.125  0.002  蜡状芽孢杆菌  25  1  18.75  6.25  0.004  白色念珠球菌  12.5  0.5  4.688  3.125  0.1

注：阳性对照细菌用左氧氟沙星，白色念珠菌用氟康唑，均加100ul。5％DMSO为阴性对照。

结果表明：藏药榜嘎乙醇总提取物、挥发油和生物碱类提取物具有广谱抗菌和杀菌作用。对革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌、耐药性表皮葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌；革兰氏阴性细菌：大肠杆菌、粪肠球菌；深部感染真菌白色念珠菌都有杀灭和抑制生长的作用，具有重要的实践意义和应用价值，可在制备有抑菌和/或杀菌作用的食品、保健品、化妆品和药品中应用。

实施例2：藏药榜嘎提取物抗病毒作用

1、实验材料

病毒：HSV-II型(3代)20060913，兰州生物制品研究所疫苗研究室提供(herpessimplex virus，HSV-II)

细胞：非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)兰州生物制品研究所提供。培养用DMEM培养基+7％牛血清。

动物：清洁级昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22g，购于兰州生物制品研究所动物房。

试剂：噻唑蓝(MTT，Fluka Biochemika公司)，二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO，Sigma公司生产)，DMEM(GIBCO公司)，标准新生牛血清(中美合资兰州民海生物工程有限公司)，注射用阿昔洛韦(ACV，9-(2-羟乙氧甲基-)鸟嘌呤，武汉普生制药有限公司，生产批号060811国药准字H42020129)。

2、实验方法

2.1体外实验

2.1.1药物细胞毒性测定(MTT法)

将细胞悬液以8×10⁵/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl，37℃，5％CO₂，100％相对湿度培养24h。总提取物、脂溶性生物碱和水溶性生物碱液均倍比稀释至以下6个浓度：16，8，4，2，1，0.5mg/ml，加入细胞悬液孔中，每一药物浓度重复4孔，另设正常细胞对照。相同条件下继续培养33h，观察细胞病变(CPE)情况，并以MTT法检测细胞存活率。

2.1.2病毒毒力测定(蚀斑法)

将细胞悬液以8×10⁵/ml密度接种于24孔细胞培养板中，每孔1mL，37℃，5％CO₂，100％相对湿度培养24h。病毒稀释至以下6个浓度：10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，加入细胞悬液孔中，每一药物浓度重复4孔，另设正常细胞对照，甲基纤维素覆盖物覆盖，相同条件下继续培养72h，结晶紫染色，计数。感染性病毒量(PFU/ml)＝(每孔内斑数/每孔接种病毒量ml)×病毒稀释倍数

2.1.3药物对HSV-II侵入细胞的阻断作用(蚀斑法)

将供试品液与HSV-II等体积混合，以此病毒药物混合液感染Vero细胞。37℃，5％CO₂吸附90min，洗涤，加细胞维持液置37℃，5％CO₂培养。每日观察CPE，72h后以蚀斑法检测病毒抑制率。采用治疗指数(TI)作为评价指标来衡量药物对病毒的抑制效力。治疗指数(TI)＝半数毒性浓度(TC50)/半数抑制浓(IC50)。每一药物浓度重复4孔，同时设置正常细胞对照、药物对照及病毒对照。

2.1.4药物对HSV-II的直接灭活作用(蚀斑法)

将供试品液与HSV-II等体积混合，37℃作用90min后，以此病毒药物混合液感染Vero细胞。37℃，5％CO₂吸附90min，洗涤，同上法培养与检查。

2.1.5药物对病毒颗粒增殖的抑制作用(蚀斑法)

将病毒感染细胞，吸附90min后洗涤，加入不同浓度的供试品液，同上法培养与检查。病毒抑制率(％)＝(病毒对照组平均出斑数-给药试验组平均出斑数)/病毒对照组平均出斑数

2.2体内实验

2.2.1药物对小鼠的急性毒性测定

清洁级昆明种小鼠随机分组，每组6只，雌雄各半。根据体外实验结果，选择抑制HSVII生物合成活性较好的总提取物，以400，500，625，800，1000，1250mg/kg剂量灌胃给药，另设阴性对照组，给予等体积的生理盐水。正常进食进水，连续观察10d，记录小鼠死亡情况并计算LD50。

2.2.2病毒脑腔模型毒力测定

清洁级昆明种小鼠随机分组每组10只，雌雄各半。感染部位常规消毒后，经右脑室注射病毒，病毒稀释至以下6个浓度：10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-6，10^-7，感染剂量为每只0.05mL。正常进食进水，连续观察10d，记录小鼠死亡情况并用Reed-Muench法计算LD50。

2.2.3药物对脑腔感染HSV-II小鼠的保护作用

清洁级昆明种小鼠随机分组每组10只，雌雄各半。感染部位常规消毒后，经右脑室注射病毒，病毒感染后24h，给药治疗。按药物LD50的1/2～1/4作为药物体内实验的高实验剂量，LD50的1/12～1/16作为低实验剂量，每部位药物设高低2个剂量组。不用药物的对照组(病毒对照组、正常对照组)，连续灌胃给药5d，观察动物发病和死亡情况，连续30d。

3、实验结果

3.1体外实验

3.1.1.药物细胞毒性测定

表3藏药榜嘎各有效部位对Vero细胞的毒性(单位：mg/ml)

  总浸膏  脂溶性生物碱  水溶性生物碱  TC50  2.63  2.77  2.77

供试品液对Vero细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢、颗粒较多、折光性差、形态改变、部分细胞破碎脱落。由于细胞代谢活性降低或死亡，MTT法检测到的活细胞数减少。

3.1.2病毒毒力测定(蚀斑法)

Vero细胞对HSV-II较敏感，HSV-II感染所致的Vero细胞细胞病变效应CPE特征为圆缩肿胀、相互融合形成葡萄串状或星状，甚至部分细胞脱落，形成病灶。蚀斑计数得HSV-II型(3代)20060913感染性病毒量(PFU/ml)为10^7.57PFU/ml，该HSV-II病毒采用10^-5时每孔出斑数约为40个，容易计数，故采用10^-5作为后续实验的病毒稀释度。

3.1.3药物对HSV-II侵入细胞的阻断作用

表4藏药榜嘎各有效部位对HSV-II侵入Vero细胞的阻断作用

3.1.4药物对HSV-II的直接杀伤作用

表5.藏药榜嘎各有效部位对HSV-II的直接灭活作用

3.1.5药物对HSV-II病毒颗粒增殖的抑制作用(蚀斑法)

表6.藏药榜嘎各有效部位对HSV-II病毒颗粒增殖的抑制作用

3.2体内实验

3.2.1药物对小鼠的急性毒性测定

最大剂量组小鼠灌胃后由于药物毒性相对较强，小鼠即刻死亡。剂量降低，小鼠存活率升高，存活时间增长并得到藏药榜嘎总提取物LD50＝512mg/kg。

3.2.2病毒脑腔模型毒力测定

小鼠感染HSV-II病毒后第7～10天出现症状，饮食量减少、体重下降、耸毛、蜷缩，感染鼠发病后3～7d内死亡。用Reed-Muench法计算LD50＝10^-1.38，由此，实验时采用10^-1稀释度接种，此为使动物全部死亡的最小稀释度。

3.2.3药物对脑腔感染HSV-II小鼠的保护作用

表7.各组平均存活率和存活时间

  分组  存活率(％)  存活时间(t/d)  病毒对照  0  7  低剂量组  0  8  高剂量组  10％  30

实施例2显示藏药榜嘎乙醇总提取物和生物碱类提取物通过多种有效部位，多环节、多途径地发挥协同作用而表现出抗病毒功效。药物对HSV-II侵入细胞的阻断作用和直接杀灭病毒是藏药榜嘎体外抗病毒的主要作用途径。HSV-II是有包膜的病毒，最外层的包膜由脂质和糖蛋白组成，其中任何一种成分改变，即可使包膜变性，从而灭活病毒。实验结果表明藏药榜嘎各成分对HSV-II的直接灭活作用较强，尤其是总提取物和水溶性生物碱直接灭活HSV-II的作用比ACV更加显著。故推测这些化学成分能使病毒包膜变性以灭活病毒。HSV-II侵入细胞的阻断作用研究表明，藏药榜嘎不仅有抗病毒活性，还具有一定程度保护细胞防止病毒侵入的作用。利用HSV-II脑炎模型研究藏药榜嘎总提取物对HSV-II感染小鼠的保护作用，结果表明总提取物表现出一定的抗病毒活性。总提取物各剂量治疗组与未经治疗的病毒感染小鼠相比，存活率有所提高，存活时间有所延长。这些结果具有重要的实践意义和应用价值，可在制备抗病毒的食品、保健品、化妆品和药品中应用。