使用病毒检测样本中活细胞的方法

摘要

本发明涉及样本内活细胞(例如细菌细胞)的检测方法，所述方法包括(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下，将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸。

说明书

本申请涉及样本内存在的活细胞的检测方法，以及用于该方法 的试剂盒。

在公共安全领域，对细菌和其它生物的快速检测是非常重要的。 特别重要的是，在食品工业中务必使食品和饮料不会受到有害细菌 和其它微生物(例如大肠杆菌0157)的污染。

在兽医学和医学诊断领域，快速鉴定潜在的有害细菌和其它生 物，使感染得到控制，动物或病人得到正确治疗也是非常重要的。 使医药制品、化妆品和兽医制品免受细菌等有害污染物污染也是重 要的。

另外，某些细菌和其它生物(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)) 具有用作生物武器的潜在危害。因此，能够快速检出样本中存在的 所述生物体是重要的。例如，据估计初期吸入炭疽芽孢杆菌的芽孢 后仅有6小时窗口期，这期间可进行有效治疗。

目前有多种可用于检测细菌和其它生物的方法。

例如，采用传统培养方法可检测样本中存在的细菌。然而，用 这些方法常常遇到的一个难题就是样本中的生物浓度普遍很低。因 此，为了将生物培养至可检测水平，在进行试验前需要将样本孵育 一定时间。在公共卫生处于危险的许多情况下，这种延误是不可接 受的。

另一方面，PCR和其它核酸扩增技术为检测细菌和其它生物的 存在提供了一种基于DNA的快速而灵敏的检测方法。这些技术通常 依赖于使用扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)来检测细菌DNA。

然而，存在着与所述扩增技术相关的缺点，这是因为DNA是一 种具有顽强生命力的化学物质，当宿主细胞死亡时它也能完整地幸 存下来。

例如，如果家禽产品已被致病菌例如沙门氏菌污染，那么煮熟 后将认为食品是安全的。基于培养的传统检测方法将显示食品是安 全的，但方法本身需花费长时间进行，而DNA实时快速法将显示假 阳性结果，这是因为沙门氏菌DNA仍然存在于样本中。

另一方面，WO2003/035889描述了用含有标记序列的修饰噬菌 体检测活细胞的技术。在该方法中，将修饰噬菌体导入待测样本中。 如果存在活细胞，那么噬菌体能够使用细胞机器进行复制，结果检 测到标记序列增多。

然而，存在着与该技术相关的缺点。

首先，既然噬菌体必须经特异性工程改造使其含有所需标记序 列，那么需要插入标记序列就必然增加了检测的复杂性。因此，所 述修饰噬菌体将增加所述检测的成本和复杂性。

另外，既然将标记序列加入待测样本中，由于它在噬菌体中存 在，因此有必要定量检测样本中该标记序列量的任何升高。这意味 着必须孵育足够长时间以确保不会产生假阳性结果。

因此，有必要提供一种可靠的检测方法来应对潜在生物危害， 该方法要容易操作，且可靠性方面要达到低水平假阳性或假阴性结 果。

因此，本发明提供样本内活细胞的检测方法，所述方法包括：

(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下， 将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；

(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸。

通过检测病毒复制特异性获得的核酸，有可能确定样本中存在 活细胞(只是相对死细胞而言)。

在一个具体的实施方案中，本发明提供样本内活细胞的检测方 法，所述方法包括：

(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下， 将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；

(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸，假如当病毒 为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么被检测的核酸为病毒在 细胞内复制所独特产生的核酸。

为了确保步骤(i)期间所有活细胞都被感染，可将活细胞作预处 理，例如加入病毒前，使其在例如37℃-42℃温度下孵育合适时间， 例如2.5-4.5小时。例如，如果样本中含有应激菌，例如由于保存或 分离过程(如免疫磁性分离法(IMS))，那么进行预处理就是特别有必 要的。然后可将它们在孵育温度下保持一段时间，使得可以发生感 染和某些复制。

所用病毒可为单链(ss)或双链(ds)RNA或DNA病毒。

病毒本身可存在步骤(ii)中被检测的核酸。既然这样，有必要定 量检测样本中该核酸量的升高。因为不必修饰病毒使其包含标记序 列，所以该方法优于WO03/035889中所述的方法。

然而，优选病毒本身并不含有步骤(ii)中被检测的核酸，该核酸 是病毒在细胞内复制所独特产生的。因为需要利用样本内的活细胞 来产生病毒，这意味着检测到任何具有该特定序列的核酸将表明样 本内存在活细胞。

病毒可为野生型病毒或修饰病毒。当病毒为经修饰含有标记序 列的修饰病毒时，那么被检测的核酸为病毒在细胞内复制所独特产 生的核酸。

在一个具体的实施方案中，病毒并不修饰成含有任何标记序列， 例如靶重复序列。

然而，为了其它目的，例如为了提高病毒的感染性或特异性， 可对病毒进行修饰。所述病毒可为商品化病毒，因此提供优于天然 存在的病毒而不会显著增加方法的复杂性或成本的优点；或者所述 病毒可使用常规转化方法来产生。

选择哪种检测方法将取决于所使用的具体病毒。

在一个具体的实施方案中，所述病毒为RNA病毒，特别是单链 RNA病毒。

特别优选的单链RNA病毒为VI类RNA病毒，包含单股正(+) 链RNA。采用称为逆转录的方法，所述病毒能将其RNA转化为互 补DNA(cDNA)。将RNA转化为cDNA使得病毒可以在宿主细胞内 进行复制。

然而，对上述步骤(ii)中产生的cDNA的检测提供了一种独特指 示物，表明样本内存在能够被感染并且维持病毒感染的活细胞。

实现逆转录所必需的逆转录酶是病毒粒子中常见的酶，因此， 病毒并不需要依赖宿主细胞来提供该必需酶。然而，宿主必须提供 病毒能够感染宿主细胞和在宿主细胞内复制所需的许多其它因子。

例如，病毒内陷进入宿主细胞需要宿主因子，例如与病毒相互 作用的表面蛋白和细胞膜。另外，逆转录需要含有必需dNTP底物的 稳定环境，以由病毒RNA形成cDNA。

如果宿主细胞是死细胞，就不能产生如上所述的那些其它因子， 那么病毒将不能感染宿主细胞且不能在宿主细胞内复制，从而不能 产生可检测DNA，例如不能形成扩增反应的靶DNA。

如果宿主细胞是活细胞，那么RNA病毒将能感染宿主细胞并在 宿主细胞内复制，产生可检测cDNA。如果宿主细胞是死细胞，那么 病毒将不能感染宿主细胞和/或不能在宿主细胞内复制，因此将检测 不到cDNA。

在本发明的该实施方案中，步骤(i)期间最好有必要将样本孵育 足够长时间以确保宿主细胞产生至少一种cDNA。然后，可使用常规 扩增反应(例如PCR)检测cDNA。然而，也可孵育足够长时间以产生 多拷贝。通常孵育30分钟至1小时将足以产生可检测核酸。

或者，病毒可包括单股负链RNA分子，例如V类病毒。感染 活的宿主细胞时，细胞将产生互补正链RNA，准确地说是mRNA链。 然而，如上所述，该过程仅能在被感染细胞的稳定环境内发生。然 后，可使用例如常规逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测由此产 生的正链RNA。

为了仅产生一种互补DNA分子，优选在逆转录步骤中使用一种 引物进行检测。

在一个具体的实施方案中，然后通过设计扩增cDNA内某个区 域，使用常规PCR扩增对该cDNA进行检测。为了确保污染降至最 低，在该扩增前优选对RNA链进行消化。

或者，病毒本身核酸量的升高可用作存在活细胞的指示物。再 者，这是因为病毒复制仅能在活细胞内发生。在该实施方案中，被 检测核酸与报告序列不同，优选为野生型序列。

例如，当病毒为DNA病毒，例如单链II类病毒或双链I类病毒 时，常常有必要检测感染后DNA总量升高以确定样本内存在特异性 活细胞。可采用各种方法进行检测，但可能最简便的将是使用定量 PCR方法，例如TAQMAN^TM方法或类似方法扩增DNA。

当病毒为RNA病毒时，有必要使用例如RT-PCR检测RNA的 增多。

本发明方法中的待测样本可为疑似或已知含有原核细胞和/或低 等真核细胞和/或高等真核细胞的任何样本。

落入本发明范围之内的样本实例包括食品样本、人或动物体液 样本或组织样本(特别是临床样本)、医药制品、化妆品或兽医制品或 药物、植物样本、土壤样本、空气样本、水样本和细胞培养物样本。 样本最优选为食品样本。

本发明的所述方法可用于检测病毒能感染的任何活细胞样本。 这些活细胞包括原核细胞和真核细胞。细胞可为例如微生物，例如 细菌。可检测的细菌的具体实例包括大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌属 (Salmonella)、李斯特菌属(Listeria)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、军 团菌属(Legionella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属 (Staphylococcus)或链球菌属(Steptococcus)。

或者，细胞可包含在昆虫、植物或真菌等小的生物体内。

另外，它们又可存在于细胞或细胞系，包括哺乳动物细胞系、 植物细胞系和真菌细胞系。例如在筛选药物或其它试剂期间，或者 在生物学分析中，常常对细胞系中的活细胞进行检测，本文所述方 法可用于该情况下。

例如，在分析含有细胞的病人(已用抗生素对特定细菌感染进行 治疗)样本时，所述方法是特别有用的。可根据本文所述方法检测从 这些病人身上采集的合适样本，以判断抗生素治疗是否有效。

病毒可为野生型病毒或重组病毒。如果细胞为活细胞，病毒将 能够感染该细胞并进行复制，对于正链RNA而言产生cDNA，或者 其它情况下会产生更多种RNA，特别是mRNA。当用修饰病毒检测 例如病毒在细胞内复制所独特产生的插入标记序列的互补序列时， 那么可提供清楚的指示物表明存在活细胞。合适的标记序列可包括 抗生素抗性基因。

一般而言，本质上可用上述方法检测可被病毒感染的任何类型 细胞的生存力。例如，如果必须检测样本中活的大肠杆菌0157细胞， 那么可使用能感染大肠杆菌0157细胞的任何病毒。

在某些样本例如牛奶样本或土壤样本中，存在的细菌或其它细 胞类型数量非常高。可以理解的是，很难在所述样本中检测具体细 胞类型的生存力。然而，在本发明的一个优选实施方案中，所用病 毒对细胞类型是特异性的，存在的活细胞是在检测范围之内。换言 之，在该实施方案中，使用的病毒必须仅仅能感染在检测范围内的 细胞类型且在其中复制。

例如，从英国的国立工业和海洋微生物保藏有限公司(the National Collection of Industrial and Marine Bacteria，Aberdeen，UK，保藏号为 NCIMB 10359)可获取已知的大肠杆菌噬菌体。从英国沃特福德巴斯 德诊断公司(赛诺菲)(Diagnostics Pasteur(Sanofi)Watford UK)获得的 Felix 01噬菌体能够感染沙门氏菌属菌株，特别是新港沙门氏菌 (Salmonella newport)。

在该优选实施方案中，不管存在多少其它类型的细菌或其它细 胞，如果检测到活细胞存在，所用特异性病毒将仅产生可检测核酸。 在判断细胞是否是活细胞之前，这意味着不必分离被检测细胞，这 一点很有优势。

当检测不止一种细胞的生存力时，病毒可以单独使用或者用作 多特异性混合物。在后一情况下，接着使用各病毒的相应特征来检 测多种核酸序列，例如cDNA序列。

病毒感染和复制循环将常常导致被感染细胞破裂，释放出细胞 内含物。如果是这种情况，无需主动裂解或均化细胞，就可检测到 上述方法步骤(ii)中的被检测核酸。然而，如果需要或有必要的话， 在步骤(ii)前可对样本内任何细胞进行裂解或均化。

使用常规方法，例如加热或者例如加热至94℃、超声处理或加 入裂解剂如去污剂可进行裂解或均化。

在一个优选的实施方案中，当例如步骤(ii)中检测由病毒产生的 cDNA或由复制RNA获得的DNA时，优选使用扩增反应例如聚合 酶链式反应(PCR)进行检测。既然这样，为了扩增任何存在的靶DNA， 如果有必要，在步骤(i)后裂解细胞，再加入各种试剂，包括众所周知 的引物、聚合酶、核苷酸和缓冲液，最后进行常规热循环。

然后，可使用常规方法例如凝胶电泳，再使用染料显现，对扩 增产物进行检测。

随着不断发展，优选采用扩增反应进行检测，其方式使得扩增 产物可以产生可检测信号，特别是可见信号，例如荧光信号。所述 信号的许多产生方法是本领域已知的。这些方法可以利用DNA结合 剂等试剂(例如嵌入染料)，当染料嵌入DNA当中时，与含有荧光标 记的探针和引物一样，通过重排进行荧光能量转移(FET)，特别是荧 光共振能量转移(FRET)来发光，特别是发高强度的荧光。

有两种类型的常用FET或FRET探针，一种是使用核酸探针的 水解作用使供体和受体分开，一种是使用杂交改变供体和受体分子 的空间关系。

商品化的水解探针有TaqMan^TM探针。该探针由标记供体和受体 分子的DNA寡核苷酸组成。探针被设计为与PCR产物一条链上的 特异性区域相结合。PCR引物退火至该链后，Taq酶利用5′→3′聚合 酶活性延伸DNA。Taq酶也显示5′→3′外切核酸酶活性。在3′端通过 磷酸化将TaqMan^TM探针保护起来，以阻止其引发Taq延伸。如果 TaqMan^TM探针与产物链杂交，延伸中的Taq分子也可水解探针，使 供体从受体释放出来以作为检测基础。该情况下信号是累积的，自 由供体分子和受体分子浓度随着每个扩增反应循环的增加而升高。

可用的杂交探针有多种形式。分子信标是具有互补5′和3′序列， 能形成发夹环的寡核苷酸。当形成发夹结构时，末端荧光标记紧紧 靠近以便发生FRET。分子信标与互补序列杂交后，使得荧光标记分 离，因此不发生FRET，构成检测基础。

也可使用双标记寡核苷酸。它们在PCR产物链上紧紧靠近杂交， 使得供体和受体分子在一起以便发生FRET。增强的FRET为检测基 础。该类型的变体包括使用标记扩增引物与单条相邻探针。

然而，当已知存在其它检测扩增反应方法时，可使用任何一种 检测方法。这些方法的具体实例如WO99/28500、英国专利号 2,338,301、WO99/28501和WO99/42611中所述。

WO99/28500描述了一种非常成功地检测样本中存在靶核酸序 列的方法。在该方法中，将DNA双链体结合剂和对所述靶序列具有 特异性的探针加入样本中。探针含有活性分子，能从所述DNA双链 体结合剂吸收荧光或将荧光能量供给至所述DNA双链体结合剂。然 后，使该混合物进行扩增反应，扩增靶核酸，诱发条件是在扩增过 程期间或扩增过程结束后探针与靶序列杂交。监测从所述样本产生 的荧光。

该方法的一种替代形式是利用能从探针上的荧光标记吸收荧光 能量，但并不发射可见光的DNA双链体结合剂，参见同时待审的英 国专利申请号223563.8。为了检测靶cDNA序列，任何一种所述方 法可用于本发明方法情况中。

可采用定量方式来实施许多所述方法，这一点是本领域众所周 知的，例如，在扩增反应每个循环期间至少监测一次从扩增混合物 产生的信号。

可采用所述方法进行反应来确定样本中存在的核酸量。所述方 法涉及原始样本中的活细胞数量，或者可用所述方法来确定因病毒 在活细胞内复制而引起的核酸量升高。

如上所述，被检测的具体核酸可为病毒感染活细胞产生或复制 的任何特征性序列。当检测中使用单特异性病毒时，被检测核酸可 为来源于病毒的任何序列，或在制备重组病毒期间插入重组病毒的 任何其它序列。当病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么 核酸为病毒在细胞内复制所独特产生的核酸。

当所述方法中使用病毒的多特异性混合物时，为了判断样本中 特定细胞类型是否为活细胞，那么有必要检测核酸序列，该核酸序 列是由每种所用病毒转录所得的特征性序列。既然这样，因此，最 好是检测病毒在细胞内复制所独特产生的序列，且与每种所用病毒 中特异性插入标记序列一致。

既然这样，当被检测序列为DNA序列时，为了检测产生的各种 序列，可进行使用不同信号试剂或系统的多重PCR反应。例如可通 过在扩增反应中使用不同标记物，例如发不同波长荧光的标记物来 标记所用探针或引物而实现。然后进行检测每种标记信号，例如每 种不同波长的信号，当波长重叠时，必要时可进行合适的信号分辨。

在本发明方法中，当被检测核酸为病毒本身存在的核酸时，仅 用所述核酸量的升高就可表明存在活细胞。因此，步骤(ii)中检测样 本即为检测所述核酸序列浓度的任何升高。靶核酸序列量的升高表 明样本内存在活的宿主细胞。反之，靶核酸量没有升高表明事实是 被检测样本中不存在活的宿主细胞。

在该实施方案中，孵育前需要从病毒加入至样本中形成的混合 物中提取样本，检测该提取样本内的核酸量可提供基线进行比较。 或者或又可在孵育期间的任何时候检测其它提取样本。

最优选使用合适方法来确定孵育前后存在的核酸量。例如，可 使用定量扩增反应(例如定量PCR)检测DNA浓度，尽管也可以使用 不包括扩增的其它检测DNA的方法。可使用RT-PCR检测RNA浓 度，如果合适的话，可结合PCR反应检测由此生成的DNA。

必须同样处理孵育前后样本以便直接比较结果。最优选还使用 水对照。

本发明的另一方面提供实施上述方法的试剂盒。合适的试剂盒 包含病毒以及一种或多种检测核酸所必需的试剂。

在优选的实施方案中，试剂盒包含病毒以及一种或多种必需试 剂，所述试剂用来检测病毒在所述细胞中复制所获得的核酸，假如 当病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么一种或多种试剂 对于检测病毒在细胞内复制所独特产生的核酸是必需的。

病毒最优选为噬菌体，然而，也可使用其它能感染低等和/或高 等真核细胞的DNA或RNA病毒，这取决于待检细胞性质。

当所用病毒为RNA病毒时，优选步骤(i)前至少部分但优选完全 纯化病毒以去除污染DNA。所述病毒构成了本发明的另一方面。

合适的试剂盒可包含RNA病毒以及一种或多种试剂，所述试剂 用来检测通过逆转录所述RNA病毒内的序列所获得的cDNA。所述 一种或多种试剂最优选包含一对引物，该引物对通过逆转录所述RNA 病毒内序列所获得的cDNA是特异性的。

或者，试剂盒可包含DNA病毒以及一种或多种适合定量检测 DNA的试剂。所述一种或多种试剂最优选包含一对引物，该引物对 病毒DNA序列是特异性的。

或者，试剂盒可包含进行RT-PCR反应以检测RNA所必需的试 剂，例如引物。

试剂盒内可能的其它成分包含其它适合用于检测核酸序列的试 剂。特别是试剂盒可包含嵌入染料或探针，使用上述方法通过它们 检测产生的任何核酸。

可采用直接检测扩增产物的方式来合适地标记引物。例如，引 物可包含如上所述的荧光标记或其它标记。

或者，试剂盒还可包含探针，该探针对扩增产物是特异性的， 且被标记以协助检测产物。探针可包括单标记或双标记水解探针或 杂交探针。适当的时候，它们可包括嵌入染料或其它DNA双链体结 合剂，以组成检测系统成分。

下面通过实施例并结合附图对本发明作出具体的描述，附图中：

图1用示意图说明本发明的检测方法；

图2显示下文实施例2中所有检测样本的扩增曲线；

图3显示使用正向引物尝试扩增任何cDNA的结果，说明所有 检测样本都没有产生扩增cDNA；

图4显示使用反向引物扩增任何cDNA的结果，说明原始样本、 1∶10、1∶100和1∶1000检测样本分别于约25、29、32和34个循环处 检测到扩增；和

图5显示使用正向和反向引物扩增cDNA的结果，说明原始样 本、1∶10和1∶100检测样本分别于约20、23和27个循环处检测到扩 增。

实施例1

在图1所示实施方案中，具有单链负义基因组的V类病毒制品 适用于样本。

样本可为任何合适样本，但可包括在肉汤培养基或磷酸缓冲盐 溶液(PBS)中的细菌浸液，其中细菌并不是应激菌，因此容易被感染。 必要时将样本稀释，例如稀释至样本每毫升可含有6×10⁶～2×10³个细胞。

之前可适当地处理病毒制品以去除污染DNA，例如，用DNA 酶(DNAse)进行处理。病毒制品也可进行离心纯化，并重悬于例如缓 冲蛋白胨水(BPW)中，以制成噬菌体滴度为例如10¹⁰/ml。

然后加入所述制品，例如大约20μl噬菌体，接着轻轻混合30 秒。此后，合适地使混合物静置5分钟以促进噬菌体吸附。

然后进行合适孵育，例如37℃水浴30分钟，期间可轻轻搅动培 养物。

在此期间，噬菌体将感染活细胞(如上所述)，且在所述细胞内产 生多拷贝正链RNA。

该过程结束后，必要时可裂解细胞，例如通过加热至94℃，用 所获得的混合物进行RT-PCR，由正链RNA产生互补DNA序列。 使用对正链RNA特异性单引物可合适地进行RT-PCR。

鼠逆转录酶或AMV反应中典型条件的实例如下：

缓冲液：    10mM Tris.Cl pH8.3(室温)

(终浓度)    1-6mM MgCl₂

            0.1％明胶(任选)，10-50mM KCl，BSA级分V1-100

            μg/ml

            核苷酸50-400μM

引物：      随机六核苷酸，特异性(如PCR中)或多聚脱氧胸苷

            核苷酸(连串“t’s”)0.1-1μM

酶：        0.25-5单位/μl(因酶而异)

任选：      胎盘RNA酶(RNAse)抑制剂1-20单位

用RNA酶处理产物，消化RNA模板，仅留下cDNA，该cDNA 可用常规PCR反应进行扩增和检测。

所有这些步骤都是快速的，因此，提供了一种快速检测活细胞 的方法。

实施例2

链选择性MS2 RT-PCR实验

进行该实验以表明使用链定向RT-PCR可产生和检测cDNA。 准确地说，该实验研究了在MS2噬菌体中链特异性两步法RT-PCR。 单独使用正向引物和反向引物与联合使用两者来产生和检测cDNA。 当在MS2中仅存在一种类型RNA时，期望仅使用一种引物(例如正 向引物或反向引物)就能产生会在PCR中扩增的DNA。

方法

本实验中所使用的引物和探针序列见表1。引物均用DEPC处理 水稀释至浓度为10μM。探针也稀释至浓度为2μM。第一探针用0.1 ×TE稀释，第二探针用DEPC处理水稀释。

表1：MS2引物和探针

名称 序列(5′→3′)     长度 修饰 正向引物 TCG TCG ACA ATG GCG GAA CTG     21 无 反向引物 CTT TAG GCA CCT CGA CTT TGA TGG     24 无 第一探针 AGC TCT AAC TCG CGT TCA CAG GCT TAC AAA GTA ACC TGT T     40 3′FAM 第二探针 GTT CGT CAGAGC TCT GCGCAG AAT CGC AAA TAT     33 5′Cy5和3′磷酸化

对于逆转录步骤，使用表2所示的浓度和试剂来制备三种反应 混合液。

表2：逆转录步骤中使用的试剂

试剂     批号 贮液浓度         加入量(μl) 终浓度   F和R引物   F引物   R引物 反应缓冲液     1009 5×   16   16   16 1× dUTP     24/11 2mM   20   20   20 0.5mM 正向引物     ------- 10μM   10   10   0 1.25μM^*反向引物     ------- 10μM   10   0   10 1.25μM^*

^*如果加入的话

用DEPC处理水补充逆转录反应混合液至71μl。接下来，每个 管中加入8μl MS2(浓度为4×10⁹/ml)。混合样本，分装成两管，每 管35μl，于90℃变性10分钟。然后将管置于冰上，每个管中加入0.5 μl逆转录酶MMuLV(60单位/μl，批号173)。轻轻混匀样本，置48℃ 水浴30分钟进行cDNA转录。

按一式两份制备下列检测样本用于PCR分析：

DEPC处理水，阴性对照(ntc)

4×10倍稀释系列的cDNA，用正向引物制备

4×10倍稀释系列的cDNA，用反向引物制备

3×10倍稀释系列的cDNA，用正向和反向引物制备

MS2纯化的DNA产物，1∶1000稀释，阳性对照

使用Corbett机器人制备PCR反应混合液。每个反应中所用试 剂浓度见表3。

表3：PCR混合液中使用的试剂浓度

  试剂     批号     贮液浓度 加入量(μl)/样本     终浓度   Tris缓冲液   pH8.8     0016     0.5M 2     50mM   BSA     B8667     20mg/ml 0.25     0.25mg/ml   MgCl₂    019     100mM 0.6     3mM   dUTP     24/11     2mM 2     0.2mM   第一探针     -------     2μM 2     0.2μM   第二探针     -------     2μM 2     0.2μM   正向引物     -------     10μM 2     1μM   反向引物     -------     10μM 2     1μM   Taq抗体     GC102TA/7     5单位/μl 0.16     0.04单位/μl   Taq聚合酶     14/4     5单位/μl 0.16     0.04单位/μl

将PCR混合液(18μl)与2μl检测样本一起加入LightCycler毛细 管中。盖上盖子，3000rpm短时离心。

在LightCycler1.0(Roche)上进行下列程序：

扩增(50个循环)

变性  95℃5秒

退火  55℃20秒  单次荧光读数

延伸  74℃5秒

解链(1个循环)

保持       50℃  15秒

Temp.Ramp  95℃  按0.1℃/s连续荧光读数

运用LightCycler数据分析程序对数据进行分析。

结果见图2至图5。

图2显示所有检测样本的结果。

图3显示含有正向引物的检测样本的结果。

图4显示含有反向引物的检测样本的结果。

图5显示含有正向和反向引物的检测样本的结果。

结论

使用正向引物产生的cDNA不足以在PCR中检出。然而，使用 反向引物产生的cDNA足以在PCR中检出。当使用正向和反向引物， 能以较高效率扩增cDNA，在PCR扩增中能尽早地检出。

因此，现已证明使用链定向RT-PCR可特异性检测通过逆转录 RNA所独特产生的cDNA。