一种防治农作物土传病害的生防菌复配剂及制备方法

摘要

一种用于防治农作物土传病害的生防菌复配剂，其特征是所含各种成分及重量比如下：枯草芽孢杆菌发酵液7－9；绿色木霉孢子粉7－9；硅藻土或轻质碳酸钙60－80；磷酸氢二钾1－3；木质素磺酸钠2－5。通过对枯草芽孢杆菌进行发酵培养，获得发酵液，再将具有一定菌含量的发酵液和绿色木霉孢子粉进行复配，以硅藻土为载体，加入适量营养元素，制成微生物复配农药。枯草芽孢杆菌与绿色木霉形成优势互补的作用，用于防治腐霉菌和镰刀菌引起的猝倒病、立枯病、根腐病、枯萎病等农作物土传病害。产品无公害、药效稳定持久。

说明书

技术领域

本发明是一种用于防治农作物土传病害的生防菌复配剂及制备方法。

背景技术

近年来，随着我国农业产业结构调整，以温室、大棚为主的设施农业发展迅速。土壤有害生物侵染农作物根部和茎基部，造成农作物猝倒、根腐、立枯、枯萎等土传病害的发生面积逐年扩大。温室、大棚的多种蔬菜、水果、花卉等常年连作，土壤的温、湿度、营养条件有利于土传病菌繁殖，造成的损失通常达30％-40％，甚至绝产。由于引起土传病害的病原菌种类多，多数属于兼性寄生菌，寄主范围广泛，对土壤环境的适应能力强，存活方式多样，因此针对多种病原菌选育具有广谱抗性的抗病品种十分困难。利用化学农药处理土壤往往受到地力、化学因素等影响而难以发挥作用，且污染严重，农产品的安全性难以得到保证。施用广谱土壤熏蒸剂，会同时杀死土壤有益微生物，失去自然控制的土传病原菌会更加猖獗。因此，土传病害已经成为设施农业可持续发展的重要障碍。

生物防治是控制土传病害的有效方法，是通过调控根际有益和有害微生物间的相互作用而达到防治土传病害目的的，是一种对环境友好、经济、可持续的方法。细菌和木霉菌在土传病害的生物防治中占有非常重要的地位。生防菌的重要优势在于它的种类和数量众多，在植物根际和地上部分都大量存在，几乎每一种植物病原真菌都都能找到一种或几种有防治作用的细菌或木霉菌；它们作用方式较广，可以通过竞争作用、拮抗作用、寄生作用和诱导植物的抗性等对病原菌产生影响；生防菌的优势还在于它具有惊人的繁殖速度，在适宜的条件下，几十分钟就能分裂一次，这对于它们占领空间和生存竞争非常有利；许多细菌和木霉菌存在于植物的根际和地上部分，与植物建立了密切的联系，在生物防治中具有很大的优势；细菌和木霉菌均可以人工培养，便于控制研究和生产实践中的操作。可用于植物病害生防菌的种类很多，其中芽孢杆菌和木霉菌研究最为广泛。

我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害现已开发成功并投人生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等。利用哈氏木霉菌防治植物病害现已开发成功并投人生产的商品制剂有特立克等。

但到目前为止，尚未见有高效枯草芽孢杆菌与绿色木霉的微生物复配制剂，也未见有大面积应用于农田防治土传病害的微生物复配菌制剂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服目前生产上防治土传病害已有技术的不足，通过筛选大量农作物根际土壤拮抗微生物，分离出有拮抗作用的枯草芽孢杆菌和有拮抗作用的绿色木霉菌，将枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌复配成微生物复配制剂。同时，研制出这种微生物复配农药的制备方法。

本发明技术解决方案的要点是：利用从作物根际土壤分离出的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和绿色木霉菌(Trichodermaviride)，将其分别纯化后转致试管斜面内作母菌剂。

将枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌的母菌剂在三角瓶内分别进行振荡发酵培养作为二级菌种。再将枯草芽孢杆菌经发酵罐发酵制成发酵液。枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌所采用的液体发酵培养基各种成分重量比均为：蔗糖30，酵母浸粉或酵母浸膏5，加水成1000，灭菌温度121℃、时间26分钟，发酵温度27℃-30℃，发酵时间3-5天，枯草芽孢杆菌浓度达到2×10¹⁰cfu/mL即可；绿色木霉孢子浓度达到孢子含量1×10⁸个/mL即可；

将绿色木霉菌接种在烧杯内固体培养基上，每100克固体培养基接种10毫升二级菌种，发酵培养成种子粉。所采用的固体培养基成分重量比为：玉米碎粒10.3、麦麸15.5、稻壳5.2、脲0.1、水68.9。，灭菌温度121℃、时间30分钟，发酵温度25℃-27℃，发酵时间7-10天，以固体培养基表面全部长出绿色木霉孢子粉，培养基干透即可。

防治土传病害的生防菌复配剂组成成分按重量比为：

枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)发酵液(芽孢菌浓度2×10¹⁰cfu/mL)7-9；

绿色木霉孢子粉(孢子含量1×10⁸个/g)7-9；

硅藻土或轻质碳酸钙    60-80；

磷酸氢二钾            1-3；

木质素磺酸钠          2-5。

利用从作物根际土壤分离到的枯草芽孢杆菌，采用液体发酵的方法制得枯草芽孢杆菌发酵液；利用从作物根际土壤分离到的绿色木霉菌，采用先液体发酵、后固体发酵的方法制得绿色木霉孢子粉，用孢子分离器吹扫并收集绿色木霉孢子粉；之后，先将枯草芽孢杆菌发酵液按重量比7-9加入重量比为60-80的藻土或轻质碳酸钙，充分混匀，再先后加入重量比为7-9的绿色木霉孢子粉、重量比为1-3的磷酸氢二钾、重量比为2-5的木质素磺酸钠，充分混合均匀；制成防治土传病害的生防菌复配剂。

本发明微生物复配农药的有益效果如下：1、依据微生态学原理，通过引进微生物菌剂，操纵管理作物根围生态环境中微生物群落的合理分布，恶化病原菌的生存环境，结合栽培管理、农业和化学防治措施，形成一个稳定的、平衡的、生物多样化的作物生态系统，从而有效地、较持久地控制土传病害的流行。2、微生物农药具有化学药剂所不具备的优点，其控病作用机制主要为：①优势种群的竞争作用：枯草芽孢杆菌和木霉菌均具有在作物植株上定殖能力强、繁殖快的特点，能与病原菌有效竞争侵染位点，减少土传病发病机率(参见表1、表2)。②拮抗菌抗生作用：枯草芽孢杆菌能分泌产生拮抗素，能有效抑制土传菌的生长、侵染和蔓延。③拮抗菌的诱导抗性作用：枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌在施用后，均可以诱导作物植株内大量产生与抗病性有关的酶类，从而增强了作物植株抵御病原菌侵入、蔓延的能力。3、可以将枯草芽孢杆菌发酵液与绿色木霉孢子粉以任意比例进行复配，选取恰当的复配比例，就可以使本发明农药的应用达到既能发挥最佳药效作用、又能减少化学农药的使用量和使用次数、尽可能保持作物天然品质的目的。4、经测试表明，本发明复配农药产品中的绿色木霉孢子粉与枯草芽孢杆菌的菌落数形成无相互干扰作用，产品具有药效稳定、保持时间可达两年。经试验表明，本发明产品对环境安全，对人、畜无致病性，对农作物病虫害天敌安全。

附图说明

图1为防治土传病害的生防菌复配剂生产加工工艺流程图。

具体实施方式

实施实例1：取作物根际土壤10克，加无菌水振荡后梯度稀释至1万倍制成土壤悬浮液，取1毫升此悬浮液加入9毫升含硫酸链霉素的PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)制成平板，在26℃下培养48小时，经分离纯化获得绿色木霉菌(Trichoderma viride)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，转移至试管斜面作母菌保存。

枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌所用的二级菌种发酵液的培养基配方均为：酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法为：分别称取酵母膏5克、蔗糖30克于大烧杯中，加入少量水并加热使之完全溶化，再加水至1000毫升。灭菌温度121℃、时间26分钟，绿色木霉菌发酵温度为25℃，发酵时间为10天、枯草芽孢杆菌发酵温度为27℃，发酵时间5天。分别制得两种菌的悬浮液作为二级菌种。

然后，将绿色木霉的二级菌种接种在500毫升烧杯内固体培养基上，每100克固体培养基接种10毫升二级菌种，用纸封口，发酵培养成种子粉。所采用的固体培养基成分重量比为：玉米碎粒10.3克、麦麸15.5克、稻壳5.2克、脲0.1克、水68.9毫升。灭菌温度121℃、时间30分钟，发酵温度25℃，发酵时间10天，以固体培养基表面全部长出绿色木霉孢子粉，培养基干透即可。按重量比将制得的枯草芽孢杆菌菌悬液(芽孢菌浓度2×10¹⁰ cfu/mL)7克，加至60克硅藻土中，使之充分吸附，再与绿色木霉孢子粉7克、磷酸氢二钾1克、木质素磺酸钠2克充分混匀，即制成防治土传病害的生防菌复配剂。

将防治土传病害的生防菌复配剂于播种时1∶50和1∶60拌土穴施，防治瓜类病害，防效分别达80％以上和75％以上。

实施实例2：取作物根际土壤10克，加无菌水振荡后梯度稀释至1万倍制成土壤悬浮液，取1毫升此悬浮液加入9毫升含硫酸链霉素的PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)制成平板，在26℃下培养48小时，经分离纯化获得绿色木霉菌(Trichoderma viride)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，转移至试管斜面作母菌保存。

枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌所用的二级菌种发酵液的培养基配方均为：酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法为：分别称取酵母膏5克、蔗糖30克于大烧杯中，加入少量水并加热使之完全溶化，再加水至1000毫升。灭菌温度121℃、时间26分钟，绿色木霉菌发酵温度为27℃，发酵时间为5天、枯草芽孢杆菌发酵温度为30℃，发酵时间3天。分别制得两种菌的孢子悬浮液作为二级菌种。

然后，将绿色木霉的二级菌种接种在500毫升烧杯内固体培养基上，每100克固体培养基接种10毫升二级菌种，用报纸封口，发酵培养成种子粉。所采用的固体培养基成分重量比为：玉米碎粒10.3克、麦麸15.5克、稻壳5.2克、脲0.1克、水68.9毫升。灭菌时间121℃、30分钟，发酵温度26℃，发酵时间9天，以固体培养基表面全部长出绿色木霉孢子粉，培养基干透即可。

按重量比将制得的枯草芽孢杆菌菌悬液(芽孢菌浓度2×10¹⁰cfu/mL)8克，加至70克硅藻土中，使之充分吸附，再与绿色木霉孢子粉8克、磷酸氢二钾2克、木质素磺酸钠4克充分混匀，即制成防治土传病害的生防菌复配剂。

将防治土传病害的生防菌复配剂400倍液灌根处理，防治蔬菜土传病害，防效达70％以上。

实施实例3：取作物根际土壤10克，加无菌水振荡后梯度稀释至1万倍制成土壤悬浮液，取1毫升此悬浮液加入9毫升含硫酸链霉素的PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)制成平板，在26℃下培养48小时，经分离纯化获得绿色木霉菌(Trichoderma viride)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，转移至试管斜面作母菌保存。

二级菌种发酵液的培养基配方为：酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法为：分别称取酵母膏5克、蔗糖30克于大烧杯中，加入少量水并加热使之完全溶化，再加水至1000毫升。灭菌温度121℃、时间26分钟，绿色木霉菌发酵温度为27℃发酵时间为5天、枯草芽孢杆菌发酵温度为29℃，发酵时间4天。分别制得两种菌的孢子悬浮液作为二级菌种。

然后，将绿色木霉的二级菌种接种在500毫升烧杯内固体培养基上，每100克固体培养基接种10毫升二级菌种，用报纸封口，发酵培养成种子粉。所采用的固体培养基成分重量比为：玉米碎粒10.3克、麦麸15.5克、稻壳5.2克、脲0.1克、水68.9毫升。灭菌温度121℃、时间30分钟，发酵温度27℃，发酵时间9天，以固体培养基表面全部长出绿色木霉孢子粉，培养基干透即可。

按重量比将制得的枯草芽孢杆菌菌悬液(芽孢菌浓度2×10¹⁰cfu/mL)9克，加至80克硅藻土中，使之充分吸附，再与绿色木霉孢子粉9克、磷酸氢二钾3克、木质素磺酸钠5克充分混匀，即制成防治土传病害的生防菌复配剂。

将防治土传病害的生防菌复配剂于播种时1∶50拌土穴施，防治防效蔬菜土传病害，防效达80％以上。

实施实例4：取作物根际土壤10克，加无菌水振荡后梯度稀释至1万倍制成土壤悬浮液，取1毫升此悬浮液加入9毫升含硫酸链霉素的PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)制成平板，在26℃下培养48小时，经分离纯化获得绿色木霉菌(Trichoderma viride)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，转移至试管斜面作母菌保存。

枯草芽孢杆菌和绿色木霉菌所用的二级菌种发酵液的培养基配方均为：酵母膏5克、蔗糖30克，水1000毫升。制作方法为：分别称取酵母膏5克、蔗糖30克于大烧杯中，加入少量水并加热使之完全溶化，再加水至1000毫升。灭菌温度121℃、时间26分钟，绿色木霉菌发酵温度为27℃发酵时间为5天、枯草芽孢杆菌发酵温度为30℃，发酵时间3天。分别制得两种菌的孢子悬浮液作为二级菌种。

然后，将绿色木霉的二级菌种接种在500毫升烧杯内固体培养基上，每100克固体培养基接种10毫升二级菌种，用报纸封口，发酵培养成种子粉。所采用的固体培养基成分重量比为：玉米碎粒10.3克、麦麸15.5克、稻壳5.2克、脲0.1克、水68.9毫升。灭菌温度121℃、时间30分钟，发酵温度27℃，发酵时间7天，以固体培养基表面全部长出绿色木霉孢子粉，培养基干透即可。按重量比将制得的枯草芽孢杆菌菌悬液(芽孢菌浓度2×10¹⁰cfu/mL)8.5克，加至78克轻质碳酸钙中，使之充分吸附，再与绿色木霉孢子粉8.5克、磷酸氢二钾2克、木质素磺酸钠4克充分混匀，即制成防治土传病害的生防菌复配剂。

将防治土传病害的生防菌复配剂于播种时1∶50拌土穴施，防治经济作物土传病害，防效达70％以上。