一种提高马铃薯对PVX病毒和PVY病毒双抗性的基因的构建方法

摘要

本发明涉及一种基因的构建方法，具体为一种提高马铃薯对PVX病毒和PVY病毒双抗性的基因的构建方法，解决现有提高马铃薯对两种病毒的双抗性的方法存在的多种问题，包括以下步骤，将PVX外壳蛋白基因全序列cp上的保守基因片段与具有相同酶切位点的PVY复制酶基因全序列NIb上的保守基因片段连接起来构成人工融合基因cn；将人工融合基因cn以正向和反向分别连接到内含子两侧，构建成人工融合基因的反向重复序列，人工融合基因cn的反向重复序列两端分别连有启动子和终止子。该融合基因的反向重复序列导入马铃薯后，其对两种病毒的双抗株率高，且抗性能达到高抗，甚至免疫水平，较易在生产上应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因的构建方法，具体为一种提高马铃薯对PVX病毒和PVY病毒双抗性的基因的构建方法。

背景技术

马铃薯是重要的粮菜兼用作物，在栽培过程中，由于病毒的侵入破坏了植株的正常生理功能，致使植株生长衰退、植株变矮、叶面皱缩，叶片出现黄绿相间的嵌斑，甚至叶脉坏死，整个复叶脱落，所结薯块小、性状差，严重影响产量和品质，这就是通常说得马铃薯退化现象。能侵染马铃薯的病毒种类有30多种，以马铃薯命名的就有16种(谢联辉等，1999)。在我国，侵染马铃薯的病毒主要是马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV)等。这些病毒除能单独侵染马铃薯植株外，有时还能与其它病毒复合侵染，即在同一植株上有2种或2种以上的病毒侵染，生产上最常见的是PVX病毒和PVY病毒的复合侵染。PVX病毒和PVY病毒复合侵染后会造成比PVX病毒或PVY病毒单独侵染更加严重的皱缩花叶型退化，这时PVX病毒在植株中的含量较单独侵染时显著提高，甚至提高10倍。PVX病毒和PVY病毒复合侵染造成的皱缩花叶型退化是生产上最为常见、也是最为严重的1种退化类型，严重影响马铃薯的产量和品质。马铃薯茎尖脱毒组织培养技术可以生产病毒含量很低的种薯，但成本高工作量大，需要专门的脱毒组培设施，脱毒后的种薯在栽培过程中会受耕作措施及蚜虫的侵染而重新感染病毒，致使两三年后产量又会严重下降。马铃薯无性繁殖，又是同源四倍体作物，用常规育种方法改良品种，过程复杂需时较长，利用基因工程培育抗病毒马铃薯是从根本上解决马铃薯退化的有效途径。

随着本领域技术的不断发展，1985年，Sanford和Johnstone提出了病原衍生的抗性(PDR)的概念。1986年，Beachy研究小组首次证实表达烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的转基因植物对其供体病毒TMV产生抗性，随后出现了许多利用病毒基因进行抗病毒转基因的报道，所转基因包括病毒外壳蛋白、移动蛋白、复制酶蛋白基因的全序列或部分序列，利用病毒来源的基因获得抗性转基因植物已成为植物抗病毒基因工程的重要途径。马铃薯在生长发育期间往往受到两种或多种病毒的侵染，如PVX和PVY及PVY和PLRV常常混合侵染，两种病毒的协生作用(synergism)加剧了对马铃薯的危害程度。利用病毒来源的基因获得多抗性转基因马铃薯是马铃薯抗病毒基因工程的一大热点，如转PVX和PVY双价外壳蛋白基因或转PVY和PLRV双价外壳蛋白基因的马铃薯植株兼抗PVX和PVY或PVY和PLRV两种病毒(Lawson et al，1990；宋艳茹等，1994；张鹤龄等，1996、1997)。这些研究利用病毒基因或基因片段获得的转基因马铃薯在阻止或降低病毒侵染方面均收到了一定效果，但难以达到免疫水平，此法所得到的转基因马铃薯抗病株率较低，且抗性只是延迟发病或者减轻发病程度，抗病水平不高，难以用于生产；而且上述两个目标病毒的外壳蛋白基因转录出的RNA能够保持完整甚至进一步翻译成蛋白质。这种转基因转录出的RNA有可能与侵入植物体内的其它病毒的RNA发生同源重组，翻译出的蛋白质有可能与侵入植物体内的其它病毒的RNA发生异源包装而产生新的病毒。

新近发展迅速的双链RNA干扰(RNAi，RNA interference)技术为植物抗病毒转基因工程提供了新思路。生物体内正常基因的转录产物因无互补序列不会形成双链RNA，如果出现了双链RNA，生物体内的核酸酶就会将其降解成21-25nt的小干扰RNA片段(siRNA，small interering RNA)，这些小RNA会进一步介导与其同源的单链RNA降解。基于上述认识，把源自病毒的基因构建成反向重复序列导入植物体，其转录产物会通过分子内序列互补形成双链RNA结构，这些双链RNA进一步降解成小RNA，如果供体病毒侵入植物体，这些小RNA会介导病毒mRNA中与其同源的部分降解，阻止了病毒的复制和扩散，使转基因植物获得抗病性。目前，这方面已有一些研究，如Waterhouse等(1998)将PVY蛋白酶基因的dsRNA导入烟草，使烟草获得了对该病毒的特异抗性，抗性程度远远高于正义RNA或反义RNA；Wang等(2000)把大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf luteovirus-PAV)聚合酶基因的反向重复序列(hpBYDVpol)导入大麦，对转基因植株进行ELISA检测和蚜虫饲喂均未发现病毒，认为抗性水平是免疫的；Smith等(2000)把PVY的蛋白酶基因的反向重复序列导入烟草，抗病性也达到了免疫水平；Missiou等(2004)把PVY的外壳蛋白基因片段的反向重复序列导入马铃薯，获得了高抗无性系，证实抗病性是RNA干扰的结果。通常，人们的普遍做法只是把PVY的外壳蛋白基因片段的反向重复序列导入马铃薯，使得马铃薯获得了对PVY病毒的抗性，或者只是把PVX的复制酶蛋白基因片段的反向重复序列导入马铃薯，使得马铃薯获得了PVX病毒的抗性，其都是利用一个人工基因表达一种双链RNA分子来使植物获得对一种病毒的抗性。为了使植物同时获得对两种病毒的抗性，人们也会将两种病毒的基因片段分别导入植物体内，或者把1个基因转到植物里，对获得的转化体再进行转基因操作，把第2个基因再转进去，或者是分别将单个基因转入受体植物，再用这2种受体植物进行杂交，对杂交后代筛选获得多基因的转化体，或者进行多个载体共转化，但是这些方法繁琐、费时，多次的基因操作还带来了随后的抗生素筛选的困难。构建前述的双价载体时，PVX病毒外壳蛋白基因和PVY病毒复制酶基因都要有自己的启动子，就是说转基因要带2个启动子，而双子叶植物常用的组成性启动子事实上只有35S启动子，转基因体内重复使用同一启动子容易引起同源抑制，影响转基因的表达。而利用RNA干扰原理使转基因植株获得对2种病毒的抗性，或更具体地说，利用一个基因表达出不同来源的双链RNA使转基因植株同时获得抗2种病毒或多种病毒的转基因植物尚未见报道。

发明内容

本发明为了解决现有提高马铃薯对两种病毒的双抗性的方法存在的多种问题，提供一种提高马铃薯对PVX病毒和PVY病毒的双抗性的基因的构建方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：提高马铃薯对PVX病毒和PVY病毒的双抗性的基因的构建方法，包括以下步骤：(1)分别从感染PVX病毒和PVY病毒的植物体内经提取总RNA、RT-PCR扩增以及基因克隆工序得到PVX外壳蛋白基因全序列cp和PVY复制酶基因全序列NIb；(2)利用PCR扩增分别得到PVX外壳蛋白基因全序列cp和PVY复制酶基因全序列NIb上的一段保守基因片段；(3)酶切PCR扩增得到的PVX外壳蛋白基因全序列cp的保守基因片段，与具有相同酶切位点的PVY复制酶基因全序列NIb上的一段保守基因片段连接起来以构成人工融合基因cn；(4)将人工融合基因cn以正向和反向分别连接到一个内含子的两侧，构建成一个人工融合基因的反向重复序列，该序列即为提高马铃薯对X病毒和Y病毒的双抗性基因RNAiCN；(5)人工融合基因cn的反向重复序列两端分别连有启动子和终止子。

本发明所基于的理论基础是把源自病毒的基因构建成反向重复序列导入植物体，其转录产物会通过分子内序列互补形成双链RNA结构，这些双链RNA进一步降解成小RNA，如果供体病毒侵入植物体，这些小RNA会介导病毒mRNA中与其同源的部分降解，阻止了病毒的复制和扩散，从而使转基因植物获得抗病性。

上述双抗性基因RNAiCN构建过程中，PVX外壳蛋白基因全序列cp和PVY复制酶基因全序列NIb的获得方法是本领域的普通技术人员熟知的，从上述全序列中选取所需要的保守序列的方法也属于现有技术，在上述各步骤中如果选用的内切酶不一样，所得到的双抗性基因RNAiCN的核苷酸序列是不一样的。

本发明所述的内含子的作用是促进人工融合基因的反向重复DNA序列在植物体内转录成RNA序列，转录效率高、速度快，且转录成的RNA序列结构稳定，本发明所述的任何植物体内的内含子都可以用。

本发明所述的启动子的作用是启动转录，通常选用35S，终止子通常选用NOS poly-A，这是本领域的普通技术人员熟知的。

将本发明构建好的双抗性基因RNAiCN通过DNA重组技术连接到可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的植物表达载体上，例如衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆位点的一系列通称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)和pBS-T载体(由天根公司生产)，尤其是植物表达载体pCAMBIA1301、pBin19、pROKII和pBI131系统(Jefferson，et al.，EMBO J，16：3901，1987)等，在本发明的一系列优选实施方案中，选用pUC19、pCAMBIA1301等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体；然后将植物表达载体转入并整合到马铃薯基因组中，而双抗性基因RNAiCN在马铃薯中的表达可赋予该植物对PVX和PVY两种病毒的双抗性，同时马铃薯的后代及任何部分的组织均具有双抗性。上述将携带外源基因的表达载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括a、农杆菌介导法、b、物理法，如基因枪法、电击融合法、显微注射法、超声波法等；c、化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等；d、种植系统转化法，如花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等；e、以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)能同时抑制两种病毒的复制，使转基因马铃薯同时获得对PVX病毒和PVY病毒的双抗性，有效解决马铃薯生产中存在的皱缩花叶型退化；

(2)本发明所述的方法构建的融合基因反向重复序列的转录产物会形成一种序列自我互补的双链RNA结构，该结构会激发植株体内的RNAi机制，把该双链结构降解成小片段，因此转基因的mRNA不存在或存在量很少，也不会翻译成蛋白质，避免了常规抗病毒转基因方式可能引起病毒与转基因发生同源重组或异源包装的潜在生物风险；

(3)将两个基因构建成一个融合基因，两个基因用一个启动子即可，也就避免了由使用相同启动子造成的同源抑制问题，同时，利用一个载体、一次转化即可，省时省力；

总之，利用本发明所述的方法构建的融合基因反向重复序列导入马铃薯后，其对两种病毒的双抗株率高，且抗性能达到高抗，甚至免疫水平，较易在生产上应用。

附图说明

图1为本发明所述的双抗性基因RNAiCN的构建过程示意图

图2为本发明实施例中对双抗性基因RNAiCN的植物表达载体pRNAiCN的酶切鉴定结果

图3为本发明实施例中对双抗性基因RNAiCN的植物表达载体pRNAiCN的多引物PCR扩增鉴定结果

具体实施方式

以下是本发明的一个具体实施例：

步骤一：PVX外壳蛋白基因全序列cp和PVY复制酶基因全序列NIb的获得

1、PVX外壳蛋白基因全序列cp的获得

1)根据PVX外壳蛋白基因全序列cp的核苷酸序列(accession：AF528555)，

设计PCR引物：

正向引物：5’-ATGTCAGCACCAGCTAGCAC-3’；

反向引物：5’-TTATGGTGGTGGTAGAGTGA-3’。

引物由三博公司合成。

2)PVX外壳蛋白基因cp的全长DNA序列第一条链的合成：提取感染PVX病毒的烟草叶片的总RNA，取2μL，再加入10μM的反向引物2μL，10mM dNTP 2μL，ddH₂O 12μL。65℃水浴5min，冰浴2min。再向管内加入以下组分：5×RT缓冲液5μL，RNasin 1μL(5u)，M-MLVRT酶1μL(100u)，混匀后，按如下条件进行反应：先42℃60min，再85℃10min终止反应。

3)PCR扩增：以步骤2)反转录合成的第一链cDNA为模板，在正向引物和反向引物的引导下，PCR扩增PVY病毒复制酶的全长cDNA基因。PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用柱式回收试剂盒(天为时代)回收约720bp的扩增产物。

4)基因克隆：取步骤3)回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后提质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆送三博和博亚公司进行核苷酸序列测定。测序结果表明PVX外壳蛋白的全长cDNA已经插入pGEM-T Easy载体，得到的重组子分别命名为pGEM-PVXCP。

2、PVY复制酶基因全序列NIb的获得

1)根据PVY病毒复制酶基因NIb的核苷酸序列(accession：NC001616)设计PCR引物：

正向引物：5’-GCTAAGCATTCTGCATGGATG-3’；

反向引物：5’-TGCATCAATTGTGTCATTTGC-3’。

引物由三博公司合成。

2)PVY复制酶基因NIb全长cDNA第-条链的合成：提取感染PVY病毒的烟草叶片的总RNA，取2μL，再加入10μM的反向引物2μL，10mM dNTP 2μL，ddH₂O 12μL。65℃水浴5min，冰浴2min。再向管内加入以下组分：5×RT缓冲液5μL，RNasin 1μL(5u)，M-MLVRT酶1μL(100u)，混匀后，按如下条件进行反应：先42℃60min，再85℃10min终止反应。

3)PCR扩增：以步骤2)反转录合成的第一链cDNA为模板，在正向引物和反向引物的引导下，PCR扩增PVY病毒复制酶的全长cDNA基因。PCR反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用柱式回收试剂盒(天为时代)回收约1600bp的扩增产物。

4)基因克隆：取步骤3)回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，然后提质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆送三博和博亚公司进行核苷酸序列测定。测序结果表明PVY复制酶NIb的全长cDNA已经插入pGEM-T Easy载体，得到的重组子分别命名为pGEM-PVYNIb。

步骤二：双抗性基因RNAiCAN及其植物表达载体的构建

1、融合基因cn的构建

1)利用BLAST软件将克隆到的PVX外壳蛋白基因全序列cp与GeneBank中的序列比对，从全序列中选取保守性较高的517nt的片段用于构建RNAi基因。这517nt位于PVX外壳蛋白基因全序列cp的第126-642个核苷酸处。

2)用BLAST软件将克隆到的PVY复制酶基因全序列NIb与GeneBank中的序列比对，从全序列中选取保守性较高的546nt的片段用于构建RNAi载体。这546nt的片段位于PVY复制酶基因全序列NIb的第587-1132个核苷酸处。

3)以pGEM-PVXCP为模板，用5’端有人为加上KpnI酶切位点的正向引物(引物序列：5’-CTG GGT ACC AGT AGC CAG CAA TGC CG-3’)和5’端有人为加上XbaI酶切位点的反向引物(5’-CGG TCT AGA GTG ACA GCT GCA TCT AG-3’)进行PCR扩增，PCR产物是两端分别带有KpnI和XbaI酶切位点的外壳蛋白基因cp的517nt的DNA片段。

4)用KpnI和XbaI双酶切PCR产物，将酶切片段定向插入载体pGEM-PVYNIb上比较保守的546nt的NIb基因片段的上游，构建成由PVX cp基因片段和PVY NIb基因片段形成的融合基因cn，构建的重组载体命名为pGEM-CN；

5)以pGEM-PVYNIb为模板，用5’端有人为加上XhoI酶切位点的正向引物(引物序列：5’-CAC TCG AGA TAC CTT GCT GGG TGG T-3’)和5’端有人为加上BstEII酶切位点的反向引物(引物序列：5’-CGG TTA CCA AGA TCT GAG AAGTGT-3’)进行PCR扩增，PCR产物是两端分别带有XhoI和BstEII酶切位点的复制酶基因NIb的546nt的DNA片段。

将该PCR产物与pBS-T载体连接，构建重组载体pBS-PVYmNIb。

6)以pGEM-PVXCP为模板，用5’端有人为加上ClaI酶切位点的正向引物(引物序列：5’-CTG ATC GAT AGC CAG CAA TGC CG-3’)和5’端有人为加上XhoI酶切位点的反向引物(引物序列：5’-CGG CTC GAG GTG ACA GCT GCA TCT AG-3’)进行PCR扩增，得到两端分别带有ClaI和XhoI酶切位点的外壳蛋白基因cp的517nt的DNA片段；

用ClaI和XhoI双酶切PCR产物，将酶切片段定向插入pBS-PVYmNIb载体上NIb基因片段的上游，构建成第2个融合基因cn，重组载体命名为pBS-CN。

2、双抗性基因RNAiCAN及其表达载体的构建

1)用ClaI和KpnI双酶切载体pKANNIBAL，将切下的内含子pdk定向插入pGEM-CN上，与融合基因cn反向相连，形成融合基因-内含子复合序列cn-pdk，重组载体命名为pGEM-CNP；

2)用同尾酶XhoI和SalI双酶切植物表达载体pCAMBIA-1301，切除pCAMBIA-1301上的标记基因nptII的表达盒，得到无标记基因的pCAMBIA-1301；

3)用BglII和ClaI双酶切重组载体pGEM-CNP，切下融合基因-内含子复合序列cn-pdk；

4)用BstEII和ClaI双酶切重组载体pBS-CN，切下融合基因cn；

5)将融合基因-内含子复合序列cn-pdk与融合基因cn同时插入无标记基因的pCAMBIA-1301的BglII和BstEII切口处，使融合基因cn分别以正向和反向连接到内含子pdk的两侧，构建成一个人工融合基因的反向重复序列，该序列即为提高马铃薯对X病毒和Y病毒的双抗性基因RNAiCN。获得的重组载体就是双抗性基因RNAiCN的植物表达载体，命名为pRNAiCN。其质粒图谱及其构建过程见附图1。

6)对RNAiCN基因的植物表达载体pRNAiCN进行多酶切鉴定和多引物PCR扩增鉴定，酶切鉴定结果见附图2(泳道1为HindIII+ClaI双酶切产物，泳道2为HindIII+KpnI双酶切产物，泳道3为BstEII+XbaI双酶切产物，泳道4为XbaI单酶切产物，泳道5为PstI单酶切产物，泳道6为BglII单酶切产物)，多引物PCR扩增鉴定结果见附图3(泳道1为引物P1和P2的扩增产物；泳道2为引物P3和P4的扩增产物；泳道3为引物P4和P5的扩增产物；泳道4为引物P4和P6的扩增产物；泳道5为引物P5和P7的扩增产物)，表明pRNAiCN构建正确。

PCR扩增鉴定的引物序列为：

P1：5’-GTGTAAGACGAAGAAGAAGAT-3’；

P2：5’-GATCTATCATGTTACCTTG-3’；

P3：5’-AGATACCTTGCTGGGTGGT-3’；

P4：5’-AACCAAGATCTGAGAAGTG-3’；

P5：5’-ATAGTAGCCAGCAATGCCG-3’；

P6：5’-TACCTGAGAATTGGGTATAC-3’；

P7：5’-GAGTGACAGCTGCATCTAG-3’.

步骤三、将双抗性基因RNAiCAN导入马铃薯：

用农杆菌介导法将步骤三中构建的双抗性基因RNAiCAN的植物表达载体pRNAiCN导入马铃薯，具体方法包括以下步骤：

1、制备农杆菌LBA4404感受态细胞

取28℃振荡培养至OD₆₀₀为0.5的农杆菌LBA4404的菌液于5000rpm离心5min后弃上清，然后加入10mL 0.15M的NaCl溶液悬浮细胞，再5000rpm离心5min后弃上清，用1mL预冷的20mM CaCl₂悬浮细胞，冰浴后分装，液氮中速冻1分钟，置-70℃保存备用；

2、通过冻融直接转化法将融合基因反向重复序列导入农杆菌LBA4404

取200μL步骤1制备的农杆菌LBA4404的感受态细胞，加入1μg实施例2构建的RNAi基因的植物表达载体pRNAiCN，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基，28℃慢速振荡培养4h后于1000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mL YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素(Kan)和125μg/mL链霉素(Sm)的YEB平板上，28℃培养48h后，挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养基(含有100μg/mL卡那霉素和125μg/mL Sm)中，28℃振荡培养过夜。对菌液进行PCR鉴定，得到重组农杆菌，命名为LBA4404/pRNAiCN。

进行PCR鉴定所用引物序列为：

PrimeF：5’-CATGAAGGTGCCCACAGAC-3’；

PrimeR：5’-CGGATTCACAGCAATCAGC-3’。

3、通过农杆菌介导法将植物表达载体的RNAi基因导入马铃薯。

挑取农杆菌LBA4404/pRNAiCN单菌落于5ml YEB液体培养基(含100mg/LSm，100mg/L Kan)，28℃，150rpm振荡培养16-20h按照1∶100转接到YEB液体培养基中，振荡培养到OD₆₀₀0.5；6000rpm离心10min，弃上清。将30ml菌液离心所得沉淀用12ml 10mM MgSO₄重新悬浮，6000rpm离心10min，弃上清。用高糖液体培养基(MS基本培养基+1.6％葡萄糖+5mg/l NAA+0.1mg/l6-BA，pH5.3)重新悬浮，再重复一次除去抗生素，稀释菌液到OD₆₀₀为0.5，将稀释液倒入灭菌培养皿中。将培养在MS基本培养基上的马铃薯无菌苗的叶片沿叶基部剪下，垂直主脉横切2-3刀(每切口长0.1-1cm，切口间相距4-5mm)，叶正面朝下漂浮于稀释的菌液里，轻轻摇动混匀后，静置30min，后转入高糖固体培养基(pH5.8)共培养4d。然后将外植体放入分化培养基(MS基本培养基+0.02mg/l NAA+0.02mg GA₃+2.0mg/Zeat in+250mg/l Cef)光照培养，诱导生芽，每20d继代1次，待芽长至1-1.5cm时，将其转入MS基本培养基中诱导生根。

4、转基因马铃薯的分子检测

从分化的马铃薯试管苗中切取少量叶片，用SDS法提取基因组DNA，取100ng，进行PCR扩增，同时以构建的载体pRNAiCN的扩增产物作阳性对照；以同品种非转基因马铃薯植株的SDS法提取的基因组DNA的扩增产物作阴性对照。反应条件为：94℃变性5min；94℃变性1min；56℃复性1min，72℃延伸1min30s，循环30次；72℃补平8min。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果表明有18株可扩增出949bp的特异性条带，为阳性转基因植株，阴性对照未扩增出该特异性条带。

PCR扩增所用引物序列为：

PrimeF：5’-CATGAAGGTGCCCACAGAC-3’；

Prime R：5’-CGGATTCACAGCAATCAGC-3’。

将PCR检测阳性、生长正常的转基因植株，随机选取8株及1株非转基因马铃薯采用SDS法提取植物基因组DNA，取20μg，用HindIII酶切过夜后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，之后用毛细管转移法转移到带正电荷的尼龙膜上，以地高辛标记的融合片段为探针，按试剂盒说明(DIG High Prime Labeling andDetection Starter Kit I)进行Southern杂交，结果表明8株转基因植株均有阳性带出现，而非转基因植株则没有相应的阳性带出现。

步骤四、转基因马铃薯对PVX和PVY的双抗性鉴定：

将经过PCR检测和Southern杂交为阳性的8个植株定为转基因植株。对这8个转基因植株进行无性繁殖，形成8个转基因无性系。每个无性系在温室移栽3株，一株接种PVX，一株接种PVY，另一株同时接种PVX和PVY，同时以同品种非转基因马铃薯作对照，观测发病症状，并作DAS-ELISA分析。

PVX和PVY病毒的接种方法为：将分别感染了PVX和PVY病毒的叶片于液氮中研磨至粉末状，加10倍体积(W/V)的提取缓冲液(0.02M PB，pH7.0，配方为Na₂HPO₄.12H₂O，43.7g，NaH₂PO₄.H₂O 12.2g，蒸馏水定容至1L)，摇动混匀后4000rpm离心5min取上清。待马铃薯试管苗移栽成活1个月后，在中上部叶片正面撒上600目金刚砂，棉球蘸病毒汁液单向摩擦两次，1周后再重复接种病毒一次，共接种3次。

用碱性磷酸酶标记的PVX-IgG和PVY-IgG作为抗体。供试马铃薯每株取0.5g叶片液氮研磨，加5ml样品提取缓冲液(137mM NaCl，1.5mM KH²PO₄，8.1mMKH₂PO₄，2.7mM KCl和3.1mM NaCl₂，Ph7.4，并附加0.2％脱脂奶粉，0。05％Tween20，2％PVP(M44000)匀浆)，用双抗体夹心酶联免疫吸附(DAS-ELISA)方法测定转基因马铃薯植株中的PVX和PVY的含量。在每块酶联板上均设有未转基因植株不接种病毒的阴性对照和未转基因植株接种病毒的阳性对照。显色后用BIO-RAD 550酶联仪读数，测定出每一植株的OD₄₀₅值。每个样品均设3次重复。

对所得8个马铃薯转基因无性系和1个非转基因马铃薯无性系所进行的PVX和PVY接种试验，症状观察结果表明：8个转基因马铃薯无性系均对PVX和PVY表现免疫，叶片未出现花叶症状，非转基因马铃薯无性系对PVX和PVY都很敏感，叶片表现出花叶症状。所测ELISA值也与症状观察结果一致。