一种诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂及其应用

摘要

一种诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂及其应用，属生物技术领域。该有机活性诱导剂成分的质量百分比为：有机质21.5－52.5％(其中多糖含量0.3－15％)，无定形SiO230－54％，全N1.2－5％，P0.1－1.5％和K0.2－1.2％，其他9.8－23％；由下列步骤制成；该有机活性诱导剂的制备方法为：将医药工业生产青霉素的固－液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣∶硅藻土质量比为10∶1－3的比例，加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；将上述预混合料100℃－200℃鼓风干燥灭活0.5－2.5小时；挤压造粒或直接用，即得到诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂。该有机活性诱导剂作为诱导植物表达病程相关蛋白从而产生抗病性的应用。本发明具有效果佳、无公害、有广泛应用领域等优点，特别适宜需要大量农药才能控制病害的作物种植。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂及其应用，属生物技术领域。

背景技术：

长期以来，植物病害的防治主要依赖于抗病品种和化学农药。但由于现代社会对环境保护的日益重视，限制或减少化学农药在农业上的使用已是大势所趋；植物的遗传抗病性状常常与其它农艺性状常常难以有机结合，选育既抗病又高产、优质作物品种的难度越来越大，例如至今也未能培育出抗黄萎病的棉花品种，而且现推广的转基因抗虫棉品种在获得高效抗虫性后，抗病性不仅没有增强，反而大都有所降低。因此，研究探索植物保护的新技术、新途径一直是世界范围内农业科技工作者的重要努力方向。植物诱导抗病性也称系统抗病性，是指经诱导物处理后，植物体本身产生的对多种有害病原菌抗性，而非专一抗性的现象，植物体内未直接接触诱导物的部位也被诱导表达PRs蛋白(病程相关蛋白，Pathogenesis related proteins)是其最重要的生理指标。植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间长和利用安全方便等特点，被认为是植物病害防治的一种新途径、新技术，目前已成为国际上重要的农业研究领域。

为使植物诱导抗病性应用于农业生产，近20多年来国际上研究筛选有效的抗病诱导物，特别是能商业化生产的化学药剂，迄今已发现2，6-二氯异烟酸(INA)、苯并噻唑类制剂(BTH)和氨基丁酸(BABA)等化合物可诱导作物产生对黄萎病、枯萎病及叶斑病的抗性，其中苯并噻唑类制剂(BTH)已开始商业化生产；但因该诱导物为化学制剂，对多数农作物有药害，因此开发效果一般。而开发活的微生物作为诱导物虽可避免这个问题，但实际应用效果常常受到环境条件的影响，而且诱导物的制备工序复杂，成本较高，开发难度也很大。目前，研究开发无污染、施用安全的生物制剂是该领域的热点，发明人曾开发了一种诱导植物表达病程相关蛋白的有机肥(专利授权号：zl200510010824.8)，它同时具备良好肥效，又可诱导植物产生系统抗病性的有机肥，但由于营养物质完全来自于青霉素的发酵残渣，其N、P、K比例是固定的，不能适应各种不同植物生长发育的需求，且制备过程中的高温破坏了其中的多糖等活性成分，造成活性下降、资源浪费，因此，直接开发活性强的一种诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂，活性较高，既可以单独使用，又可以加入其它肥料中，是一种经济节约、适用面更广的方法。

参考文献：

1.Huges，D.W.and Galau，A.G.(1988)，Preparation of RNA from cotton leaves and pollen.Plant Mol.Bio.Rep.6：253-257

2.Melissa K.Hill，Lyon Karin J.，Lyon Bruce R.(1999)Identification of disease response genes expressedin Gossypium hirsutum upon infection with the wilt pathogen Verticillium dahliae.Plant MolecularBiology，40：289-296

3.Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular cloning：a laboratory manual.3rd edn..ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork

发明内容：

本发明的目的是在于通过对可诱导植物系统表达PRs蛋白的灭活青霉素生产残渣的研究，提供一种诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂及其应用。

本发明的有机活性诱导剂成分的质量百分比为：有机质21.5-52.5％(其中多糖含量0.3-15％)，无定形SiO₂30-54％，全N 1.2-5％，P0.1-1.5％和K 0.2-1.2％，其他9.8-23％。该有机活性诱导剂由下列步骤制成；

(1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣∶硅藻土质量比为10∶1-3的比例加入干燥的硅藻上，搅拌混合均匀；

(2)将上述预混合料100℃-200℃鼓风干燥灭活0.5-2.5小时；挤压造粒或直接用，即得到诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂。

本发明的有机活性诱导剂可加水制成混悬液直接灌根、也可按1份诱导剂加10-50份有机肥或其它肥料的形式以基肥、追肥的形式施用，既可诱导植物表达病程相关蛋白从而产生系统抗病性的应用。

本发明是这样实现的：

一、有机活性诱导剂的制备：

(1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣∶硅藻土质量比为10∶1-3的比例加入干燥的硅藻上，搅拌混合均匀；

(2)将上述预混合料100℃-200℃鼓风干燥灭活0.5-2.5小时；挤压造粒或直接用，即得到诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂。该工序利用青霉素高于80℃分解的特性，高温分解残留的青霉素，全部杀死青霉菌。

3、将制备的样品按常规标准检测，成分的质量百分比为：有机质21.5-52.5％(其中多糖含量0.3-15％)，无定形SiO₂30-54％，全N1.2-5％，P0.1-1.5％和K0.2-1.2％，其他9.8-23％。

二、诱导抗病性试验：

1、病原菌培养：

分别引起甜瓜、棉花枯萎病的病原菌Fusarium oxysporum f.sp.Melonis(race0、race1、race2、race1，2四个生理小种)；Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum接种到PDA培养基上，25℃黑暗培养，15天后收集孢子，用细胞计数器将孢子浓度调整到10⁶-10⁷个/ml。

2、病原菌的接种试验：

a.样品水提液的制备

取该有机活性诱导剂50g，加蒸馏水至10L，浸泡24小时，过滤得到0.5％浓度的水提液，或稀释到所需浓度。

b.对甜瓜枯萎病四个生理小种的抗病性实验

甜瓜(Cucumis melo L.cv.En-Dor)、按常规栽培管理，每种处理选长势一致的健康苗200株，用2％的有机肥水提液灌根，分别按标准方法接种甜瓜枯萎病病原菌四个生理小种的孢子，以植株1/3以上部分出现枯萎症状作为指标，统计病株率，可知该样品对有关作物病害的防治效果。

试验结果：0.1-0.5％的该有机活性诱导剂对于甜瓜枯萎病的四个生理小种均表现显著的防治作用，发病病株率可降低20-75％，说明该有机活性诱导剂所诱导的对甜瓜枯萎病不同生理小种的抗性没有选择性，符合诱导植物产生系统抗病性的一般规律。与原诱导抗病有机肥2-5％浓度效果相同，浓度却降低了100倍。

c.对不同棉花品种抗枯萎病的试验

四个品种棉花(Gossypium hirsutum L.cv.H552，Vered；Gossupium barbadense L.cv.P906，PF15)，按常规栽培管理，每种处理选长势一致的健康苗200株，用0.1-0.5％的有机活性诱导剂水提液灌根，分别按标准方法接种棉花枯萎病病原菌的孢子，以植株1/3以上部分出现枯萎症状作为指标，统计病株率，可知该样品对棉花病害的防治效果。

实验结果：虽然4个供试品种对棉花枯萎病的遗传抗病性差别很大，陆地棉H552、Vered为感病品种和海岛棉P906，PF15为抗病品种，但使用本发明的有机活性诱导剂0.1-0.5％水提液灌根后，发病株率皆比各自空白对照显著降低20％-50％，说明品种的遗传抗病性并不影响该有机活性诱导剂的防病效果。与原诱导抗病有机肥2-5％浓度效果相同。

3、病程相关蛋白基因表达检测

a.样品水提液的制备：

取该有机活性诱导剂50g，加蒸馏水至10L，浸泡24小时，过滤得到0.5％浓度的水提液。

b.棉苗的培养和诱导：

取陆地棉(Gossypium hirsutum L)品种鲁棉研21号的种子，采用常规沙培的方法于28℃的条件下培养。待棉苗子叶平展后，以浓度0.5％的诱导抗病性肥水提液灌根，以蒸馏水灌根为对照。于灌根后6、8、12、24和48h取下子叶，置液氮中冷冻固定，然后于-80℃下保存备测。

c.总RNA的提取：

根据Hughes和Galau(1988)的方法和Melissa(1999)的改进方法，分别提取各处理组的子叶总RNA。利用260/280光吸收值和琼脂糖电泳的方法确保各样品浓度和质量一致；

d.PR蛋白基因表达的检测：

每个样品取10μg RNA经过甲醛变性胶电泳后，转膜至Hybond-N⁺膜上，亚甲兰染色，根据28S rRNA的量，确保膜上每个样品RNA的浓度和质量得一致性。将8种不同PRs蛋白基因片段(见表1)以内切酶切下后，利用随机引物法将片段标记32pdCTP，作为探针，用于Northern杂交分析。Northern杂交根据标准方法进行(Sambrooket al.，2001)，杂交完成后压X-光片(Kodark)-80℃曝光5-6天。根据X-光片上的曝光强度可以直观的观察到不同处理时间各种PR蛋白基因的相对表达量。

表1、用于标记探针的质粒

基因    片段大小    质粒    限制性内切酶PR-1a    809bp    pBs    EcoR IPR-1b    约550bp    pBs    EcoR IPR-2    1204bp    pBs    Bam H I/Hind IIIPR-3    1020bp    pBs    EcoR IPR-4    645bp    pBs    EcoR IPr-5    900bp    pBs    EcoR V/Pst I酸性几丁质酶(A-C)    1018bp    pBs    EcoR I碱性几丁质酶(B-C)    1064bp    pBs    EcoR I

e.试验结果

对棉花根部不同时间的水提掖处理，利用Northern杂交的方法，在远离根部的子叶中检测出PR-2、PR-1a、PR-1b、酸性几丁质酶和碱性几丁质酶基因出现持续性的诱导表达。效果与与原诱导抗病有机肥一致。

已知PRs蛋白的易位累积，均不是通过转移从感染部位或诱导物处理部位移动到其它部分的，因此在未直接处理物的子叶检出部分PR蛋白的大量表达，说明本发明制备的有机活性诱导剂能够诱导棉花产生系统抗病性(systemic acquired resistance)，而不仅仅是局部抗性(local resistance)。

本发明具有效果佳、无公害、有广泛应用领域等优点，特别适宜需要大量农药才能控制病害的作物种植。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：

将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣∶硅藻土质量比为10∶1的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；将上述预混合料200℃鼓风干燥灭活1.5小时；挤压造粒，即可得到诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂。有机活性诱导剂成分的质量百分比为：有机质52.5％，无定形SiO₂30％，全N5％，P1.5％和K1.2％，其他9.8％；

将该有机活性诱导剂按每亩5公斤的量加入普通有机肥中混匀，在烟草品种红花大金元漂浮育成的小苗移栽入大田时，作为基肥施入土壤，常规栽培、管理，结果表明：病株率比对照下降28％。

实施例二：

基本同实施例一，不同之处为：残渣和干燥硅藻土的比例为10∶2，150℃干燥灭活2小时，有机活性诱导剂成分的质量百分比为：有机质41.5％，无定形SiO₂40％，全N3％，P1％和K1％，其他13.5％；

将该有机活性诱导剂加水制成混悬液直接灌根，以每亩5公斤用量施入，常规栽培、管理烟草品种红花大金元，结果表明：病株率比对照下降42％。

实施例三：

基本同实施例一，不同之处为∶残渣和干燥硅藻土的比例为10∶3，100℃鼓风干燥灭活2.5小时。不造粒，直接作为诱导植物产生系统抗病性的有机活性诱导剂。有机活性诱导剂成分的质量百分比为：质量百分比为：有机质21.5％，无定形SiO₂54％，全N1.2％，P0.1％和K0.2％，其他23％；

将该有机活性诱导剂加水制成混悬液直接灌根，以每亩8公斤用量施入，常规栽培、管理烟草品种红花大金元，结果表明：病株率比对照下降40％。

实施例四：

基本同发明内容中诱导抗病性试验c步骤的过程。不同之处为：取烟草品种红花大金元漂浮育成的小苗进行试验。

本发明的有机活性诱导剂可以诱导植物表达PR-1b、PR-3、PR-5、酸性几丁质酶，产生系统抗病性，具备了很好的应用开发前景。