通过过敏反应疫苗的粘膜给药预防性治疗过敏反应的方法

摘要

本发明涉及在对象体内预防性治疗对过敏原的过敏反应的方法，包括在对象的粘膜表面施用含有所述过敏原作为活性物质的过敏反应疫苗，a)其中，所述要治疗的对象被致敏，以便表现出对所述过敏原特异的IgE反应，b)其中，所述要治疗的对象没有与所述过敏原相关的过敏反应的临床症状，和c)其中，所述预防性治疗的目的是预防或减轻与所述过敏原相关的过敏反应的随后的临床症状。

说明书

发明领域

本发明涉及在对象体内预防性治疗对过敏原的过敏反应的方法，包括在对象的粘膜表面施用过敏反应疫苗。

发明背景

过敏反应是采用西方生活方式国家的主要健康问题。另外，过敏性疾病的流行在这些国家日益增加。尽管一般来说，过敏反应不被认为是危险生命的疾病，但每年哮喘会导致大量的死亡。青少年中大约30％的异常的流行，导致了生活质量，工作日和金钱的显著降低，并且在西方世界构成了健康问题的主要类型。

过敏反应是复杂的疾病。由多种因素造成了过敏事件，其中包括由若干种基因之间尚未充分了解的相互影响所决定的个体的易感性。另一个重要因素是接触超过某种阈值的过敏原。在致敏过程中有若干环境因素可能是重要的，包括污染、儿童感染、寄生虫感染、肠道微生物等。一旦个体被致敏，并且建立了过敏免疫反应，只是少量过敏原的存在就能有效转变为症状。

过敏性疾病的天然过程通常伴随着在两种水平上的加重。首先是症状的发展和疾病的严重性，以及疾病的发展，例如，从花粉热转变成哮喘。其次，入侵的过敏原的传播最常见的是导致过敏性多种反应。慢性炎症导致粘膜防御机制的总体削弱，导致了非特异性刺激，并最终破坏所述粘膜组织。因而可能主要因为食品，即乳制品而过敏，导致湿疹或肠胃失调；不过，最常见的是它们自发地出现上述症状。所述婴儿在它们的生活中随后会发生吸入过敏反应的危险。

最重要的过敏原来源是我们吸入的空气中特定大小的最常见的颗粒。所述来源显然是普遍的，并且包括青草花粉和房屋尘螨粪便颗粒，它们共造成了所有过敏反应的大约50％。具有全球性重要性的还包括动物毛屑，即猫和狗毛屑，其他花粉，如野艾花粉，以及微型真菌，如链格孢属。在区域基础上，还有其他花粉起着支配作用，如北欧和中欧的桦树花粉，美国东部和中部的豚草，以及日本的日本雪松花粉。昆虫，即蜜蜂和黄蜂毒液，以及食品各自占所有过敏反应的大约2％。

过敏反应，即I型超敏反应是由对外源非致病物质的不适当的免疫反应引起的。过敏反应的重要的临床表现包括哮喘、花粉热、湿疹、胃肠道失调。过敏反应在接触入侵的过敏原时迅速发生，并且在20分钟之内达到高峰。另外，过敏反应是特异性的，即特定的个体对特定的过敏原敏感，而所述个体不一定对已知会导致过敏性疾病的其他物质产生过敏反应。过敏现象的特征是目标器官的粘膜的显著发炎，以及IgE类型的过敏原特异性抗体在循环系统中以及在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的存在。

过敏攻击是由外源过敏原与过敏原特异性IgE抗体起反应引起的，此时所述抗体以高的亲和力与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的IgE特异性受体结合。所述肥大细胞和嗜碱性粒细胞包括预形成的介体，即组胺、类胰蛋白酶和其他物质，它们是在两种或两种以上受体结合的IgE抗体交联时释放的。IgE抗体是通过一个过敏原分子的同时结合交联的。因此，遵循只有一个抗体结合表位的外源物质不会引起过敏反应的原则。结合在肥大细胞表面上的IgE的受体的交联，还导致了负责将嗜酸性粒细胞，过敏原特异性T-细胞，和其他类型的细胞吸引到过敏反应部位的信号传导分子的释放。所述细胞与过敏原，IgE和效应细胞相互作用，导致在接触过敏原之后12-24小时再次出现过敏症状(后期反应)。

过敏性疾病控制包括诊断和治疗，包括预防治疗。过敏反应的诊断涉及验证过敏原特异性IgE和确定过敏原来源。在很多情况下，认真的既往病历就足以诊断过敏反应，并且确定入侵的过敏原来源材料。不过，最常见的是，诊断是通过客观测定，如皮肤穿刺试验、验血或诱发试验支持的。

治疗选项分为三种主要类型。第一种可能是避开过敏原或减少接触。而避免过敏原是显而易见的，例如，对于食物过敏原来说就是如此。但也可能是困难的或昂贵的，如对于房屋尘螨过敏原来说，或它也许是不可行的，如对于花粉过敏原来说。第二种和最广泛使用的治疗方法是开处典型的对症治疗药物，如抗-组胺和类固醇。对症治疗药物是安全的和有效的；不过它们不会改变有关疾病的天然病因，也不能控制疾病传播。第三种治疗方案是特异性过敏反应疫苗接种，在大部分情况下，这样做可以减轻或缓解由相关过敏原引起的过敏症状。

传统的特异性过敏反应疫苗接种是过敏性疾病的病因疗法。它能干扰基础免疫机制，导致患者免疫状态的持久性改善。因此，特异性过敏反应疫苗接种的保护作用延长到超过治疗时间，与对症药物治疗相反。某些接受治疗的患者被治愈了，另外，大部分患者经历了疾病严重程度和所经历症状的缓解，或至少抑制了疾病的发展。因此，特定的过敏反应疫苗接种具有预防作用，能降低干草热发展成哮喘的风险，并且降低了出现新的过敏反应的风险。

尚不了解支持成功的过敏反应疫苗接种的免疫学机制的细节。已知，特异性免疫反应，如抗特定病原体的抗体的产生是适应性免疫反应。这种反应有别于先天性免疫反应，先天性免疫反应是针对病原体的非特异性反应。过敏反应疫苗致力于解决适应性免疫反应的问题，它包括具有抗原特异性的细胞和分子，如T-细胞和产生抗体的B-细胞。如果没有具有相应特异性的T-细胞的帮助的话，B-细胞不能成熟为能产生抗体的细胞。参与过敏性免疫反应攻击的T-细胞主要是Th2型的。业已提出了Th1和Th2细胞之间新的平衡的建立对于特异性过敏反应疫苗接种的免疫学机制来说是有利的和重要的。这是否是通过Th2细胞减少，从Th2到Th1细胞的偏移，或Th1细胞的上调所引起的是可疑的。最近，业已提出了调控T-细胞对过敏反应疫苗接种的机制来说是重要的。根据这种模型调控T-细胞，即Th3或Tr1细胞，下调了具有相应的抗原特异性的Th1和Th2细胞。尽管存在这些不确定性，但一般认为活性疫苗必须具备刺激过敏原特异性T-细胞，优选TH1细胞的能力。

尽管具备优点，特异的过敏反应疫苗接种并没有广泛使用，这主要是由于两个原因。一个原因是，与传统疫苗接种方案相关的不方便性，该方案包括重复的疫苗接种，即在几个月时间内进行注射。另一个更重要的原因是，出现过敏副反应的危险。针对感染物的普通疫苗接种是通过一次或几次大剂量免疫接种有效进行的。不过，这种方法不能用于过敏反应疫苗接种，因为业已发生了病理性免疫反应。

因此，常规特异性过敏反应疫苗接种是通过在较长时间内多次皮下免疫接种进行的。这一过程可以分成两个阶段，加大剂量阶段和维持阶段。在加大剂量阶段，从小的剂量开始，增加接种剂量，通常持续16周时间。当达到推荐的维持剂量时，在维持阶段采用该剂量。通常每六周注射一次。在每次注射之后，患者必须接受30分钟的医疗看护，因为存在过敏性副反应的危险，尽管极为罕见，但原则上这种副反应可能威胁生命。另外，诊所的装备应当能支持急诊处理。毫无疑问的是，基于不同施用途径的疫苗可以消除或减少现有基于皮下注射疫苗所固有的过敏性副反应，以及有利于更广泛的使用，甚至能够在家中进行自我疫苗接种。

改善特异性过敏反应疫苗接种的尝试业已进行了30年以上，并且包括各种各样的方法。已有若干种方法通过改变IgE反应性集中在过敏原本身。

Fanta等(Int.Arch.Allergy Immunol，1999，120：218-224)涉及在青草花粉过敏性患者组内通过SLIT诱导的免疫学变化的研究，所述患者是按照以下标准选择的：在青草花粉散粉季节具有临床症状(鼻炎和/或季节性支气管哮喘)，对青草花粉提取物表现出阳性皮肤单刺试验，和对青草花粉的特异性IgE，这是通过RAST-CAP确定的。SLIT是通过舌下给药施用过敏原提取物的滴剂进行的。

Holt等(“Suppression of IgE responses following inhalationof antigen”，Immunology Today，vol.8，No.1，1987)提到了以下事实，作为对接触吸入的或口鼻滴入的过敏原的反应，在上呼吸道诱导了相应于在胃肠道通过饮食抗原诱导的反应的耐受性。

Holt等(“Sublingual allergen administration.I.Selectivesuppression of IgE production in rats by high allergen doses”，Clinical Allergy，1988，Volume 18，pages 229-234)涉及连续七天对首次用于实验的大鼠进行过敏原(卵白蛋白)的舌下给药，在最后一次舌下给药5天之后，用卵白蛋白进行肠胃外攻击，结果表明IgE对卵白蛋白特异的选择性抑制作用。据推测，所述治疗机制涉及过敏原-特异性抑制细胞的攻击。该文献还披露了所提出的治疗首次用于实验的动物相关，并且应当不同于舌下脱敏方法。

WO 95/17208披露了预防过敏性疾病的方法，包括给以前未致敏的对象施用一定剂量的过敏原，该剂量能有效诱导过敏原-特异性T-辅助-1-样记忆淋巴细胞的稳定群体的建立，所述细胞能够抑制过敏原-特异性T-辅助-2-样淋巴细胞的活性。所述要治疗的对象优选3个月至7岁大。例如，作为过敏原可以是屋尘螨，青草花粉和树木花粉。所述过敏原的给药可以通过口腔，鼻内，口鼻，直肠，真皮内，肌内或皮下途径进行。

例如，主页www.immunetolerance.org(2004年10月11日)上披露了没有对吸入剂致敏的儿童的预防性治疗的有计划的临床研究，其中，给所述儿童施用含有任意过敏原(屋尘螨、梯牧草和猫)的舌下滴剂，并且其中，所述儿童在随后三年出现过敏反应。该研究招募的所述儿童具有特应性皮炎或食物过敏反应病史，并且他们的生物学母亲或父亲或一个同胞具有特异反应性病史。

本发明的目的是提供预防性治疗个体，特别是儿童的改进方法。

发明概述

通过本发明实现了这一目的，本发明涉及在对象体内预防性治疗对过敏原的过敏反应的方法，包括在对象的粘膜表面施用包括所述过敏原作为活性物质的过敏反应疫苗，

a)其中，所述要治疗的对象被致敏，以便表现出对所述过敏原特异的IgE反应，

b)其中，所述要治疗的对象没有所述过敏原相关的过敏反应的临床症状，和

c)其中，所述预防性治疗的目的是预防或减轻所述过敏原相关的过敏反应的随后的临床症状。

本发明基于以下新的发现，可以预防在个体中出现对所述过敏原的过敏反应症状，所述个体的免疫系统业已接触了过敏原，但其中，所述免疫反应还没有发展到与临床症状，如鼻炎、结膜炎、鼻漏、鼻塞、鼻窦炎、喷嚏、特应性皮炎、瘙痒、流泪、流鼻涕、喘鸣和皮肤刺激相关的状态。迄今为止一直相信为了获得过敏反应的有效的预防性治疗，要治疗的个体应当没有被致敏。另外，迄今为止一直相信与预防过敏反应相关的机制是诱导与通过饮食抗原在胃肠道诱导的反应相应的口腔耐受性的诱导。不过，根据本发明，已令人吃惊地证实，通过治疗业已致敏，但尚未表现出任何临床症状的个体可以获得预防效果。据信，获得的预防效果通过某种机制起作用，该机制与在特异性过敏反应疫苗接种(免疫疗法)中发生的脱敏的机制部分或完全相似。

还相信，在致敏之后在免疫系统反应开始进一步向过敏性Th2细胞反应发展之前尽可能快地进行预防性治疗是最有效的。换句话说，在儿童业已接触过敏原之后在它们尽可能小的时候进行治疗一般是有利的。另外，据信，由于早期预防性治疗的效果，治疗能够以更小的剂量更少的施用次数和/或更短的治疗时间进行，以上比较是相对出现了临床症状的成年人特异性过敏反应疫苗接种而言的。由于预防性治疗方法的柔和性，它适用于所有儿童或大型特定儿童群体的一般性疫苗接种方法。

本发明方法的其他优点是致敏个体是最可能出现过敏反应的个体，因此致敏的个体构成了进行预防性治疗的最相关的人群。

本发明还涉及将过敏原用于生产用来在对象体内预防性治疗过敏反应的粘膜疫苗的用途，

a)其中，所述要治疗的对象被致敏，以便表现出对所述过敏原特异的IgE反应，

b)其中，所述要治疗的对象没有所述过敏原相关的过敏反应的临床症状，和

c)其中，所述预防性治疗的目的是预防或减轻所述过敏原相关的过敏反应的随后的临床症状。

附图的简要说明

图1A表示用5000 SQ Phl p或缓冲液鼻内攻击的致敏小鼠临床资料(打喷嚏次数)。

图1B表示用5000 SQ Phl p或缓冲液鼻内攻击的致敏小鼠体内血清IgE水平。

图1C表示用5000 SQ Phl p或缓冲液鼻内攻击的致敏小鼠体内BALIgE水平。

图1D表示用5000 SQ Phl p或缓冲液鼻内攻击的致敏小鼠体内NALIgE水平。

图1E表示用5000 SQ Phl p或缓冲液鼻内攻击的致敏小鼠体内NAL嗜酸性粒细胞水平。

图2A表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的的致敏小鼠的临床资料(打喷嚏次数)。

图2B表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠对醋甲胆碱攻击的反应(通过Penh值衡量)的呼吸道过敏反应。

图3A表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠体内血清IgE水平。

图3B表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠体内血清IgG₁水平。

图4A表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠体内BAL IgE水平。

图4B表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠体内NAL IgE水平。

图4C表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠体内BAL IgA水平。

图4D表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠体内NAL IgA水平。

图5A表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠的BAL嗜酸性粒细胞过氧化物酶水平。

图5B表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠的NAL嗜酸性粒细胞过氧化物酶水平。

图6A表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠脾脏中的T细胞增殖。

图6B表示进行SLIT或缓冲液处理，并且用Phl p进行鼻内攻击的致敏小鼠淋巴结(LN)细胞内的T细胞增殖。

发明的详细说明

过敏原

本发明制剂的过敏原可以是业已报导了在反复接触个体时能够诱导过敏性，即IgE介导的过敏反应的任何天然存在的蛋白。天然存在的过敏原的例子包括花粉过敏原(树木、药草、杂草和青草花粉过敏原)，昆虫过敏原(吸入剂、唾液和毒液过敏原，例如，螨虫过敏原、蟑螂和蠓过敏原、膜翅目昆虫(hymenopthera)毒液过敏原)，动物毛发和皮屑过敏原(例如，来自狗、猫、马、大鼠、小鼠等)，以及食物过敏原。来自树木、草类和药草的花粉过敏原是：来自分类学上以下目的植物：山毛榉目、油橄榄目(Oleales)、松目和悬铃木科，包括桦树(桦属)、桤木(赤杨)、榛木(榛属)、鹅耳枥属(CarpInus)和橄榄(Olea)、雪松(柳杉属和桧属)、悬铃木(法国梧桐)、禾本目(Poales)包括黑麦草属、梯牧草属、早熟禾属、绊根草属、猫尾草、绒毛草属、虉草属、乔麦和高粱属、菊目和荨麻目包括豚草属、蒿属、和墙草属的药草。其他重要的吸入性过敏原是来自以下属的家庭尘螨：表皮螨属和欧螨属、储螨属，例如，LepIdoglyphys，食甜螨属和食酪螨属，来自蟑螂、蠓和跳蚤的过敏原，例如，小蠊属、大蠊属、摇蚊属和Ctenocepphalides，以及来自哺乳动物，如猫、狗和马的过敏原、毒液过敏原，包括如来自螫咬或叮咬昆虫，如来自分类学上的膜翅目，包括蜜蜂(总科蜜蜂科)、黄蜂(总科黄蜂科)和蚂蚁(总科蚁科)的过敏原。来自真菌的重要的吸入过敏原，如来自支链孢属和枝孢菌属的过敏原。

在本发明的特定实施方案中，所述过敏原是Bet v 1、Aln g 1、Cor a 1和Car b 1、Que a 1、Cry j 1、Cry j 2、Cup a 1、Cup s 1、Jun a 1、Jun a 2、jun a 3、Ole e 1、Lig v 1、Pla l 1、Pla a 2、Amb a 1、Amb a 2、Amb t 5、Art v 1、Art v 2 Par j 1、Par j 2、Par j 3、Sal k 1、Ave e 1、Cyn d 1、Cyn d 7、Dac g 1、Fes p 1、Hol l 1、Lol p 1 and 5、Pha a 1、Pas n 1、Phl p 1、Phl p 5、Phl p 6、Poa p 1、Poa p 5、Sec c 1、Sec c 5、Sor h 1、Der f 1、Der f 2、Der p 1、Der p 2、Der p 7、Der m 1、Eur m 2、Gly d 1、Lep d 2、Blo t 1、Tyr p 2、Bla g 1、Bla g 2、Per a 1、Fel d 1、Can f 1、Can f 2、Bos d 2、Equ c 1、Equ c 2、Equ c 3、Mus m 1、Rat n 1、ApIs m 1、ApI m 2、Ves v 1、Ves v 2、Ves v 5、Dol m1、Dil m 2、Dol m 5、Pol a 1、Pol a 2、Pol a 5、Sol i 1、Soli 2、Sol i 3和Sol i 4、Alt a 1、CIa h 1、Asp f 1、Bos d 4、Mal d 1、Gly m 1、Gly m 2、Gly m 3、Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 4、Ara h 5或来自上述任意一种的分子繁殖的改组子(shufflant)杂合体。

在本发明的优选实施方案中，所述过敏原选自下列一组：树木花粉过敏原、青草花粉过敏原、药草过敏原和动物过敏原，优选所述过敏原选自青草花粉过敏原、尘螨过敏原、豚草属过敏原、雪松花粉、猫过敏原和桦树过敏原。

在本发明的另一种实施方案中，所述制剂包括至少两种不同类型的过敏原，所述过敏原来自相同的过敏原来源或来自不同的过敏原来源，例如，1型和5型草类过敏原，或1型和2型螨虫过敏原，分别来自不同的螨虫和草类，杂草抗原，如矮小和巨大豚草属过敏原，不同的真菌过敏原，如支链孢属和枝孢菌属、树木过敏原、如桦树、榛木、鹅耳枥、橡树和赤杨过敏原，食物过敏原，如花生、大豆和牛奶过敏原。

掺入所述制剂中的过敏原可以是提取物形式的，纯化的过敏原，改性的过敏原，重组过敏原或重组过敏原的突变体。过敏原提取物可天然含有相同过敏原的一种或多种异构型，而重组过敏原通常只代表过敏原的一种异构型。在优选实施方案中，所述过敏原是提取物形式的。在另一种优选实施方案中，所述过敏原是重组过敏原。在另一种优选实施方案中，所述过敏原是天然存在的低IgE-结合变体或重组低IgE-结合变体。

过敏原能够以相同的摩尔数量存在或所存在的过敏原的比例可以优选波动到1∶20。

在本发明的另一种实施方案中，所述低IgE结合过敏原是如WO99/47680，WO 02/40676或WO 03/096869 A2所述的过敏原。

预防性治疗

从本世纪开始业已将特异性过敏反应疫苗接种(SAV)，以前称之为特异性免疫治疗或脱敏作用，用于治疗1型IgE介导的过敏性疾病。

通过SAV获得的一般性优点包括：a)减轻过敏性症状和医疗消费，b)在眼睛，鼻子和肺中改善对所述过敏原的耐受性和c)减轻皮肤反应性(早期和晚期反应)。

通过SAV获得的改善的根本机制尚不了解，不过，可以从在过去十年中进行的多项SAV研究中提取出多项共同特征：1)在治疗期间总的IgE数量没有改变，2)在加大剂量期间，过敏原特异性IgE的数量短时间增加，然后又回落到起始(预处理)水平，3)IgE的表位特异性和亲和力保持不变，4)过敏原特异性IgG，特别是IgG4，在SAV期间快速升高，5)表面上启动了新的Th0/1/Reg反应和6)Th2反应似乎没有改变。在由SAV诱导的作用和特异性IgG发作之间没有相关性。

SAV诱导了新的免疫反应，它在治疗期间成熟(募集了Th0/1 T-细胞，启动了过敏原特异性IgX(X可能是A1，A2，G1，G2，G3，G4，M或D))。作为新的抗体反应的亲和力(或数量/亲和力)，IgX业已成熟，IgX可能与IgE有效竞争所述过敏原，抑制″正常″Th2型过敏性反应，以肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的受体结合的IgE的交联为特征。因此，临床症状会逐渐减轻。

据信，本发明中进行的预防性治疗至少能在某种程度上通过与上文所述SAV相同的机制起作用。

要施用所述过敏反应疫苗的粘膜可以是任何合适的粘膜，并且给药途径包括口腔(通过消化系统粘膜)、鼻腔、阴道、舌下、眼睛、直肠、尿道、乳腺内、肺、耳内(即通过耳朵)和含服给药，优选含服或舌下给药(口腔粘膜给药)。所述过敏反应疫苗可以是喷雾剂、气溶胶、混合物、悬浮液、分散液、乳液、凝胶、糊剂、糖浆、乳膏、油膏、植入物(耳朵、眼睛、皮肤、鼻子、直肠、和阴道)、乳房内制剂、阴道托(vagitories)、栓剂、或子宫托(uteritories)形式的。

据推测，优选通过粘膜进行疫苗的粘膜给药，所述粘膜自然接触抗原制剂。因此，对于气载粘膜抗原制剂的过敏反应来说，优选通过呼吸系统给药，优选口腔粘膜给药。相应地，对于粘膜抗原制剂的过敏反应来说，它要与消化系统的粘膜接触，优选采用口腔给药。

在本发明的一种实施方案中，所述对象接受了疫苗接种方案，包括每天施用所述疫苗。在本发明的另一种实施方案中，所述疫苗接种方案包括每两天，每三天，或每四天施用一次疫苗。例如，所述疫苗接种方案包括施用所述疫苗超过4周，优选超过8周，更优选超过12周，更优选超过16周，更优选超过20周，更优选超过24周，更优选超过30周，最优选超过36周。

给药时间可以是连续时间。或者，给药时间是由一个或多个不给药期打断的不连续的时间。优选的是，不给药的(总)时间比给药的(总)时间短。

在本发明的另一种实施方案中，每天给受试个体施用一次疫苗。或者，每天给所述受试个体施用两次疫苗。所述疫苗可以是单一剂量的疫苗。

口腔粘膜给药

口腔粘膜给药可以用任何现有的口腔粘膜给药制剂，包括溶液，悬浮液，快速分散剂型，滴剂和锭剂进行。

在本发明的优选实施方案中，采用了舌下免疫疗法(SLIT)，在这种情况下，快速分散剂型，滴剂和锭剂是优选的制剂。

快速分散剂型的例子可以参见US-A-5,648,093，WO 00/51568，WO 02/13858，WO99/21579，WO 00/44351，US-A-4,371,516和EP-278877，以及待审批的DK PA 2003 00279和DK PA 2003 00318，都是以受让人ALK-AbellóA/S的名义申请的。优选的快速分散剂型是通过冷冻干燥生产的。生产制剂的优选的基质是鱼明胶和改性淀粉。

典型的增量剂量减敏作用可用于本发明，其中，将快速分散固体剂型形式的过敏原的剂量加大到某一最大限度。所述剂型的单位剂量的优选效力为150-1000000SQ-u/剂型，更优选的效力为500-500000SQ-u/剂型，更优选的效力为1000-250000SQ-u/剂型，更优选1500-125000SQ-u/剂型，最优选1500-75000SQ-u/剂型。

在本发明的另一种实施方案中，所述剂型是重复的单一剂量，优选在1500-75000SQ-u/剂型范围内。

致敏

要治疗的对象被致敏，以便表现出对所施用过敏原特异的IgE反应。在本发明中，短语“表现出对所述过敏原特异的IgE反应”表示在至少一种免疫测定中可检测到的过敏原-特异性IgE抗体水平。所述过敏原-特异性IgE抗体的检测可以用任何常规免疫测定方法进行，例如，参见WO 94/11734和WO 99/67642。

在本发明的具体实施方案中，进一步对所述对象进行致敏，以便表现出对所述过敏原特异的Th2细胞反应。

在本发明的具体实施方案中，进一步对所述对象进行致敏，以便在皮肤单刺试验(SPT)中表现出阳性过敏原-特异性反应。

在本发明的其他具体实施方案中，所述对象的年龄小于40岁，优选小于30岁，更优选小于20岁，最优选为2-10岁。

临床症状

要治疗的对象没有所述过敏原相关的过敏反应的临床症状。

所述过敏原相关的过敏反应的临床症状可以是任何常见症状，包括鼻炎、结膜炎、鼻漏、鼻塞、鼻窦炎、喷嚏、特应性皮炎、瘙痒、流泪、流鼻涕、喘鸣和皮肤刺激。

有多种因素是发生过敏反应的指标，随后在生命中表现出临床症状。表现出一种或多种这些指示因素的以下对象被称作高危对象。高危对象的指示因素是与除了疫苗的过敏原以外的一种或多种过敏原相关的过敏反应的临床症状。高危对象的其他指示因素是在父母或祖父母之一或两者或在一个或多个同胞兄妹中存在一种或多种过敏反应。本发明的预防性治疗特别适用于高危对象。不过，要治疗的对象还可以是没有表现出高危对象的指示因素的对象，例如，没有对其他过敏原的过敏反应的临床症状。

过敏反应疫苗的制备

用于本发明方法中的过敏反应疫苗可以是适合粘膜表面施用的任何制剂形式，包括喷雾剂、气溶胶、混合物、片剂(肠溶和非肠溶片剂)、胶囊(硬质和软质、肠溶和非肠溶)、悬浮液、分散液、颗粒、粉末、溶液、乳液、咀嚼片剂、滴剂、凝胶、糊剂、糖浆、乳膏、锭剂(粉末、颗粒、片剂)、快速分散片剂、滴注液体、气体、蒸汽、油膏、条状物、植入物(耳朵、眼睛、皮肤、鼻子、直肠和阴道)、乳房内制剂、阴道托、栓剂、或子宫托。

应当理解的是，本发明的制剂还包括适合所述制剂类型的其他佐剂和其他赋形剂。所述其他佐剂和赋形剂为本领域技术人员所公知，并且包括，例如，溶剂、乳化剂、湿润剂、增塑剂、着色物质、填料、防腐剂、黏度调节剂、缓冲剂、和粘膜黏性物质等。配制方法的例子为本领域技术人员所熟知。

佐剂

所述粘膜过敏反应疫苗可以包括佐剂，它可以是任何常规佐剂，包括含氧金属盐，热不稳定性肠毒素(LT)，霍乱毒素(CT)，霍乱毒素B亚基(CTB)，聚合化脂质体，突变型毒素，例如，LTK63和LTR72，微囊剂，白细胞介素(例如，IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、INFγ)，GM-CSF、MDF衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、phosphophazenes、Adju-Phos、葡聚糖、抗原制剂、脂质体、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、DOC/明矾复合物、弗氏不完全佐剂、ISCOMs、LT Oral佐剂、胞壁酰二肽、单磷酰脂质A、胞壁酰三肽、和磷脂酰乙醇胺。

所述含氧金属盐可以是任何含氧金属盐，只要能提供需要的效果即可。在优选实施方案中，所述含氧金属盐的金属阳离子选自下列一组：Al、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au和Cr。在优选实施方案中，所述含氧金属盐的金属阴离子选自下列一组：硫酸盐、氢氧化物、磷酸盐、硝酸盐、碘酸盐、溴酸盐、碳酸盐、水合物、乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐和酒石酸盐，以及它们的混合形式。例子有氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、醋酸铝、硫酸铝钾、磷酸钙、Maalox(氢氧化铝和氢氧化镁的混合物)、氢氧化铍、氢氧化锌、碳酸锌、氯化锌、和硫酸钡。

参见WO 04/047794，水溶液或快速分散片剂形式的过敏反应疫苗特别适合含服和舌下给药。

使用粘膜给药评估免疫调节治疗方法的作用的方法

本发明还涉及在试验动物体内评估免疫调节治疗方法对过敏原的过敏反应的作用的方法，该方法包括以下步骤

a)使所述动物对所述过敏原致敏，

b)通过鼻腔或气管内接触对所述动物进行第一次过敏原攻击，

c)使用口腔粘膜给药对所述动物实施所述治疗方法，

d)对生物标记的水平进行测量，和

e)使用所述测量结果评估所述治疗方法的效果。

Herz等(Methods 32(2004)271-280)是一篇综述性文章，披露了多种动物模型。在一种这样的模型中，参见3.1部分，通过腹膜内注射rBet v 1和用Bet v 1提取物的气溶胶攻击使小鼠致敏。然后，通过注射免疫优势肽或通过粘膜施用rBet v 1获得免疫调节作用，这在致敏之前或之后进行。鼻内或口腔施用rBet v 1导致了所有同种型的过敏原-特异性抗体水平的抑制作用，减少了IL-4，IL-5和IFN-γ，以及抑制了首次试验动物和致敏动物的呼吸道炎症和呼吸道过敏反应。Herz等披露了多种其他模型，参见表2，同样包括用过敏原进行各种类型的肠胃外，鼻内和口腔致敏，例如，施用抗体、细胞因子进行攻击和治疗、皮肤试验、组胺释放、嗜酸性粒细胞、呼吸道炎症和T细胞等等。

本发明正是基于这样的任何，可以尝试将口腔粘膜给药用在评估免疫调节治疗方法在试验动物中对过敏原的过敏反应的作用的评估方法。

本发明动物模型试验方法的原理是，使试验动物对过敏原致敏，即进行处理，以便表现出对所述过敏原的过敏性免疫反应，然后用所述过敏原攻击，以便诱导过敏性反应，然后可以进行测量和评估，其中，进一步对所述动物实施治疗方法，然后可以研究所述方法对过敏性反应的影响。

所述试验动物可以是通常被用作试验动物的任何动物，包括啮齿类动物，例如，小鼠、大鼠、豚鼠和兔子、猪、狗、猫和猴子。

在本发明的具体实施方案中，所述口腔粘膜给药是舌下给药(舌下免疫疗法(SLIT))。用于所述治疗方法中的所述过敏原和制剂可以是上面结合过敏反应的预防性治疗方法所披露的任何过敏原和制剂。

在进行口腔粘膜给药时，应当确保所述制剂能够在口腔的预定部位保持预定时间。在本发明的具体实施方案中，可以防止所述试验动物吞咽。例如，防止吞咽可以通过用手固定所述动物实现。例如，对于啮齿类动物来说，可以通过将颈部皮肤的折纹固定在两个手指之间以便紧固头部周围的皮肤防止吞咽。另外，还可以通过施用麻醉剂防止吞咽，如吸入麻醉剂，例如，乙醚、三氟溴氯乙烷和七氟醚，或注射麻醉剂，例如，芬太尼、氟阿尼酮和咪达唑仑的混合物，芬太尼、氟阿尼酮和安定的混合物，克他命和美托咪定的混合物，克他命和甲苯噻嗪的混合物，阿替美唑、尿烷和三溴乙醇。

在本发明的另一种实施方案中，所述治疗方法是在致敏之后并且在第一次过敏原攻击之前进行的。或者，所述治疗方法是在第一次过敏原攻击之后进行的。在后一种例子中，通过鼻腔或气管内接触进行的任选的第二次过敏原攻击可以在所述治疗方法之后进行。

在本发明的另一种优选实施方案中，所述生物标记选自下列一组：过敏原-特异性抗体，临床症状和效应细胞。所述抗体可以是任何类型，亚型或它们的组合，包括IgA，IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM。所述过敏原的抗体特异性的检测是使用任何常规免疫测定方法进行的，优选的免疫测定方法可以参见WO 94/11734和WO 99/67642。临床症状可以是常用于动物模型的任何症状，包括打喷嚏次数，擦鼻子次数等。例如所述效应细胞可以是选自下列一组：嗜酸性粒细胞，肥大细胞，嗜碱性粒细胞，B细胞，T细胞，抗原呈递细胞(APC’s)以及由上述细胞衍生的细胞。在本发明的一种实施方案中，效应细胞的水平是通过测量效应细胞标记的水平测定的。所述标记优选选自下列一组：分泌分子，表面分子和细胞内分子。优选的是，所述分泌分子选自下列一组：介体，细胞因子，细胞毒性蛋白和可溶性受体。

所述治疗方法的效果是根据上述测量结果评估的，测量结果是根据对成功治疗的免疫反应的生物标记的表现的一般性科学认识进行的。

定义

在本发明中，使用了以下定义：

术语″口腔粘膜给药″表示将所述剂型放置在舌头下面或口腔中的任何地方的给药途径，使得活性成分与患者口腔或咽喉的粘膜接触，以便获得所述活性成分的局部或系统性作用。口腔粘膜给药途径的例子是舌下给药。

术语″舌下给药″表示给药途径，其中，将剂型放置在舌头下面，以便获得活性成分的局部或系统作用。

术语″SQ-u″表示SQ-单位：SQ-单位是按照ALK-AbellóA/S′s″SQ生物效能″-标准化方法测定的，其中100,000SQ单位等于标准的皮下维持剂量。通常，1mg的提取物含有100,000-1,000,000SQ-单位，这取决于过敏原的来源和所使用的生产方法。可以通过免疫测定确定确切的过敏原含量，即总的主要过敏原含量和总的过敏原活性。

短语“免疫调节治疗”表示能调节接受治疗的对象的免疫反应的治疗。

具体实施方案

例1：SLIT在鼻炎的小鼠模型上的作用

基本原理：

建立了鼻炎模型，以便检验舌下免疫疗法(SLIT)在具有临床表现的小鼠模型上的作用。

方法：

动物

对6-10周大的雌性BALB/c小鼠进行圈养，并且用不含能与梯牧草(Phl p)的抗血清交叉反应的成分的特定饮食维持。每一个实验组包括8-10只动物。

动物实验

通过三次腹膜内(i.p.)注射吸附在明矾上的Phl p提取物对小鼠进行致敏，然后用Phl p-提取物或缓冲液进行舌下治疗6-9周时间。随后用Phl p-提取物对小鼠进行鼻内攻击两周时间，并且按以下方法分析临床症状。在宰杀放血之后，收集支气管肺泡液体(BAL)，鼻咽液体(NAL)，脾脏和颈淋巴结用于分析。

临床资料

喷嚏和擦鼻子：在鼻内施用Phl之后用10分钟时间观察小鼠，并且统计打喷嚏次数和擦鼻子次数。

呼吸道超敏反应：采用整个身体容积描记图(pletysmograph)，通过加大气溶胶化的醋甲胆碱的浓度诱导气流阻塞。肺气流阻塞是通过施用醋甲胆碱之后在6分钟时间内增强的停顿(penh)测定的。

IgA分析

结合在山羊抗小鼠IgA上的Estapore磁珠(Estapore IB-MR/0，86)与BAL或NAL一起培养。然后洗涤并且用生物素化的过敏原培养。然后洗涤并且用抗生物素蛋白链菌素标记的LITE制剂进行培养，并且在洗涤之后，用光度计(Magic Lite Analyser EQ)测定发光。

IgE分析

结合在山羊抗小鼠IgE上的Estapore磁珠(Estapore IB-MR/0，86；A0201)与小鼠血清一起培养。然后洗涤并且用生物素化的过敏原培养。然后洗涤并且用抗生物素蛋白链菌素标记的LITE制剂进行培养，并且在洗涤之后，用光度计(Magic Lite Analyser EQ)测定发光。

IgG，IgG1和IgG2a分析

将Phl p(10μg/ml)提取物添加到ELISA平板的孔中，并且在4-8℃下将所述平板静置到次日。然后用缓冲液洗涤经过包衣的平板，并且用2％酪蛋白缓冲液在室温下在振动台上封闭一小时。在除去酪蛋白缓冲液之后，将稀释的血清样品添加到所述平板上，并且在室温下在振动台上培养2小时。洗涤所述平板，并且将用0.5％BSA缓冲液稀释的生物素化的兔抗-小鼠IgG/IgG1/IgG2a添加到每一个孔中，并且在室温下在振动台上放置一小时。在洗涤之后，将稀释在0.5％BSA缓冲液中的抗生物素蛋白链菌素-HRP添加到每一个孔中，并且在室温下在振动台上放置一小时。用TMP底物(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)显影所述平板20分钟，然后用0.5M H2SO4终止。所得到的反应混合物在450nm的终点下进行分光光度计测量。

T-细胞增殖试验

将脾脏挑碎成单细胞悬浮液，并且用培养基洗涤三次。统计细胞数量，并且调整到1.67×10⁶细胞/mL。将3×10⁵细胞添加到96孔平底培养板的每一个孔中，并且用0，10和40μg/mL Phl p提取物攻击所述细胞。在37℃和5％CO₂中培养所述细胞6天时间，通过在培养阶段的最后18小时将0.5μCi的3H-胸腺嘧啶添加到每一个孔中，然后收获细胞并且统计整合的放射性标记来测量增殖。

结果

鼻炎的诱导

从图1A-E中可以看出，在腹膜内注射致敏之后用Phl p提取物(5000SQ/小鼠/天)对小鼠进行鼻内(IN)攻击两周表现出明确的鼻炎症状。首先，它们打喷嚏的次数明显比用缓冲液攻击的致敏的小鼠多(图1A)。其次，在血清，BAL和NAL中具有较高的IgE水平(图1B-D)。第三，这些小鼠在NAL中的嗜酸性粒细胞粒细胞的流量增强(图1E)。

SLIT在鼻炎小鼠模型上的作用

为了评估SLIT在上述鼻炎的鼠类模型上的作用，用125.000SQ Phlp提取物或缓冲液对致敏小鼠进行舌下处理9周时间，然后用Phl p进行鼻内攻击。另外，一组致敏小鼠不进行舌下处理，并且用缓冲液对它们进行鼻内攻击，因此被用作阴性对照。

参见图2，SLIT-治疗能够减轻临床症状，因为与缓冲液-处理的小鼠相比，打喷嚏次数显著减少(图2A)。类似地，对醋甲胆碱攻击作出反应的气道超敏反应性(通过Penh值测量)减轻，特别是在用5-15mg/mL的剂量对小时进行攻击时(图2B)。

另外，血清中的抗体水平受SLIT-治疗的影响。参见图3，与缓冲液处理的小鼠相比，在SLIT-处理的小鼠体内，Phl p特异性IgE(图3A)和IgG1(图3B)的血清水平显著降低。

在SLIT-处理的小鼠的BAL和NAL液体中特异性IgE水平同样降低，而特异性IgA水平在BAL中降低，但是在NAL液体中不明显(参见图4A-C)。

另外，以上结果表明，与缓冲液处理的小鼠相比，在SLIT-处理的小鼠中，BAL和NAL的嗜酸性粒细胞粒细胞水平均显著降低(参见图5A-B)。

最后，检查了用Phl p提取物重新攻击时脾脏和颈淋巴结(LN)细胞(舌头引流物)的离体反应性。尽管在脾脏中存在Phl p-特异性T-细胞反应下调的趋势，但是，这种趋势在统计学上不明显(图6A)。与此相反，与缓冲液-处理的小鼠相比，在SLIT-处理的小鼠中在引流的颈部LNs中对Phl p的T-细胞反应(图6B)显著减弱。

结论

以上结果表明，SLIT治疗能够在鼻炎的鼠类模型上减轻疾病的临床，血清学和细胞特征。