植物发育和形态学的修饰

摘要

本发明涉及修饰植物形态学的方法，所述方法包括将至少一种含启动子序列的嵌合基因导入植物中，所述启动子序列与核酸序列有效连接，所述启动子序列引导在植物特定细胞中的表达，所述核酸序列编码至少一种能够改变特定细胞和/或邻近细胞的代谢或引起特定细胞和/或邻近细胞死亡的基因产物。具体地说，所述启动子序列有效引导在侧芽或侧枝中的表达，所述核酸序列编码至少一种能够破坏侧芽或侧枝或邻近细胞的代谢或引起侧芽或侧枝或邻近细胞死亡的基因产物。优选所述启动子序列包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.7或SEQ IDNo.4所示的序列，或其能够调节基因表达的部分，或与SEQ ID No.1或SEQ ID No.7具有至少60％、优选至少75％的同源性并能够调节基因表达的序列。

说明书

发明领域

本发明涉及修饰植物的发育和形态学的方法。本发明进一步涉及DNA序列调节植物组织中的外源基因表达的用途。本发明再进一步涉及用作启动子的已鉴别DNA序列，所述启动子有效引导在植物特定细胞中的表达。

发明背景

植物形态学控制在农艺或园艺用途植物的商业生产中对提高生产能力和产量、提升耕作率和收获率以及达到美学期望很重要。需要控制或修饰的特征可包括花、果实或块茎的形态学；花、果实、种子或块茎的品质；初生根和侧根的程度；地上枝或干的形式以及刺或螫毛的存在。期望能控制的其它特征包括叶、花或果实脱落的提前或延迟；种子释放以及贮存器官或分泌腺的生产。

由于环境对植物的影响，包括物理伤害、草食动物捕食、病原体感染、冷、热和干旱，经常发生形态学变化。它们经常可有意地通过物理(剪枝、曲枝、结捆、定标或切除特定器官或结构)或化学(施加农用化学品和植物生长刺激素)的人为干预产生。无论哪个是致变因素，形态学改变都由植物自身细胞中的基因表达演绎。在变化发生时，在其中需要细胞生长、增殖、发育或坏死的具体组织中出现一个或多个基因的表达启动，使总物理变化达到顶点。

基因表达依靠其DNA序列，所述DNA序列通过RNA聚合酶作用转录为RNA。为实现此转录，RNA聚合酶必须识别并连接至位于基因编码区上游(即5′)的DNA序列区，以便启动转录。此区域称为该基因的启动子。启动子序列的固有特征决定了基因表达的环境和方式。

概括地讲，在植物组织中存在4类启动子：组成型启动子、组织特异型启动子、发育调节型启动子和诱导型/阻抑型启动子，但应当理解，这些类型相互之间不一定是排它性的。

组成型启动子引导基因在植物发育过程中遍及植物各个部分连续表达，尽管所述基因在所有细胞类型中可能不以相同水平表达。已知组成型启动子的实例包括与花椰菜花叶病毒35S转录物(Odell等，1985)、水稻肌动蛋白1基因(Zhang等，1991)和玉米泛素1基因(Cornejo等，1993)关联的启动子。

组织特异型启动子引导基因在植物的一个(或几个)部分中表达，通常贯穿这些植物部分终生。组织特异型启动子类别一般还包括其特异性不是绝对的启动子，即其还可在非优选组织的组织中以较低水平引导表达。本领域已知的组织特异型启动子的实例包括与在马铃薯块茎中表达的Patatin(马铃薯块茎储藏蛋白)基因和在小麦、大麦或玉米胚乳中表达的高分子量谷蛋白基因关联的启动子。

发育调节型启动子在植物的一个或多个部分中于植物发育过程中的特定时间引导基因表达改变。所述基因可在其它时间以不同(通常较低)的水平在该植物部分中表达，也可在其它植物部分中表达。

诱导型启动子能够引导基因在诱导物作用下表达。在没有诱导物时，基因不表达。诱导物可直接作用于启动子序列，或者可通过抵消阻抑蛋白分子的作用起作用。诱导物可为化学物质，例如代谢物、蛋白、生长调节物或毒性物质、生理应力(如热、伤害或渗透压)，或者为病原体或害虫作用的间接结果。发育调节型启动子可描述为在植物生命周期中的特定时间点，对植物产生的内源诱导物或环境刺激有反应的特定类型的诱导型启动子。已知诱导型启动子的实例包括如Warner等(1993)所述的与创伤反应关联的启动子、如Benfey和Chua(1989)公开的与温度反应关联的启动子以及如Gatz(1995)所述的化学诱导启动子。

启动子序列可包含众多对其功能必须的限定结构域。这些结构域中的第一个包含约70个碱基对，紧接着位于结构基因上游(即5′)，形成核心启动子。核心启动子包含CAAT和TATA盒，确定基因的转录起始位点。核心启动子上游的一系列调节序列构成了启动子序列的剩余部分，并决定了表达水平、表达的空间和时间模式以及对诱导物的响应。另外，某些启动子含用于增强表达水平的序列元件，例如国际专利申请号WO 97/20056中描述的来源于豌豆质体蓝素启动子的序列元件。

植物的遗传修饰依靠嵌合基因在植物细胞中的导入及其在启动子引导之下的受控表达。启动子可得自不同来源，包括动物、植物、真菌、细菌和病毒，不同的启动子在不同组织中可以不同的效力起作用。启动子还可以合成构建。

可能经常期望在植物的众多不同组织中表达导入的基因。例如，病原体或害虫抗性或温度极限耐受的表达最好能遍及植物中的所有组织。同样可期望确保转基因在植物整个发育过程总是表达。另外，以对诱导物或阻抑蛋白效应(起因于无法预料的环境刺激)免疫的方式表达的启动子也可用于确保性状的连续表达。对于这些用途，使用“组成型”启动子应合乎需要。组成型启动子的实例包括CaMV 35S启动子。对于谷类，泛素启动子是组成型启动子的一个选择(Christensen和Quail，1996)。

但是，在某些情况下，更期望控制基因表达在转基因植物中的位置。这可通过确保在基因产物作用最有效的组织中优先表达来增强基因表达的作用。基于同样观点，调节后的表达可通过限制植物资源流失而减少潜在产量损失。其它优势包括在基因产物必须限制在某些组织中或排除在某些组织外的情况下，通过局部化或区室化基因表达，将农艺学上有用但一般有害的基因的表达限于特定组织中。例如，suc抑制基因的花药特异性表达(Mariani等，1990)业已用于雄性不育系统，而在植物其它部分中的表达会产生毒性。在国际专利申请WO89/10396中描述了相似的细胞死亡系统，其中RNA酶蛋白和花药特异性启动子组合使用，以引起花药细胞坏死，赋予植物雄性不育性。

在国际专利申请WO 02/33106和WO 02/33107中描述了植物细胞死亡系统，其通过在线虫取食位点特异性启动子调节下表达核糖体失活蛋白(玉米核糖体失活蛋白，美洲商陆抗病毒蛋白)，提供了对线虫感染的抗性。在这些情况下，通过既是组织特异性又对线虫侵入有反应的启动子增强有害基因表达的特异性。

在某些情况下，可在植物中相似或不同的位置表达两个或更多个转基因。各转基因均可在于一个以上植物区中表达的不同启动子控制下表达。可选择启动子，以使其各自表达位点在一个或多个目标位置有重叠。此重叠位点使基因表达的特异性和靶向性增强。通过定向选择各个转基因编码的基因产物，两个转基因的重叠表达可导致对靶组织的作用加合或增强，而转基因中仅一个单独在其它位置表达都可不对植物产生作用。例如，在国际专利申请WO 02/33106中，来自玉米核糖体抑制蛋白(RIP)的两个分离的肽结构域在两个不同组织特异性启动子调节下表达，所述结构域具有不同的表达谱，但仍然共有一个位点，导致在重叠部位产生活性蛋白。

相反，两个转基因可编码效应分子和激动剂分子或杀虫剂。在此情况下，效应分子在其表达的所有位置都影响植物，除了表达位点与激动剂或杀虫剂分子的表达位点重叠的位置。在NZ 260511中提出了具有增加的组织特异性的植物细胞死亡系统。该系统含细胞毒性分子表达(处于第一个启动子控制之下，所述第一个启动子在特异性靶细胞中以及植物中的一个或多个其它部位引起表达)，连同保护性分子表达(处于第二个启动子控制之下，所述第二个启动子在第一个启动子有活性的所有位点引起表达，特异性靶细胞除外)。合适的细胞毒性和保护性分子的实例分别为蛋白酶和蛋白酶抑制剂，或分别为核酸酶和核酸酶抑制剂。WO 93/10251公开了细胞毒性核糖核酸酶分子Barnase连同保护性抑制剂分子Barstar的用途。

国际专利申请号WO 98/44138中提供了双组分转基因系统的另一个实例。该系统包含在启动子控制下的基因产物表达，选择所述启动子和基因产物，以使其各自的表达和效应位点在目标位置有重叠。启动子引导在植物特定细胞连同一个或多个其它位点中的表达，而基因产物的分子靶标存在于也包含特异性靶细胞在内的第二个细胞范围内。此重叠位点使基因表达对目标位置细胞的特异性和靶向性增强。通过定向选择由转基因编码的基因产物，非靶细胞中的表达对植物不产生作用。

特定组织局部表达有害基因的主要应用在于修饰植物形态学，例如通过控制某些组织或器官的坏死或阻止某些组织或器官发育，所述组织或器官例如为开花结构、子实体、贮藏组织、枝条、叶组织、根组织、离区、分泌腺、刺细胞、毛状体或刺。

局部表达有害基因以修饰植物形态学的具体用途可为防止叶腋分生组织的侧枝侧生长。腋分生组织和侧芽的解剖学描述于Esau(1960)。当去除或降低顶枝优势度时，最经常发生侧枝侧生长；例如当通过物理损伤或草食动物捕食偶然损伤或去除顶枝时，或者作为农业实践的一部分如矮林作业损伤或去除顶枝时。修饰例如内源植物生长刺激物质的生产、转运、检测或代谢的其它改变也可引起腋分生组织侧生长。侧枝或“侧枝芽”可能由于纯美学原因而不合需要，可产生具有无用形态学的植物，或者可通过用作各种代谢物或植物生长物质的附加源或壑而对植物整体具有有害的代谢作用。

发生侧芽侧生长的一个实例出现在市售烟草栽培物中，在该栽培物中含花序和顶叶的顶枝以一种称为“切除尖端”的方法在植物生长过程中的特定时间被去除，以刺激保留叶的生长和发育、增强根生长以及促使代谢物和次生化合物再分配至植物叶。切除尖端法的缺点是其还刺激侧枝侧生长，由此抵消了期望的代谢物再分配。该作用通常通过高度劳力密集的物理去除侧枝或施加化学枝条抑制剂如马来酰肼克服，所述化学枝条抑制剂既在材料上昂贵，又可能导致在收获的植物上存有化学残余物。因此，通过特异性引导这些涉及侧芽侧生长的细胞裂解阻止这种“萌条”的系统为烟草栽培物提供了巨大利益。

核糖体失活蛋白(RIP)是一组催化失活真核生物核糖体的毒性植物蛋白(Stirpe和Barbieri 1986)。PIP用作N-糖苷酶，以去除大rRNA保守环中的特异性腺嘌呤，由此防止延长因子2结合，因此封闭细胞蛋白合成。业已描述了3种形式的RIP。1型RIP如美洲商陆抗病毒蛋白和大麦翻译抑制剂各自均由单个多肽链组成，各自均具有约30,000的M_r值。2型RIP如蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白和莫迪素(modeccin)各自均含两条多肽链，一条具有RIP活性，通过二硫键连接至另一条结合半乳糖的凝集素链。3型RIP如玉米RIP含单个多肽链，其随后经历蛋白酶剪切，以释放两个活性肽结构域。

美洲商陆(Phytolacca americana)产生3种不同的抗病毒蛋白，即分别出现在春季叶、夏季叶和种子中的PAP′、PAPII和PAP-S。业已观测了这3种蛋白之间的氨基酸相似性。本文使用的‘PAP’涵盖全部这3种抗病毒蛋白。

US 6 015 940公开了由美洲商陆春季叶制备的PAP′cDNA克隆制备物及其在组成型启动子(或者是花椰菜花叶病毒35S启动子，或者是玄参花叶病毒35S启动子)控制下生产抗病毒PVX和PVY感染的转基因烟草和马铃薯植物的用途。

在WO 99/60843中已描述了含秋季叶形式的PAP、PAP-II的转基因植物。为了鉴别保留抗病毒活性但未表现出植物毒性的那些病毒PAP-II蛋白，筛选众多全长和截短的PAP-II基因序列。转基因植物同时表现出抗病毒和抗真菌活性。

PAP基因首先在叶中体内表达，以产生失活Pro-PAP蛋白。已知在翻译后Pro-PAP′蛋白分子被靶向细胞壁。在此过程中的某些阶段，Pro-PAP′分子的N-和C-末端突出端被裂解，产生活化的PAP′分子(成熟PAP′)。就PAP-S(在种子中表达)而言，细胞定位是未知的。但是，PAP-S的N-末端加工区似乎具有类似于用于靶向的信号序列的特性。

成熟PAP-S蛋白的结构，即去除了N-和C-末端突出端的结构，可以两个单独的结构域描述，这两个单独的结构域对应于3型RIP的两个结构域或2型RIP的两个多肽，即核糖体结合域和催化域。

发明概述

在本发明的一个方面，提供一种修饰植物形态学的方法，该方法包括将至少一种嵌合基因导入植物中，所述嵌合基因包含与核酸序列有效连接的启动子序列，所述启动子序列有效引导植物特定细胞中的表达，所述核酸序列编码至少一种能够改变特定细胞和/或邻近细胞代谢的基因产物。

在一个实施方案中，所述基因产物能够增强特定细胞和/或邻近细胞的代谢或增进特定细胞和/或邻近细胞的活力。

在另一个优选实施方案中，所述基因产物能够破坏特定细胞和/或邻近细胞的代谢或引起特定细胞和/或邻近细胞的死亡。

在又一方面，本发明提供一种修饰植物形态学的方法，该方法包括将至少一种嵌合基因导入植物中，所述嵌合基因包含与核酸序列有效连接的启动子序列，所述启动子序列有效引导在侧芽和/或侧枝中显著特异性地表达，优选在侧芽发端细胞中显著特异性地表达，所述核酸编码至少一种能够改变侧芽和/或侧芽发端细胞和/或邻近细胞代谢的基因产物。

在一个实施方案中，基因产物能够增强特定细胞和/或邻近细胞的代谢或增进特定细胞和/或邻近细胞的活力。

在另一个优选实施方案中，所述基因产物能够破坏特定细胞和/或邻近细胞的代谢或引起特定细胞和/或邻近细胞的死亡。

本文使用的术语“显著特异性地”指本发明启动子有效引导主要在侧芽和/或侧枝中的表达。本发明启动子除了可有效引导在侧芽和/或侧枝中的表达以外，还可有效引导在植物中其它细胞类型或组织中的表达，前提是在侧芽和/或侧枝内存在优势表达(即植物中整体(总)表达的至少51％以上)。

本发明启动子除了可有效引导在侧芽和/或侧枝中的表达以外，还可有效引导在植物中其它细胞类型或组织中的表达，前提是植物中的整体表达仅影响(或显著影响)分生组织侧生长。

本发明启动子除了可有效引导在侧芽和/或侧枝中的表达以外，还可有效引导在植物其它细胞类型或组织中的表达，前提是整体表达不致死植物。

优选地，本文使用的术语“显著特异性地”指本发明启动子有效引导主要在植物侧芽和/或侧枝中的表达，使得例如与所述启动子有效连接的核酸序列主要在侧芽和/或侧枝中表达，所述核酸序列在植物的任意其它植物组织或细胞中的表达低于整体表达水平的50％，优选低于25％，优选低于10％，更优选低于5％。

例如，在本发明启动子控制下表达的核酸序列主要可在侧芽和/或侧枝中表达，在任意其它组织中的表达低于整体表达水平的25％，优选低于10％，更优选低于5％。

所述启动子序列可包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.7或SEQ ID No.4所示序列或其功能部分，或与其具有至少60％同一性的序列。

优选所述启动子序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.7或SEQ ID No.4所示序列或其功能部分，或与其具有至少60％同一性的序列。

优选所述启动子序列包含SEQ ID No.1所示序列或其功能部分，或与其至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％相同的序列。

优选所述启动子序列包含SEQ ID No.7所示序列或其功能部分，或与其至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％相同的序列。

在本发明的一个实施方案中，植物形态学受到一个或多个基因产物的影响，优选受到一个基因产物的影响。

在本发明的另一个实施方案中，植物形态学受到两个或更多个基因产物的影响。优选所述核酸序列编码两个或更多个基因产物。因此，仅作为实例，可将一个嵌合基因导入到植物中，所述嵌合基因包含编码两个或更多个基因产物的核酸序列。或者可将两个或更多个嵌合基因导入到植物中，每个嵌合基因均含有编码基因产物的核酸序列。仅作为实例，可将两个或更多个嵌合基因导入到植物中，每个嵌合基因均含有编码一个或多个基因产物的核酸序列。因此，例如，一个嵌合基因可包含编码一个基因产物的核酸序列，另一个嵌合基因可包含编码多个基因产物(即2、3或4个基因产物)的核酸序列。或者，两个嵌合基因可包含编码多个基因产物的核酸序列。优选所述两个或更多个基因产物彼此独立地起作用，以通过加合作用实现对细胞代谢的破坏。或者，所述两个或更多个基因产物彼此相互作用，以通过协同作用或拮抗作用实现对细胞代谢的破坏。

优选修饰侧枝侧生长。侧枝侧生长可增强。适宜地，可防止或降低和/或延迟侧枝侧生长。

优选通过破坏参与侧芽发育的细胞的代谢或引起该细胞的死亡来修饰侧枝侧生长。

参与侧芽发育的细胞可包括原分生组织细胞、原表皮层细胞、表皮层细胞、气孔细胞、保卫细胞、内皮层细胞、周皮细胞、皮层薄壁组织细胞、刺细胞、储藏细胞、胚珠内胚乳细胞、花粉细胞、离区细胞、毛状体细胞、分泌细胞、木栓细胞、木栓形成层细胞、栓内层细胞、原形成层细胞、形成层细胞、原生木质部细胞、木质部细胞、射线细胞、原生韧皮部细胞、韧皮部细胞、厚角组织细胞、厚壁组织细胞、薄壁组织细胞、绿色组织细胞、原套细胞、原体细胞、皮层细胞、先出叶结构细胞和叶结构细胞。

本文使用的术语“特定细胞”指其中启动子优势表达的细胞，优选其中启动子显著特异性表达的细胞。

术语“植物特定细胞”包括侧芽和/或侧枝细胞，即参与侧芽发端和/或发育的细胞。

在一个实施方案中，“植物特定细胞”优选为侧芽和/或侧枝细胞。

在一个实施方案中，植物特定细胞可为以下的一种或多种细胞：原分生组织细胞、原表皮层细胞、表皮层细胞、气孔细胞、保卫细胞、内皮层细胞、周皮细胞、皮层薄壁组织细胞、刺细胞、储藏细胞、胚珠内胚乳细胞、花粉细胞、离区细胞、毛状体细胞、分泌细胞、木栓细胞、木栓形成层细胞、栓内层细胞、原形成层细胞、形成层细胞、原生木质部细胞、木质部细胞、射线细胞、原生韧皮部细胞、韧皮部细胞、厚角组织细胞、厚壁组织细胞、薄壁组织细胞、绿色组织细胞、原套细胞、原体细胞、皮层细胞、先出叶结构细胞和叶结构细胞。

本文使用的术语“优势表达的”指本发明启动子有效引导主要(即大于总表达的51％)在植物特定细胞(例如侧芽和/或侧枝细胞)中的表达，尽管在其它细胞类型或组织中可存在较低水平的表达。

例如，业已发现，本发明启动子有效引导主要在侧芽和/或侧枝中的表达，但在别的组织或细胞类型中也可有表达。例如，在创伤组织和/或茎和/或叶组织中也可有表达。

适宜地，可防止或降低和/或延迟侧芽或侧枝的侧生长。优选通过破坏参与侧芽和/或侧枝发育的细胞代谢或引起参与侧芽和/或侧枝发育的细胞死亡来修饰侧芽或侧枝的侧生长。

本文使用的术语“侧芽组织”包括侧芽细胞和/或侧枝细胞。

优选能够破坏特定细胞和/或邻近细胞代谢或引起特定细胞和/或邻近细胞死亡的核酸序列的基因产物为有害产物，适宜地为细胞毒性分子。

优选能够破坏特定细胞和/或邻近细胞代谢或引起特定细胞和/或邻近细胞死亡的核酸序列的基因产物为核糖体失活蛋白(RIP)或其变体或功能部分。例如，RIP可为1型RIP和/或2型RIP和/或3型RIP或其变体或功能部分。所述基因产物优选为美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)或其变体或功能部分。所述基因产物可为PAP′或PAPII或其变体或功能部分。更优选所述基因产物为美洲商陆抗病毒蛋白S(PAP-S)或其变体或功能部分。

本发明还提供核酸，所述核酸含如SEQ ID No.1所示的启动子序列或其功能部分，或与其具有至少65％同一性、更优选与其具有至少75％同一性、更优选与其具有至少85％同一性、更优选与其具有至少95％同一性、更优选与其具有至少97％同一性、更优选与其具有至少98％同一性、最优选与其具有至少99％同一性并能够调节基因表达的序列。

本发明还提供核酸，所述核酸含如SEQ ID No.7所示的启动子序列或其功能部分，或与其具有至少65％同一性、更优选与其具有至少75％同一性、更优选与其具有至少85％同一性、更优选与其具有至少95％同一性、更优选与其具有至少97％同一性、更优选与其具有至少98％同一性、最优选与其具有至少99％同一性并能够调节基因表达的序列。

本发明还提供嵌合基因，所述嵌合基因含与核酸序列有效连接、如SEQ ID No.1所示的启动子序列或其功能部分，或与其具有至少65％同一性、更优选与其具有至少75％同一性、更优选与其具有至少85％同一性、更优选与其具有至少95％同一性、更优选与其具有至少97％同一性、更优选与其具有至少98％同一性、最优选与其具有至少99％同一性并能够调节基因表达的序列。

本发明还提供嵌合基因，所述嵌合基因含与核酸序列有效连接、如SEQ ID No.7所示的启动子序列或其功能部分，或与其具有至少65％同一性、更优选与其具有至少75％同一性、更优选与其具有至少85％同一性、更优选与其具有至少95％同一性、更优选与其具有至少97％同一性、更优选与其具有至少98％同一性、最优选与其具有至少99％同一性并能够调节基因表达的序列。

本发明还提供嵌合基因，所述嵌合基因含与核酸序列有效连接、如SEQ ID No.4所示的启动子序列或其功能部分，或与其具有至少65％同一性并能够调节基因表达的序列。

优选本发明的核酸序列和/或核酸和/或本发明的嵌合基因为DNA序列。

在一个实施方案中，本发明的嵌合基因是可获得的，优选得自克隆pBNP 085-0501-001(NCIMB 41343)。

优选地，所述核酸序列能够调节附加序列的表达。适宜地，所述附加序列编码蛋白或RNA、共抑制序列、反义序列或dsRNA(双链RNA)抑制序列。

优选地，所述附加序列是可获得的，优选得自植物。所述植物可为茄科家族一员。优选地，所述植物可为夜香树亚科(Cestroideae)亚家族一员。更优选所述植物为以下的一种或多种：番茄、马铃薯、茄子、碧冬茄属或烟草。更优选所述植物来自烟草(Nicotiana)属。最优选所述植物为普通烟草(Nicotiana tabacum)。

优选所述附加序列能够破坏特定细胞和/或邻近细胞的代谢或引起特定细胞和/或邻近细胞的死亡。优选所述附加序列编码美洲商陆抗病毒蛋白或其功能部分。

本文提到的核酸序列和/或核酸和/或嵌合基因可为分离的序列，或者可为合成序列。

本发明还提供含载体DNA和本发明核酸序列和/或本发明核酸和/或本发明启动子序列和/或本发明嵌合基因的重组DNA。适宜地，所述重组DNA还可包含基因编码序列。优选地，所述载体DNA包括质粒、粘粒、病毒或噬菌体。适宜地，所述重组DNA可包含引导选择标记基因表达的启动子。

优选地，所述重组DNA处于宿主细胞中。适宜地，所述宿主细胞可允许所述重组DNA的转录和翻译。

本发明进一步提供按照本发明方法生产的植物。本发明进一步提供基因工程改造过的植物，其包含本发明的核酸序列和/或核酸和/或启动子序列和/或嵌合基因。优选地，所述核酸和/或启动子序列与基因编码序列有效连接。

按照本发明的再一方面，提供含本发明重组DNA的植物。本发明植物可为园艺产业、花艺产业、林学产业和/或农艺产业的目标。所述植物可以是为提供切花而培育的植物。所述植物可为番茄、黄瓜、碧冬茄属、石竹、云杉、松属、桉属、杨属、双子叶植物物种，例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、茄子、甜瓜、南瓜、豌豆、卡诺拉、大豆、糖甜菜或向日葵，或单子叶植物物种，例如小麦、大麦、黑麦、稻或玉米。更优选所述植物属于茄科家族。更优选所述植物属于夜香树亚科(Cestroideae)亚家族。更优选所述植物为以下的一种或多种：番茄、马铃薯、茄子、碧冬茄属或烟草。更优选所述植物属于烟草(Nicotiana)属。最优选所述植物为普通烟草(Nicotiana tabacum)。

本发明再进一步提供按照本发明方法生产的植物的植物细胞，所述植物细胞具有改变的代谢。按照本发明方法生产的植物细胞可具有被改变得增强其代谢的代谢。优选地，按照本发明生产的植物细胞具有被破坏的代谢。

本发明还提供基因工程改造过的植物细胞，其包含本发明的核酸序列。优选地，本发明的核酸和/或本发明的启动子序列与基因编码序列有效连接。

在本发明的再另一方面，提供含本发明重组DNA的植物细胞。优选地，本发明核酸和/或本发明启动子序列与基因编码序列有效连接。

本发明还提供调节植物中的基因表达的方法，该方法包括将与基因编码序列有效连接的本发明核酸和/或本发明启动子序列导入植物中，所述基因的表达受到调节。

本发明进一步提供修饰转基因植物细胞中的代谢的方法，该方法包括将本发明核酸和/或本发明启动子序列和/或本发明嵌合基因导入植物中。优选地，该方法包括将本发明核酸和/或本发明启动子序列和/或本发明嵌合基因导入细胞中。优选地，本发明核酸或本发明启动子序列与基因编码序列有效连接。有利地，所述基因参与代谢途径。优选地，代谢产物在细胞中增加或减少。

本发明再进一步提供改变植物细胞中的基因产物生产的方法，该方法包括导入与基因编码序列有效连接的本发明核酸和/或本发明启动子序列，改变所述基因的基因产物的生产。优选地，基因产物生产增加。优选地，所述基因产物为RNA分子，其可通过RNAi、反义或共抑制机制与基因表达过程相互作用，或者其可翻译为蛋白基因产物。优选地，所述蛋白基因产物为蛋白酶、限制性内切核酸酶、膜转运蛋白、核糖核酸酶或核糖体失活蛋白。优选地，所述核糖体失活蛋白为美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)。PAP可为PAP′或PAPII。更优选所述美洲商陆抗病毒蛋白为PAP-S或其变体或其功能部分。

本发明进一步提供核酸调节植物中的基因表达的用途，所述核酸含如SEQ ID No.1或SEQ ID No.7所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少60％同一性的序列。

本发明还提供核酸调节植物中的基因表达的用途，所述核酸含如SEQ ID No.1所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％同一性的序列。

本发明还提供核酸调节植物中的基因表达的用途，所述核酸含如SEQ ID No.7所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％同一性的序列。

本发明还提供核酸改变植物细胞中的代谢的用途，所述核酸含如SEQ ID No.1或SEQ ID No.7或SEQ ID No.4所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少60％同一性的序列。

本发明还提供核酸改变植物细胞中的代谢的用途，所述核酸含如SEQ ID No.1所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％同一性的序列。

本发明还提供核酸改变植物细胞中的代谢的用途，所述核酸含如SEQ ID No.7所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％同一性的序列。

本发明再进一步提供核酸改变植物细胞中基因产物生产的用途，所述核酸含如SEQ ID No.1或SEQ ID No.7或SEQ ID No.4所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少60％同一性的序列。

本发明还提供核酸改变植物细胞中基因产物生产的用途，所述核酸含如SEQ ID No.1所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％同一性的序列。

本发明还提供核酸改变植物细胞中基因产物生产的用途，所述核酸含如SEQ ID No.7所示启动子序列或其功能部分，或与其具有至少75％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少97％同一性的序列。

本发明还提供与本发明核酸序列选择性杂交的寡核苷酸探针。

本发明还可提供SEQ ID No.1的一部分，其中所述部分来自SEQID No.1的核苷酸1至核苷酸1321或其部分。所述核苷酸1至核苷酸1321的部分可为SEQ ID No.1的“功能部分”。

本发明还可提供SEQ ID No.7的一部分，其中所述部分来自SEQID No.7的核苷酸1至核苷酸1309或其部分。所述核苷酸1至核苷酸1309的部分可为SEQ ID No.7的“功能部分”。

所述“功能部分”我们指有效引导植物特定细胞中的表达的部分。

本发明的任意方面均可涉及仅一个或一个以上的本文提及序列。

本文使用的术语“嵌合基因”指在不同来源的核酸序列连接在一起时形成的任意杂合核酸分子。

在本发明中，“邻近细胞”是足够接近特定细胞以至于受特定细胞中的表达影响的细胞，即可将“邻近细胞”定义为可分化为侧芽组织的细胞(即在侧芽发端细胞已按照本发明改变的情况下)或支持侧芽和/或侧枝生长的细胞。

序列标识符

在序列表中：

SEQ ID No.1显示了本发明的分离启动子的DNA序列。

SEQ ID No.2显示了PCR寡核苷酸S2PCLOFWD。

SEQ ID No.3显示了PCR寡核苷酸S2PCLOREV。

SEQ ID No.4显示了本发明的另一个分离启动子(本文称为“ATC023启动子”)的DNA序列。

SEQ ID No.5显示了PCR寡核苷酸AT4G29190L。

SEQ ID No.6显示了PCR寡核苷酸AT4G29190R。

SEQ ID No.7显示了本发明的分离启动子(本文称为“ATC 085启动子”)的DNA序列。

附图简述

为了能够容易地实现本发明，作为示例，现在参考以下附图，其中：

图1显示了SEQ ID No.1和Sar8.2b启动子(Genbank检索号U648116)的比对。

图2显示了ATC 023启动子序列与基因座AT4g29190[染色体4：14396379-14392944，反向]附近的拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组的比对。AT4g29190基因的5′上游区以斜体显示，5′和3′非翻译区以小写字母显示。方框表示AT4g29190基因的起始密码子和终止密码子。用于克隆ATC 023启动子的引物位点标以下划线。核苷酸改变以双下划线显示。

图3显示了由ATC 085启动子驱动的GUS报告基因表达在烟草茎切片中的位置。(a)-(c)显示了在侧芽发端区通过茎的切片；(d)显示了通过同一侧芽发端区的3个连续切片；和(e)显示了通过叶腋的垂直切片。

图4a显示了与对照(NCC)植物相比由ATC 085启动子驱动的美洲商陆抗病毒蛋白表达对切除尖端后烟草侧芽17和18侧生长的作用。

图4b显示了与对照(NCC)植物相比由ATC 085启动子驱动的美洲商陆抗病毒蛋白表达对切除尖端后烟草侧芽16侧生长的作用。

图5显示了切除尖端时烟草中的侧枝侧生长以及用ATC 085-PAP转化的作用；(a)显示了未转化的对照植物，表现出延长的侧枝侧生长；(b)显示了ATC085-PAP转基因植物，未表现出可见的芽侧生长。

图6显示了由ATC 023启动子驱动的GUS报告基因表达在切除尖端后的烟草茎切片中的位置，(a)显示了在侧芽发端区通过一棵植株茎的切片；(b)和(c)显示了取自不同植株的通过两个侧芽发端区的连续切片；和(d)显示了通过叶腋的垂直切片。

图7显示了由ATC 023启动子驱动的GUS报告基因表达在拟南芥茎切片中的位置，(a)显示了在芽发育早期芽侧生长点的表达，(b)-(d)显示了在发育中的芽和邻近组织中的随后表达。

发明详述

适宜地，本发明的启动子序列包含与SEQ ID No.1或SEQ ID No.7所示序列或其功能部分中的任一个具有至少65％、优选至少70％、更优选至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少97％、更优选至少98％、最优选至少99％同一性的核苷酸序列。

本文使用的术语“启动子”以本领域的通常含义使用，例如RNA聚合酶结合位点。

本文使用的“改变代谢”指以改变细胞正常功能代谢的方式影响细胞的代谢功能，导致细胞的正常功能被增强或抑制。

本文使用的术语“破坏代谢”指以干扰细胞正常功能代谢的方式改变细胞的代谢功能，导致细胞死亡或细胞正常功能的抑制。

本文使用的术语“增强代谢”指以增进细胞生长或活力的方式改变细胞的代谢功能。

本文使用的“侧芽发端细胞”指与侧芽生长发端相关的细胞。

本文使用的“修饰形态学”指改变植物的正常生长习性，其显现为植株部分或整体的物理变化。例如，植物侧枝生长可增强。优选地，植物侧枝生长被抑制或阻止。任一种方式都可改变植物的整体物理结构和/或外观。

植物DNA序列可由天然宿主细胞回收，或者可直接体外合成。由天然宿主提取能够从头分离新序列，而体外DNA合成一般需要预先存在的序列信息。直接体外化学合成可通过顺序人工合成或通过自动化步骤实现。DNA序列还可通过标准退火和连接片段技术或通过本领域已知的其它方法构建。Sambrook等(1989)中给出了这种克隆方法的实例。

可通过直接克隆植物基因组DNA节段分离本发明的DNA序列。使用限制性内切核酸酶、超声、物理剪切或本领域已知的其它方法，通过片段化可获得合适的基因组DNA节段。通过使用克隆节段DNA序列的编码序列存在情况的预测性筛选(Baxevanis，2001)，可发现此诊断序列上游的已知启动子序列的基序特征。

或者，通过评价功能性，例如通过将克隆节段连接至来源于报告基因的编码序列，并将嵌合构建物导入到其中可评价报告基因的宿主细胞中或无细胞系统中，可实现作为启动子序列的克隆节段的鉴别。该方法可构成称为启动子捕获的另一种序列分离策略的一部分，其中将基因组DNA片段直接克隆入含报告基因编码区和在宿主细胞或无细胞系统中表达必需的其它序列的“表达载体”中。所述表达可需要或不需要将嵌合构建物整合入宿主染色体DNA中。

获得本发明DNA序列的替代方法是通过鉴别和分离已知表达的DNA编码序列，随后使用该序列获得邻近的启动子序列，根据定义所述启动子序列引导编码序列的表达。或者，可如下获得DNA序列：鉴别已知在不同生物中表达的序列，然后由选定生物分离同源编码序列和之后其连接的启动子序列。可通过由植物组织分离信使RNA(mRNA或polyA+RNA)或分离蛋白，并实施其序列的“反向翻译”获得编码序列。选择用于RNA分离的组织，选择基础是一般相信合适的基因编码序列在该组织中以对分离最佳的水平表达。

本领域技术人员熟知各种由植物组织分离mRNA的方法，包括例如使用固定在惰性基质上的寡聚脱氧胸苷寡核苷酸。通过使用酶逆转录酶(RT)或具有逆转录酶活性的其它酶，分离的mRNA可用于生产其互补DNA序列(cDNA)。通过克隆入细菌或病毒载体中，或通过使用具有选定寡核苷酸引物的聚合酶链反应(PCR)，可实现由cDNA群中分离单个cDNA序列。通过在称为RT-PCR的方法中组合逆转录和PCR步骤，可实现由mRNA生产和分离特定cDNA。

可使用各种方法提升通过富集或选择方法(包括mRNA(或产生的单链或双链cDNA)的分离和对比)由一种以上来源分离目标序列的效率，以便鉴别那些主要在选定组织中表达的序列。差异筛选、杂交或克隆的众多方法是本领域技术人员已知的，包括cDNA-AFLP、级联杂交和用于选择或差异克隆的市售试剂盒。

在本发明中，利用SAR 8.2j蛋白的cDNA序列(EMBL检索号U64812)分离新启动子序列。在EMBL检索号U64816、U64807、U64808、U64809、U64810、U64811、U64813、U64814、U6481中给出了其它SAR蛋白基因的实例。还利用锌指转录因子的第二个cDNA序列(EMBL检索号AL096692)分离启动子序列。

然后，选定的cDNA可通过在植物基因组DNA的DNA印迹中用作杂交探针，用于评价其源基因的基因组特征，以揭示基因组相对于该序列的复杂性。或者，可使用所述cDNA的序列信息设计寡核苷酸，这些寡核苷酸可以相同方式用作杂交探针；用作生产杂交探针的PCR引物或用作在直接基因组分析中使用的PCR引物。

类似地，选定cDNA可通过在由各种植物组织或由发育或时间序列提取的RNA的RNA印迹中用作杂交探针，用于评价其源基因的表达谱。此外，所述cDNA序列信息可用于设计寡核苷酸，所述寡核苷酸可用作杂交探针、用于生产杂交探针或直接用于RT-PCR。

然后，选定cDNA或设计的寡核苷酸可用作杂交探针，以攻击克隆基因组DNA片段的文库，并鉴别重叠的DNA序列。利用此方法可鉴别和分离邻接启动子。

根据分离方法的特性，分离的cDNA通常含编码区的3′末端，并向5′末端延伸。其可不含全长编码序列。如果所述cDNA用于鉴别邻接启动子，则优选确保存在5′末端序列。这可通过称为5′RACE(cDNA末端快速扩增)的方法在5′方向延长克隆的cDNA序列来实现。

如果克隆cDNA的序列分析鉴别出已在科学文献中报告的同源序列，则该信息可提供适宜的5′末端候选序列。但是，有可能存在具有相似编码区但内含子区、启动子序列和表达谱不同的相同基因家族的不同成员，这可导致选择不正确和不适宜的启动子序列。

一旦已鉴别出编码序列的5′末端，就可鉴别含启动子的邻接上游区，条件是其存在于公共核苷酸数据库中。或者，可通过在5′方向进一步延伸分离启动子。这可通过包括载体连接PCR、基因组步查、小载体PCR和其它方法在内的方法实现。如果有必要，可用与第一个启动子片段的5′末端互补的新引物重复该过程，以确保分离出启动子的所有控制序列。

本发明还提供如SEQ.ID.No：4所示DNA序列的用途，所述序列编码启动子(本文称为“ATC 023”)，所述序列能够控制锌指转录因子蛋白的表达，可用作植物启动子。在TAIR核苷酸序列数据库中鉴别该序列位于基因座AT4g29190。本发明还包括控制其它锌指转录因子蛋白基因表达的DNA序列，其具有与SEQ.ID.No：4的DNA序列同源的某些区域。

可以两个DNA(或多肽)序列之间的同一性百分率为基础测定同源性。一般来说，比对要比较的两个序列，以获得序列之间的最大相关性。检查两个序列的比对，确定两个序列之间表现出精确核苷酸(或氨基酸)对应的位置数，除以比对总长度，乘以100，得到同一性百分率数字。此同一性百分率数字可在要比较序列的全长内测定，这特别适合于长度相同或非常相似并高度同源的序列，或者可在较短的限定长度内测定，这更适合于长度不等或具有较低同源性水平的序列。

比较两个或更多个序列同一性的方法在本领域众所周知。因此，例如，可使用可在Wisconsin序列分析包9.1版(Devereux J.等，1984)(可得自Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin，USA)中获得的程序如程序BESTFIT和GAP，测定两个多核苷酸之间的同一性百分率和两个多肽序列之间的同一性百分率。BESTFIT使用Smith和Waterman(1981)的“局部同源性”算法，寻找两个序列之间相似性最好的单个区域。BESTFIT更适合于比较长度不同的两个多核苷酸或两个多肽序列，该程序假定较短的序列代表较长序列的一部分。相比之下，GAP按照Needleman和Wunsch(1970)的算法比对两个序列，寻找“最大相似性”。GAP更适合于比较大约相同长度的序列，比对要求在完整长度内进行。优选地，在各个程序中使用的参数“空位插入罚分(GapWeight)”和“空位延伸罚分(Length Weight)”分别为50和3(对于多核苷酸序列)以及12和4(对于多肽序列)。优选地，当要比较的两个序列最优比对时测定同一性和相似性百分率。

测定序列间同一性和/或相似性的其它程序也是本领域已知的，例如BLAST家族程序(Karlin和Altschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268，按照Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877修改，可得自美国国家生物技术信息中心(NCBI)，Bethesda，Maryland，USA，通过NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov获取)。这些程序示例了用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性实例。该算法并入到Altschul等，1997，J.Mol.Biol.215：403-410的NBLAST和XBLAST程序中。可用NBLAST程序进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白检索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可如Altschul等，1997，NucleicAcids Res.25：3389-3402所述使用Gapped BLAST。或者，可使用PSI-Blast进行检测分子间远缘关系的迭代检索(出处同上)。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的另一种数学算法的优选非限制性实例是Myers和Miller，1988，CABIOS 4：11-17的算法。该算法并入到ALIGN程序(2.0版)中，ALIGN程序是GCG序列比对软件包的组成部分。

本领域已知用于测定序列间同一性和/或相似性的程序的另一个非限制性实例是FASTA(Pearson W.R.和Lipman DJ.，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，85：2444-2448，1988，可作为Wisconsin序列分析软件包的组成部分获得)。优选地，在多肽序列比较中使用BLOSUM62氨基酸置换矩阵(Henikoff S.和Henikoff J.G.，Proc.Nat.Acad.Sci.，USA，89：10915-10919，1992)，包括在比对前将核苷酸序列先翻译成氨基酸序列的情况。

可使用类似于上文所述的技术，在允许或不允许空位的情况下，测定两个序列间的同一性百分率。在计算同一性百分率时，通常计算精确匹配。

优选使用程序BESTFIT测定查询多核苷酸或多肽序列相对于本发明多核苷酸或多肽序列的同一性百分率，查询序列和参比序列最优比对，程序参数设为默认值。

在本发明背景下，显著同源序列是具有至少50％序列同一性的序列，优选具有至少60％、65％或70％的序列同一性的序列，更优选具有至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％或94％的序列同一性的序列，最优选具有至少95％、96％、97％、98％或99％或以上的序列同一性的序列。

本文使用的术语“同源物”指与对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有一定同源性的实体。在本文中，术语“同源”可与“同一性”等同。

尽管也可依据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)考察同源性，但在本发明背景下，优选以序列同一性表示同源性。

在本发明背景下，术语利用尤其包括使用、导入和表达序列或基因。

本发明还包括与以上启动子的DNA序列(包括部分序列和互补序列)杂交的DNA序列。可以常规方式确定所述序列如此杂交的条件。

杂交可在低、中或高严格条件下进行。可在其下进行杂交和/或漂洗的条件可在42℃-68℃的范围内，漂洗缓冲液可由0.1×SSC、0.5％SDS至6×SSC、0.5％SDS组成。通常，杂交可于65℃(高严格条件)、60℃(中严格条件)或55℃(低严格条件)过夜进行。滤膜可用0.1×SSC、0.5％SDS于65℃漂洗2×15分钟(高严格漂洗)。滤膜可用0.1×SSC、0.5％SDS于63℃漂洗2×15分钟(中严格漂洗)。对于低严格漂洗，滤膜以2×SSC、0.5％SDS于60℃漂洗2×15分钟。

本发明还包括与寡核苷酸探针杂交的DNA序列。优选所述DNA序列在严格条件下与寡核苷酸探针杂交。在其中核酸分子为寡核苷酸(“oligos”)的情况下，高严格条件例如可指以6×SSC/0.05％焦磷酸钠于37℃(对于14个碱基的寡核苷酸)、48℃(对于17个碱基的寡核苷酸)、55℃(对于20个碱基的寡核苷酸)和60℃(对于23个碱基的寡核苷酸)漂洗。在针对EMBL核苷酸序列数据库(Release 77)(Kulikova等，2004)的BLAST检索中，ATC 085启动子在其最后220个碱基内与其它SAR基因如8.2h和8.2k翻译起始密码子上游的已知序列具有90％以上的同一性。唯一在启动子长度上显示出任意其它同源区的序列是Sar 8.2b启动子区(SAR 8.2b启动子，Genbank检索号U64816，碱基1至碱基1907)。

图1显示了SEQ ID No.1(碱基1-1566)和具有同源性的SAR 8.2b启动子区(Genbank序列的碱基704-1907)之间的比对。比对序列之间的同一性以圆点显示。由图1可见，SEQ ID No.1与对应的SAR 8.2b启动子整体具有61％的同一性。

图2显示了ATC 023启动子(碱基1-1904)和基因座AT4g29190(反向)附近的拟南芥(Arabidopsis thaliana)序列区之间的比对。由图2可见，克隆的ATC 023启动子与报告的基因组序列具有99％以上的同一性。

在所述启动子控制下使用并用于实施本发明的基因编码序列可在部分或全部植物组织中有活性。所使用的序列可编码蛋白或RNA部分。通过重组DNA技术，所述序列可编码蛋白或RNA的合成变体、部分序列或含一个或多个基因区域的复合序列。例如，嵌合基因可编码多蛋白。所述序列还可包含重复的、截短的、反向的或互补的序列，以通过例如反义、共抑制或RNA抑制技术实现对一个或多个内源基因的转录和翻译的破坏。

许多植物、细菌和病毒基因可在启动子控制下活性表达。优选地，所述基因编码：

(i)可用作报告基因用于启动子功能的GUS、GFP和萤光素酶。

(ii)产生植物结构组分如纤维素、半纤维素、胶质和木质素的酶基因。

(iii)设计用于改变植物和植物细胞中的代谢的DNA序列。这种基因包括用于糖代谢、淀粉代谢、氨基酸和蛋白代谢、核酸代谢和脂质代谢的基因。

(iv)可对控制代谢或发育如开花或株型具有作用的调节DNA序列，包括参与植物生长物质的代谢或转运的基因。

(v)编码产物的DNA序列，所述产物例如为限制酶、蛋白酶、蛋白酶抑制剂和可用于有意削弱细胞功能的核糖体失活蛋白。

(vi)对环境应力或病原体或害虫的抗性。

本发明启动子优选有效引导在侧生和/或辅助分生组织中的表达。

本发明启动子除了可有效引导在侧芽和/或侧枝中的表达以外，还可有效引导在植物的其它组织和/或细胞中的表达。例如，在植物的创伤组织和/或茎和/或叶中可观察到一些表达。但是，所述启动子有效引导在侧芽和/或侧枝中显著特异性(如本文所定义)的表达。

本领域技术人员可使用各种方法测定本发明启动子的表达谱，所述方法优选为：

(i)瞬时表达，其中所述启动子连接至合适构建物中的报告基因如GUS、GFP或萤光素酶，并通过鸟枪法转化导入到植物组织中。根据不同植物组织中报告基因产物的存在与否检测启动子表达。

(ii)瞬时表达，其中所述启动子连接至合适二元构建物中的报告基因如GUS、GFP或萤光素酶，并通过农杆菌(Agrobacterium)导入植物组织中。根据不同植物组织中报告基因产物的存在与否检测启动子表达。可通过使用合适的底物作为染料或通过使用比色计或分光光度计视觉检测GUS活性；萤光素酶和荧光标记蛋白可目测，或在胶片或数字媒介上照相检测，或使用照度计或荧光计定量检测。还可使用抗体型系统检测标记基因。

(iii)植物转化和再生。根据不同植物组织中报告基因的存在与否检测启动子表达。

(iv)植物转化和再生。根据不同植物组织中效应基因产生的特定基因产物的存在与否检测启动子表达。

本发明的基因产物可通过重组技术产生，其中用于DNA编码序列的基因组DNA克隆或cDNA克隆被产生、分离、增殖和掺入到本发明的植物转化载体中。

本申请首次提供了能够显著特异性地在侧芽和/或侧枝中表达基因的启动子。

适宜地，本发明启动子为“诱导的启动子”，即在刺激物作用下启动的启动子。因此，同在植物特定细胞中有效引导表达的启动子一样，所述启动子也可被看成诱导型启动子。

优选地，本发明启动子通过切除植物尖端诱导，即通过去除植物顶芽或顶枝诱导。

非为理论所限，其中本发明启动子可被“开启”的一种可能方式是由可通过去除顶芽刺激的信号活化或诱导，因此在切除尖端后。例如，所述信号可为植物生长激素。仅作为实例，所述信号可为细胞分裂素。

或者，仍非为理论所限，有可能是顶芽释放阻止侧生分生组织侧生长和/或本发明启动子开启的抑制信号。在此情况下，例如，去除顶芽(例如通过切除尖端)可导致抑制信号丢失，因此开启了本发明启动子。例如，仅作为实例，所述抑制信号可为植物生长素。

分离的

在一个方面，优选所述序列为分离形式。术语“分离的”指所述序列至少基本上没有至少一种与所述序列天然结合或天然存在的其它组分。

纯化的

在一个方面，优选所述序列为纯化形式。术语“纯化的”指所述序列为相对纯的状态-例如至少约90％纯，或至少约95％纯，或至少约98％纯。

核苷酸序列

本文使用的术语“核苷酸序列”与“核酸序列”同义，指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。所述核苷酸序列可为基因组来源或合成来源或重组来源，可为双链或单链，无论是指有义链还是反义链。

本发明所涉及的术语“核苷酸序列”或“核酸”包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。优选其指DNA，更优选指针对本发明编码的cDNA序列。

由于遗传密码简并性，可容易地生产核苷酸序列，其中对于由原核苷酸序列编码的部分或全部氨基酸，三联体密码子选择已改变，由此产生与原核苷酸序列具有低同源性的核苷酸序列，但其编码与原核苷酸序列编码序列相同或变异的氨基酸序列。例如，对于大部分氨基酸来说，遗传密码简并性位于三联体密码子中的第三个位置(摇摆位置)(参考文献参见Stryer，Lubert，Biochemistry，第3版，Freeman Press，ISBN 0-7167-1920-7)，因此，其中所有三联体密码子在第三个位置都已“摇摆”的核苷酸序列应与原核苷酸序列约66％相同，但是，改变过的核苷酸序列应编码与原核苷酸序列编码序列相同或变异的一级氨基酸序列。

因此，本发明进一步涉及对至少一个氨基酸编码三联体密码子具有替代三联体密码子选择、但编码与原核苷酸序列编码的多肽序列相同或变异的多肽序列的任意核苷酸序列。

而且，就用于编码氨基酸的三联体密码子而言，具体生物通常具有偏倚。优选密码子选择表可广泛获取，可用于制备密码子优化基因。这种密码子优化技术通常用于优化异种宿主中的转基因表达。

通常，使用重组DNA技术制备编码多肽的核苷酸序列(即重组DNA)，所述多肽具有如本文定义的特定特性。但是，在本发明的替代实施方案中，所述核苷酸序列可使用本领域众所周知的化学方法完整或部分地合成(参见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 225-232)。

分子进化

一旦分离出编码启动子的核苷酸序列或鉴别出编码推定启动子的核苷酸序列，就可能期望对选定核苷酸序列进行修饰，例如可能期望突变所述序列，以便制备本发明的基因产物。

突变可使用合成寡核苷酸导入。这些寡核苷酸包含位于目标突变位点侧翼的核苷酸序列。

合适的方法公开于Morinaga等(Biotechnology(1984)2，646-649页)。将突变导入核苷酸序列中的另一种方法述于Nelson和Long(Analytical Biochemistry(1989)，180，147-151页)。

人们例如可使用市售试剂盒如Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒，随机导入突变，而不是如上所述的定点诱变。EP 0 583 265提到了优化PCR型诱变的方法，该方法还可与例如描述于EP 0 866 796的诱变DNA类似物的应用组合。

获得新序列的第三种方法是通过使用一些限制酶或例如脱氧核糖核酸酶I的酶片段化不相同的核苷酸序列，并再组装成编码功能蛋白的完整核苷酸序列。或者，人们可使用一个或多个不相同核苷酸序列，并在组装完整核苷酸序列的过程中导入突变。实施‘改组(shuffling)’的适宜方法可见于EP 0 752 008、EP 1 138 763、EP 1 103606。改组还可与如US 6,180,406和WO 01/34835所述的其它形式的DNA诱变组合。

因此，有可能体内或体外在核苷酸序列中产生众多定点或随机突变，随后通过各种方法筛选编码多肽的改进功能性。例如，使用计算机模拟和外部介导的重组方法(参见WO 00/58517、US 6,344,328、US6,361,974)可进行分子进化，其中产生的变体保留了与已知蛋白的极低同源性。由此获得的这种变体可与已知蛋白具有显著的结构类似性，但具有非常低的氨基酸序列同源性。

另外，作为非限制性实例，多核苷酸序列的突变或天然变体可与野生型或其它突变或天然变体重组，以产生新变体。还可筛选这种新变体的编码多肽的改进功能性。

植物转化载体

本发明的植物转化载体含“表达盒”，其在5′-3′转录方向上包含如本发明所述的启动子序列、如上文所论述的基因编码序列、任选的3′非翻译序列、含RNA聚合酶终止信号的终止子序列以及聚腺苷酸化酶(polyadenylase)的聚腺苷酸化信号。

启动子序列可以一个或多个拷贝存在，所述拷贝可与如上文所述的启动子序列相同或为其变体。所述拷贝还可为完整或部分的上文所述序列。

终止子序列可得自植物、细菌或病毒基因。合适的终止子序列例如为豌豆rbcS E9终止子序列、得自根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合酶基因的nos终止子序列以及花椰菜花叶病毒的35S终止子序列。本领域技术人员容易了解其它合适的终止子序列。

所述表达盒还可包含基因表达增强机制，以增加启动子强度。这种增强子元件的实例是源自豌豆质体蓝素基因的部分启动子的增强子元件，其是国际专利申请号WO 97/20056的主题。

这些调节区可来源于与本发明的启动子DNA序列相同的基因，或者可来源于不同基因、来源于普通烟草(Nicotiana tabacum)或其它生物，例如来源于茄科家族植物，或来源于夜香树亚科(Cestroideae)亚家族植物。所有的调节区都应在待转化的组织细胞中能够起作用。

基因编码序列可来源于与本发明的启动子DNA序列相同的基因，或者可来源于不同基因、来源于普通烟草(Nicotiana tabacum)或另一种生物，例如来源于茄科家族植物，或来源于夜香树亚科(Cestroideae)亚家族植物。

表达盒可掺入到基础植物转化载体如pBIN 19 Plus、pBI 101中，或掺入到本领域已知的其它合适的植物转化载体中。除了表达盒以外，所述植物转化载体还含例如转化过程必需的序列。这些序列可包括农杆菌(Agrobacterium)vir基因、一个或多个T-DNA边界序列和鉴别转基因植物细胞的选择标记或其它工具。

术语“植物转化载体”指能够体内或体外表达的构建物。

优选地，将表达载体掺入到生物基因组中。术语“掺入”优选涵盖稳定掺入到基因组中。

本发明载体可如下所述转化入合适的宿主细胞中，以提供具有本文定义特定特性的多肽的表达。

载体(例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体载体)的选择经常依赖于载体要导入其中的宿主细胞。

载体可包含一个或多个选择标记基因一例如赋予抗生素抗性如氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性或四环素抗性的基因。或者，所述选择可通过共转化完成(如WO91/17243所述)。

载体可体外使用，例如用于生产RNA或用于转染或转化宿主细胞。

术语“有效连接的”指一种并列，其中所述组分所处的关系允许它们以其目标方式起作用。“有效连接”至编码序列的调节序列以在与对照序列相配的条件下实现编码序列表达的方式连接。

宿主细胞

本发明涉及的术语“宿主细胞”包括含本发明的核酸、启动子序列或嵌合基因或含上述表达载体的任意细胞。

因此，本发明的另一个实施方案提供用本发明的核酸、启动子序列或嵌合基因转化或转染的宿主细胞。选择与所述载体相容的细胞，其例如可为原核细胞(例如细菌)、真核细胞、酵母细胞或植物细胞。优选所述宿主细胞不是人细胞。

合适的细菌宿主生物的实例为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。

在一个实施方案中，可优选真核细胞，例如酵母或其它真菌。一般而言，酵母细胞优于真菌细胞，因为其更易于操作。

使用合适的宿主细胞，例如酵母、真菌和植物宿主细胞，可提供翻译后修饰(例如十四烷基化、糖基化、截短、脂化(lapidation)以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，可能需要这些修饰赋予本发明重组表达产物优化的生物活性。

所述宿主细胞可为蛋白酶缺陷株或蛋白酶负变株。

本发明涉及的术语“转基因植物”包括含本发明的核酸、启动子序列或嵌合基因的任意植物。优选将所述核酸、启动子序列或嵌合基因掺入到植物基因组中。

术语“转基因植物”不包括在其天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时所述天然核苷酸编码序列处于其天然启动子控制之下，所述天然启动子也在其天然环境中。

本发明还包括与本文所述序列或其任意衍生物、片段或变体互补的核苷酸序列的用途。如果所述序列与其片段互补，则该序列可用作探针，以鉴别在其它生物等中的相似编码序列。

本文使用的术语“变体”指由非内源遗传密码表达的蛋白，其与天然或野生型序列相比，在成熟蛋白序列中产生一个或多个氨基酸变化(即氨基酸缺失、添加或置换)。

植物转化

转化植物的技术在本领域众所周知，包括例如农杆菌(Agrobacterium)介导的转化。构建遗传修饰植物的基本原则是在植物基因组中插入遗传信息，以便获得所插入遗传物质的稳定维持。一般技术的综述可见于论文Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 3月/4月1994 17-27)。

通常，在农杆菌(Agrobacterium)介导的转化中，通过将农杆菌(Agrobacterium)与靶植物外植体共同培养，将携带目标外源DNA的二元载体即嵌合基因由合适的农杆菌(Agrobacterium)菌株转移至靶植物。然后转化的植物组织在选择培养基上再生，所述选择培养基含选择标记和植物生长激素。替代方法是花序浸泡法(Clough和Bent，1998)，借助该方法，使完整植株的花芽与含嵌合基因的农杆菌(Agrobacterium)菌株悬浮液接触，在结实后，使转化个体种子发芽，通过在选择培养基上生长鉴别。

农杆菌(Agrobacterium)直接感染植物组织是一种业已广泛使用的简单技术，描述于Butcher D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods forPlant Pathologists，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。

其它合适的转化方法包括使用聚乙二醇或电穿孔技术、粒子轰击、微注射和使用例如碳化硅纤维，将基因直接转移入原生质体中。

使用基因枪转化法(包括碳化硅晶须技术)转化植物教导于FrameBR，Drayton PR，Bagnaall SV，Lewnau CJ，Bullock WP，Wilson HM，Dunwell JM，Thompson JA和Wang K(1994)。通过碳化硅晶须介导的转化生产多产转基因玉米作物教导于The Plant Journal 6：941-948，病毒转化技术教导于例如Meyer P，Heidmann I & Niedenhof I(1992)。使用木薯花叶病毒作为植物载体系统教导于Gene 110：213-217。

关于植物转化的其它技术可见于EP-A-0449375。

在又一方面，本发明涉及携带本发明的核苷酸序列或构建物的载体系统，其能够将所述核苷酸序列或构建物导入到生物如植物的基因组中。所述载体系统可包含一个载体，但其可包含两个载体。在两个载体的情况下，载体系统一般称为二元载体系统。二元载体系统更详细地描述于Gynheung An等，(1980)，Binary Vectors，Plant MolecularBiology Manual A3，1-19。

一种广泛使用的植物细胞转化系统使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒或发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)的Ri质粒，An等，(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，编辑：D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。植物中在本发明的目标启动子或构建物或核苷酸序列的各种导入方法之后，可能必须存在和/或插入其它DNA序列。例如，如果将Ti-或Ri-质粒用于植物细胞转化，则可连接至少Ti-和Ri质粒T-DNA的右边界，但经常可连接右边界和左边界，作为导入基因的侧翼区域。使用T-DNA转化植物细胞已被深入研究，描述于EP-A-120516；Hoekema，载于：The Binary Plant VectorSystem Offset-drukkerij Ranters B.B.，Alblasserdam，1985，章节V；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci，4：1-46；和An等，EMBO J.(1985)4：277-284。

可按照众所周知的组织培养方法，例如通过在补加必需生长因子(如氨基酸、植物激素、维生素等)的合适培养基中培养植物细胞，生长和保持所述细胞。

培养和生产

用本发明的核酸、启动子序列或嵌合基因转化的宿主细胞可在有益于所述宿主生长的条件下培养。

用于培养细胞的培养基可为适于培养所述宿主细胞的任何常规培养基。

基因产物的生产

DNA编码序列或核酸序列在植物宿主细胞中表达将产生RNA转录物。此转录物可为RNA分子，其随后不翻译成蛋白产物，但其可通过RNAi、反义或共抑制机制与基因表达过程相互作用。如果所述编码序列来源于结构基因，则所述RNA转录物随后可被翻译为蛋白基因产物。如果有需要，可通过由生物系统分离蛋白的标准技术，例如盐沉淀、柱层析、免疫亲和技术、电泳、重结晶、离心等，分离基因产物。

对植物细胞有害的基因产物的表达

如果DNA编码序列或核酸序列翻译成对植物宿主细胞具有有害作用的蛋白基因产物，则其可通过使用引导在特定植物细胞中表达的本发明启动子用于植物细胞死亡系统。具有有害作用的合适蛋白可包括蛋白酶、限制性内切核酸酶、膜转运蛋白和核糖核酸酶如Barnase。其它实例包括核糖体失活蛋白(RIP)，例如玉米REP b-32蛋白、蓖麻蛋白、相思豆毒蛋白、莫迪素(modeccin)、大麦翻译抑制剂和美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)。美洲商陆(Phytolacca americana)产生3种不同的抗病毒蛋白，即PAP′、PAPII和PAP-S。国际专利申请号WO02/33107说明了PAP-S蛋白截短变体在细胞死亡系统中的用途。因此，使用核糖体失活蛋白(RIP)如美洲商陆抗病毒蛋白(PAP)或其变体可提供植物细胞死亡系统。

仅作为实例，现在参照以下实施例描述本发明。

实施例1

ATC 085启动子(SEQ ID NO.7)区的分离和转化构建物的产生。

使用DNAeasy植物小型制备试剂盒(Qiagen)按照生产商的说明由K326烟草叶材料分离烟草叶组织的基因组DNA。将1μL等份的基因组DNA的1∶10稀释制备物用于起始PCR，起始PCR在25μL反应中使用1μL PCR引物S2PCLOFWD(SEQ ID No.2)10pM/μL和1μLPCR引物S2PCLOREV(SEQ ID No.3)10pM/μL，所述反应液含0.5μL延长酶Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)、1μL延长酶缓冲液A、4μL延长酶缓冲液B、各1μL的5mM dNTP、15.5μL重蒸水。PCR反应条件为：首循环94℃2分钟，接着为94℃30秒、60℃30秒和68℃4分钟，35个循环，之后为终循环68℃10分钟。PCR反应物在含痕量溴化乙锭的1.2％琼脂糖TBE凝胶上以4V/cm电泳2小时。发现两个PCR产物。由凝胶上切下约1600bp的较大产物，使用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照生产商的说明纯化DNA。

将纯化的PCR产物克隆入TOPO载体(Invitrogen)中，并按照生产商的说明转化入TOP10化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)中。将等份的反应物平板接种在含卡那霉素的无菌LB琼脂上，将平板于37℃过夜温育。使用以上条件通过PCR筛选菌落，以鉴别含启动子的克隆。通过测序进一步证实序列。

由TOPO载体上切下为HindIII-BamHI片段的ATC085启动子，并克隆入植物转化载体pBin 19 Plus载体(其基于源自pBIN19(Bevan等，1984)的pGPTV-Kan(Becker等，1992))中3个不同报告基因的前面，产生构建物GUS(ATC载体pBNP085-0040-001)、GFP(ATC载体PBNPO85-0003-001)和萤光素酶(ATC载体pBNP085-0017-001)。还将启动子克隆在效应基因-美洲商陆(Phytolacca americana)的活性形式美洲商陆抗病毒蛋白S的前面(ATC载体pBNP085-0501-001)。pBNP085-0501-001已按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约于2005年9月20日由Advanced Technologies(Cambridge)Ltd，210 Cambridge Science Park，Cambridge CB4 0WA保藏于国立工业、海洋和食品微生物保藏中心(NCIMB)23 St.Machar Street，AberdeenScotland，GB，保藏号NCIMB 41343。

实施例2

ATC 023启动子区的分离和转化构建物的产生。

使用PfuTurbo DNA聚合酶(Stratagene)以及分别含HindIII和BamHI限制位点的引物AT4G29190L(SEQ.ID.No.5)和AT4g29190R(SEQ.ID.No.6)，于63℃的退火温度，通过PCR由拟南芥(Arabidopsisthaliana)(Columbia生态型)基因组DNA分离ATC023启动子。然后使用限制位点将分离的片段克隆入植物转化载体pBI101中GUS报告基因的前面，获得构建物pBI101 023-0101-001。然后将所述构建物转化入大肠杆菌DH5α中。

实施例3

转化烟草植物的生产。

将以上产生的构建物转移入根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404中，使用Horsch等(1985)的共同培养法通过体外转化叶圆片获得转基因烟草变种K326植株。在含100μg/ml卡那霉素的MS琼脂培养基上选择转化的愈伤组织和再生枝条，并在凯福隆(Claforan)存在下培养，以去除农杆菌(Agrobacterium)细胞。然后将植株在没有凯福隆(Claforan)的培养基上体外保持和繁殖，以证实没有农杆菌(Agrobacterium)。

将植株转移至温室土壤进行表征。植株显示出的生长特征与温室中的野生型烟草植株无法区分。进行PCR分析，以鉴别转基因植物。

为生产后代，可自交植物，由成熟种球收集种子并储存于6℃。可使用自交转基因植物后代的分离比基于3∶1比率选择含单个插入位点的种子批。还可通过DNA杂交测定插入数。可通过基因组步查表征烟草基因组中的插入。

实施例4

转基因拟南芥植株的生产。

将上述构建物转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404和GV3103中，并通过Clough和Bent(1998)的花序浸泡法用其转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)。在由浸泡的植株收集种子后，使用对ATS/Phytagel^TM上的40μg/ml卡那霉素或MS/琼脂培养基上的50μg/ml卡那霉素进行的选择筛选T1转化体。以此方式分离独立的转化体，并将其转移至土壤，在长日照条件下培育。

使植物自花传粉，以产生T2种子。再对卡那霉素筛选来自独立品系的约60个T2种子，使用卡方测验测定所观测的分离比是否与转基因插入的单个位点一致(3抗性∶1敏感)。鉴别出比率与单个插入位点一致的多个独立品系，剩余的品系废弃。

实施例5

烟草植物中ATC 085启动子-GUS表达的特征

使用载体pBNP085-0040-001转化的60株植株进行GUS分析。在于温室生长约6-8周(此时顶芽已达到“花扣(floral button)”期)后，使用手术刀在第18叶(由底部计起)之上的节间对植物切除尖端，或通过切除叶16、17和18叶片的一半使植物受伤，或保持未处理。24小时后，取出不同组织样品，包括在侧芽14、15、16、17和18根部的茎切片、节间茎切片、顶端花枝条(在存在的情况下)、叶的叶片和叶柄以及初生根和次生根。收集的所有组织都立即浸泡在含0.1％β-巯基乙醇的0.1M磷酸钾缓冲液pH 7.0中，以防止棕化。

如下制备染色溶液：将300mg X-gluc粉溶解在玻璃容器中的3mlDMSO中，用含0.5mM铁氰化钾、0.5mM亚铁氰化钾、10mM EDTA、0.1％Triton-X和0.067％Sarcosyl的0.1M磷酸钾缓冲液补偿至1L。将该溶液储存于4℃黑暗处。

为染色组织样品，用新鲜染色溶液替换磷酸钾/β-巯基乙醇缓冲液，确保组织被完全浸没，样品在黑暗处于37℃过夜温育。然后用70％乙醇替换染色溶液，将组织储存于室温黑暗处，直至其透明为止。对于叶材料有时必须更换乙醇至少一次。一旦组织已透明，就用酸化甘油替换乙醇。在显微镜下观察样品并照相。

在全部3种处理(切除尖端、受伤或未处理)后检测植物中的GUS表达，在每种情况下，GUS表达都在侧芽根部和/或接近侧芽发端点的茎中局部化(图3)。大部分植株在取样的每个芽位置都具有表达。检测侧芽处的表达，与预处理(切除尖端、受伤或未处理)无关。在大部分植株中，在任何其它组织中未检测到表达-仅在一些特殊植株中观察到一些其它位点的表达，主要在受伤叶的割伤边缘。因此表明ATC085启动子为引导在侧芽发端点或其附近显著特异性表达的启动子。

实施例6

植物中ATC 085启动子-GFP表达的特征

使用载体pBNP085-0003-001转化的植株进行GFP表达分析。用蓝光照射全株或植株部分、植物切片或植物组织，通过目测或通过显微镜检查绿色荧光蛋白。

实施例7

植物中ATC 085启动子-萤光素酶表达的特征

使用载体pBNP085-0017-001转化的植物进行萤光素酶表达分析。用1mM萤光素(Sigma)润湿或喷雾全株、植株部分或植物切片或植物组织，并在黑暗处温育15分钟。然后可通过在X-射线胶片上放射自显影或通过使用具有长曝光时间的数码相机照相或通过使用光子捕获装置如连接照相系统的图象增强器显现萤光素酶表达。

实施例8

植物中ATC 085启动子-PAP表达的特征

将21株转基因植株和5株对照未转化(非共同培养或NCC)植株在温室中培育，在6-8周后，使用手术刀在第18叶以上的节间切除植株尖端，以如上所述去除顶端花序和顶叶。每天监测第16、17和18叶腋的侧枝侧生长，监测29天，按照以下大小分类系统记录：

0＝与主茎邻接的侧芽

1＝在延长的侧茎(即1节间)上的侧芽

2＝2节间具有侧枝

3＝3节间具有侧枝

等等。

由这些数据计算转基因植株和未转化植株每天3个侧芽位置的平均侧生长。这些数据在图4中作图。显然，ATC085启动子引导的美洲商陆抗病毒蛋白局部表达使侧枝侧生长的发生在切除尖端刺激下显著延迟，到第29天时与对照植株相比侧生长的量减少。该作用在两个顶芽17和18特别显著(参见图4a)。侧芽16在切除尖端时显示出低于芽17和18的侧生长(图4b)，但其被ATC 085-PAP构建物的表达进一步降低。

图5表明，ATC 085-PAP转基因植株中侧枝的侧生长比对照植株下降。

实施例9

拟南芥植物中ATC 085启动子-GUS表达的特征

使用构建物pBNP085-0040-001转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株。使用40株T1植株进行GUS分析。在长日照条件下于土壤中培育植株3-4周，直至花转移后，此时初生轴已‘抽苔’至20-40mm长度。然后通过在距莲座上部约10mm的点去除主茎斩断植株。接着使其继续培育24小时，之后由土壤中取出，用蒸馏水彻底清洗，检测GUS活性。如上文对烟草植株的描述进行GUS染色，只是使用全株。

通过在植物底部侧芽形成位置和茎附近高强度染色，检测植物中的GUS表达。但是，还在若干植株的其它组织中观察到表达，包括叶组织和叶脉、叶柄、茎和初生根。

实施例10

烟草植物中ATC 023启动子-GUS表达的特征

将用构建物pBH101 023-0101-001转化的42株烟草植株在温室中培育，如上文对GUS分析的描述进行处理。

在85％植株的侧芽中检测到GUS表达，与处理(切除尖端、受伤或未处理)无关，大部分植株在取样的每个芽位置都有表达。在许多情况下，还在接近侧芽发端点的茎中观察到局部表达。还在某些植株的其它组织中检测到表达，主要是在花组织中，但偶尔在根、茎、叶或叶柄中。

在17％植株中观测到侧芽和茎附近的特异性局部表达(图6)。因此，ATC023启动子可单独使用，以提供组织特异性表达。其还可与另一个侧芽表达启动子如ATC 085组合使用，以在侧芽组织提供具有重复活性位点的互补表达谱。

实施例11

拟南芥植物中ATC 023启动子-GUS表达的特征

如上所述将携带单个023-0101-001表达盒插入片段的5个独立转基因T2系在土壤中培育、斩断、染色，用于GUS分析。

在腋芽和邻接茎以及花组织中观测到GUS表达(图7)。与较小芽相关的表达最强，并随着芽的生长而稳步下降。这表明ATC 023启动子与侧芽发端相关。还在某些植株的其它组织中检测到一些表达，包括花组织。

以上说明书中提及的所有出版物都在此引入作为参考。本发明所述方法和系统的各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的，不偏离本发明的范围。尽管已联系特定的优选实施方案描述了本发明，但应当理解的是，要求保护的本发明不应被过度不当地限于这些特定的实施方案。实际上，所述本发明实施方式各种修饰对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员是显而易见的，属于以下权利要求的范围。

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<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>普通烟草启动子

<400>1

gctatcaagc tttattaaag tgtccaataa gtgcaagcct attagttgaa atgtcaaaag     60

ttggtatcaa atttagggag ttatttatgc tcccgtttgg ccagatttcg gttactattt    120

tttaagttta atttgttttt tcaagtttca agatttatga cagtttttga gtgatatttt    180

tccatttact cacaaaactt taactttttt ttttcaaata aaatacatgt acaaatacaa    240

ttttaatttt caaatattat tttccaacat aacttcaaaa actctttttt caagtgttaa    300

ttaaatatat gtttaactat gtattcattt gtgcttatgt tttatcatgc attttcataa    360

gtgaatttca tactcatctt catgcaaaca cttatactat aaaagatata ttattcctat    420

atacaacatg tttatacgag atcattacat tgtaagtgta ccttattatt ggtaaatttt    480

ggacttcacc aaaaataatt aaggaagtaa tgatatgcaa taaataaata aataaataaa    540

gttaaaaata ttatacttga ctcaagacac attatgggga acacgwttct ttcacgatcc    600

atcttatcct ttcatcgata gaagttagca atagcattat tctcatatta gcggaattat    660

ggttgtttgt ctctttatat ggtcatagac tctcgagata attcatattt caagactagt    720

tattttttag agctgaatta agtttaaaat ttatttcttc gttcgagcgt gcaagggtgt    780

taagcagggg ctgaggaaga gcattagtcg cgggttcgaa cgaactcagc ttaattctta   840

tatttgtatt agaaaataca taaaatatgt ataaatatct aattacgaac ataataacta   900

agataaacta tgagttcctg ataaattgaa aatctataaa caccaaatcc tagctagtct   960

ctggtgttaa ggtgtcccac atttgttgag ggatgggttg ttatatggtc ttgggcaaga  1020

gttggagtca ctcggccacc aattatctat atttggccca ttgtttccca ttaaaacaat  1080

tcctcccaag ttgatctagt tactgttctc atttataatc caagttgata ctatttgtca  1140

tgtggctggc tatacgacat tgtttttgtt tttttttgga aaatttctag gaaaccgtag  1200

ccgcttccat tcgggtgtgc atttgataac taactcactg tgcaattgct cgcaaatcac  1260

acagaagata taaatcgcat taggcacgcc cggtacgact agggggagac tactggtgag  1320

gagaatcgat ctcagatctc ccatatgata aaccactcac ccaactaact caatcaaccc  1380

cggcggcggg ygtgacttca cagtaagtct ttgtgaaggc tttctttttg tcattttctc  1440

ccttgtttag aacaagttgt tcttgcacga gaaactatta agtyatataa ataggggaga  1500

racattgttt tcctttttac agcaaaaaat tgraactcca aatagctcat caaaggatcc  1560

tactcg                                                             1566

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR寡核苷酸S2CLOFWD

<400>2

gctatcaagc tttattaaag tgtccaagct caagcc                               36

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR寡核苷酸S2CLOREV

<400>3

cgagtaggat cctttgatga gctatttgga gtttcaatt                            39

<210>4

<211>1904

<212>DNA

<213>普通烟草ATC023启动子

<400>4

cgaagacatt gtgtcgtaat cgtgtgtaat ttcactatct tccaaataaa gaaatataat     60

aattgcttct tgaatcggat gagctacacg tttttagata tttcgcaacc tgtcttcttc    120

gttagatcta ggaaacattg atttatagaa atatgtttct attatttctc tattattcat    180

tcaacatgtt aatatcgcca ccactcaaat atattgacca tgtcaattgt ttgattgaac    240

tataagtttg ataaacaatt gtcaaattta taaaaattta aaagagaaaa tacatttata    300

tgaaagaaaa gaaaagtgca aaaaagaaag aacaaaggat aaatgagagg tcgattttgt    360

ttaggaggat atggaattgc ttccaaattt agcaaagaaa cataaatgtt tttgccccta    420

taaagtcttt aaacgttatt ccaaatctgt tccaacatgt cctcttcatc cgacacattt    480

cttatcctct tctctaattt tttttgctaa aattaaatcg aaaattgaaa acgaattttt    540

gagaactatg taagatattt tttttcttcc aataacaaca aattaccaaa caactttttg    600

tcgttttgtt actaaataag tggtacaatg aaattataag tgatacaata aaatcatttg    660

acttagatat aataatattc aaattaaaat gacaacaata cacaataaaa ttatgagaat    720

tcttcgaatc atatcaaaaa ttaatttttt tttttcgata acaataaatt attaaacaac    780

tttttgtcgt aagattattt tttcctgata acaataaatt attaaataat tttcgatcgt    840

tttgttgtta gataaatgat acaatgaatt catttcaaca acttagatac aacaatattt    900

ggatcaaaat gaaaattata aacaaagtat catatatctt tgtatcatat caaaaacaag    960

atcatttttt ccgataacaa taaattatta aacaactttt tgtcgttttg ttgctagata   1020

agtgaaacaa taaaatcatt ttgacgaatt agatataaca atattaagat cacaatgaac   1080

aatagtaaac aacaaattat cagatatttt ggtattaaaa ataagattat ttttccgata   1140

ataacaaatt attaaacaat ttttttatag ttttgatgct aaataagtga tataatgaaa   1200

ttgttttgac gatttagata caataatatt aggttcaaaa tgacaatact aaacaacaaa  1260

ttatcagatc atatcaaaaa taaaattatt tttttcgata acagcaaatt attaaacaac  1320

ttttttttta ttgctagata aatgatacaa taacctcatt cgatatatat aataatattc  1380

aaatcaaaat gacaataata aacaataaat tattatattg aatcatataa aaaataagag  1440

atacatgcaa cgaataatta aacaaacaaa ttaagtaata aggcaatgga tagactaatt  1500

aatgaaacta aaactgtgga ttatctattt tgtcgtcttt cggagaatct aaacttcgac  1560

cgacttcaac gtatctaata atcctaaagt aaccttacgc tcacagttcg gttactttaa  1620

acttcgtcaa agtcattttg ataaacgtcc acatcacgaa acggtccacg tacgtctatc  1680

tcgtggataa gtctccagcc gctgtttcac atgcttatct cacagctttg ttacgataac  1740

ctagtcctat gctaatatct ttaaccatag ttaaataatt ttaaccaaac cacggttaag  1800

tgtttcaact acataagtag ctttgccggt gtattacaaa caaacaacac aaacaaaaaa  1860

aaagaactct ttcgtcgact aatgtgattt attgttcacc ggat                   1904

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR寡核苷酸AT4G29190L

<400>5

ggcaagcttc gaagacattg tgtcgtaatc g                                   31

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>PCR寡核苷酸AT4G29190R

<400>6

gcggatccgg tgaacaataa atcacattag tc                                  32

<210>7

<211>1541

<212>DNA

<213>普通烟草ATC085启动子

<400>7

tattaaagtg tccaataagt gcaagcctat tagttgaaat gtcaaaagtt ggtatcaaat     60

ttagggagtt atttatgctc ccgtttggcc agatttcggt tactattttt taagtttaat    120

ttgttttttc aagtttcaag atttatgaca gtttttgagt gatatttttc catttactca    180

caaaacttta actttttttt tcaaataaaa tacatgtaca aatacaattt taattttcaa    240

atattatttt ccaacataac ttcaaaaact cttttttcaa gtgttaatta aatatatgtt    300

taactatgta ttcatttgtg cttatgtttt atcatgcatt ttcataagtg aatttcatac    360

tcatcttcat gcaaacactt atactataaa agatatatta ttcctatata caacatgttt    420

atacgagatc attacattgt aagtgtacct tattattggt aaattttgga cttcaccaaa    480

aataattaag gaagtaatga tatgcaataa ataaataaat aaataaagtt aaaaatatta    540

tacttgactc aagacacatt atggggaaca cgtttctttc acgatccatc ttatcctttc    600

atcgatagaa gttagcaata gcattattct catattagcg gaattatggt tgtttgtctc    660

tttactatgg tcatagactc tcgagataat tcatatttca agactagtta ttttttagag    720

ctgaattaag tttaaaattt atttcttcgt tcgagcgtgc aaggggttta agcaggggct    780

gaggaagagc attagtcgcg ggttcgaacg aactcagctt aattcttata tttgtattag    840

aaaatacata aaatatgtat aaatatctaa ttacgaacat aataactaag ataaactatg    900

agttcctgat aaattgaaaa tctataaaca ccaaatccta gctagtctct ggtgttaagg    960

tgtcccacat ttgttgaggg atgggttgtt atatggtctt gggcaagagt tggagtcact   1020

cggccaccaa ttatctatat ttggcccatt gtttcccatt aaaacaattc ctcccaagtt   1080

gatctagtta ctgttctcat ttataatcca agttgatact atttgtcatg tggctggcta   1140

tacgacattg tttttgtttt ttttggaaaa tttctaggaa accgtagccg cttccattcg   1200

ggtgtgcatt tgataactaa ctcactgtgc aattgctcgc aaatcacaca gaagatataa   1260

atcgcattag gcacgcccgg tacgactagg gggagactac tggtgaggag aatcgatctc    1320

agatctccca tatgataaac cactcaccca actaactcaa tcaaccccgg cggcgggtgt    1380

gacttcacag taagtctttg tgaaggcttt ctttttgtca ttttctccct tgtttagaac    1440

aagttgttct tgcacgagaa actattaagt tatataaata ggggagaaac attgttttcc    1500

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